循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中3 種生物填料的掛膜、微生物群落組成及對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)的影響

李 倩，孫麗慧，郭建林，鄭 剛，姜建湖，陳建明，高令梅

（1.浙江省淡水水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖州市水產(chǎn)品品質(zhì)提升與加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 湖州 313001；2.浙江大學(xué) 舟山海洋研究中心，浙江 舟山 316100）

大口黑鱸（Micropterus salmoides）又名加州鱸，隸 屬 于 輻 鰭 魚 綱（Actinopterygii）、鱸 形 目（Perciformes）、太陽魚科（Cehtrachidae）、黑鱸屬（Micropterus），原產(chǎn)于美國(guó)加利福尼亞州[1]，具有生長(zhǎng)快、味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)，已成為我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖品種之一。近年來，在漁業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)和大力發(fā)展數(shù)字化智能化漁業(yè)的背景下，工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖逐漸興起，大口黑鱸養(yǎng)殖模式也從傳統(tǒng)的池塘養(yǎng)殖逐漸向綠色高效的循環(huán)水養(yǎng)殖模式轉(zhuǎn)變[2-4]。循環(huán)水養(yǎng)殖具有節(jié)水節(jié)地、養(yǎng)殖密度高、管理方便等優(yōu)點(diǎn)，通過物理、生物、化學(xué)等手段和設(shè)備，將水體中的固體懸浮物、有害物質(zhì)排出或轉(zhuǎn)化為無害物質(zhì)，使水質(zhì)滿足養(yǎng)殖對(duì)象正常生長(zhǎng)需要，從而實(shí)現(xiàn)高密度養(yǎng)殖條件下水體的循環(huán)利用，已在多個(gè)養(yǎng)殖品種中取得較好的經(jīng)濟(jì)效益[5]。

目前，大口黑鱸循環(huán)水養(yǎng)殖的研究主要圍繞生長(zhǎng)[6-7]、飼料營(yíng)養(yǎng)[8]、品系篩選[9]、精準(zhǔn)投喂[10]、水環(huán)境變化[11]、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)[12-13]等方面展開。大口黑鱸室內(nèi)工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖的研究主要圍繞大規(guī)格苗種培育展開[14]，全階段成魚養(yǎng)殖尚未大面積推廣。大口黑鱸循環(huán)水養(yǎng)殖面對(duì)的主要挑戰(zhàn)是在高密度養(yǎng)殖條件下維持良好的水環(huán)境，保證養(yǎng)殖對(duì)象的正常生長(zhǎng)。水處理是循環(huán)水養(yǎng)殖的核心，而高效水處理生物填料則是水處理系統(tǒng)的基礎(chǔ)。雖然已有較多生物填料凈化水質(zhì)的報(bào)道[15-17]，但在大口黑鱸工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖方面，特別是有效水處理生物填料的篩選、不同生物填料生物膜的微生物群落結(jié)構(gòu)、處理效果及對(duì)養(yǎng)殖對(duì)象生長(zhǎng)的影響尚未見報(bào)道。選取了3 種生物填料，其中方形海綿和流化球生物填料價(jià)格低、操作簡(jiǎn)單，已經(jīng)在養(yǎng)殖尾水處理中廣泛應(yīng)用；Mutag Biochip 30（簡(jiǎn)稱Biochip）是近幾年出現(xiàn)的新型生物填料，具有耐沖擊、使用壽命長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)，但實(shí)際應(yīng)用效果未見報(bào)道。為此，利用16S rDNA高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)3 種水處理生物填料的掛膜情況進(jìn)行分析，同時(shí)對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)情況進(jìn)行分析，以期篩選出實(shí)用的水處理生物填料，為大口黑鱸工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖提供高效的水處理填料。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)填料

本試驗(yàn)選用生物填料分別為方形海綿、Biochip和流化球，如圖1所示。方形海綿材質(zhì)為聚氨酯，外形為邊長(zhǎng)2.0 cm 的立方體，比表面積（3.2～3.5）×104m2/m3。Biochip 材質(zhì)為聚乙烯，外形為直徑3.0 cm 的圓形，厚度約0.11 cm，比表面積5.5×103m2/m3。流化球材質(zhì)為聚乙烯，有效比表面積500～800m2/m3。

圖1 供試水處理生物填料Fig.1 Experimental biological filler

1.2 試驗(yàn)分組

方形海綿生物填料處理組設(shè)為T1組，對(duì)應(yīng)的填料生物膜標(biāo)記為B1，對(duì)應(yīng)的養(yǎng)殖水體標(biāo)記為W1；Biochip 生物填料處理組設(shè)為T2 組，對(duì)應(yīng)的填料生物膜標(biāo)記為B2，對(duì)應(yīng)的養(yǎng)殖水體標(biāo)記為W2；流化球生物填料處理組設(shè)為T3組，對(duì)應(yīng)的填料生物膜標(biāo)記為B3，對(duì)應(yīng)的養(yǎng)殖水體標(biāo)記為W3。

1.3 養(yǎng)殖系統(tǒng)

試驗(yàn)在浙江省淡水水產(chǎn)研究所八里店綜合試驗(yàn)基地的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行，養(yǎng)殖缸共9只，體積500 L，有效水體350 L。生物濾池由長(zhǎng)80 cm、寬50 cm、高50 cm 的塑料水族箱構(gòu)成，體積200 L，有效水體120 L。養(yǎng)殖缸和生物濾池由水泵連接形成內(nèi)循環(huán)，流量3～4 L/min，并曝氣增氧，水體溶氧保持在5 mg/L 以上。將生物填料隨機(jī)分組，每種生物填料3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)生物濾池投放生物填料2.0 kg，同時(shí)懸掛可緩釋碳源，掛膜期間每天換水10%。初始水質(zhì)指標(biāo)：總氮（TN）9.41 mg/L，總磷（TP）1.02 mg/L，氨 氮（TAN）1.26 mg/L，亞 硝 酸 鹽 氮（NO2--N）0.04 mg/L，高錳酸鹽指數(shù)（CODMn）3.73 mg/L。

1.4 試驗(yàn)魚及養(yǎng)殖管理

以大口黑鱸為養(yǎng)殖對(duì)象，試驗(yàn)開始前在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)7 d。試驗(yàn)于2022 年8 月11 日—9月22 日進(jìn)行，為期42 d。挑選體表無傷、健康活潑的大口黑鱸進(jìn)行分組，每個(gè)養(yǎng)殖缸放養(yǎng)60 尾，每天投喂2 次，投喂時(shí)間為上午7：00 和下午16：00，日投喂量約占魚體總質(zhì)量的1.0%～1.5%，試驗(yàn)魚初體質(zhì)量為（20.46±0.46）g。

1.5 樣品采集

每2 d 采集生物濾池水樣，記錄水溫、溶氧、pH值等指標(biāo)，并測(cè)定氨氮和亞硝酸鹽氮。統(tǒng)計(jì)投喂量、試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)魚的體質(zhì)量及存活率。試驗(yàn)結(jié)束后用無菌采水袋采集每個(gè)養(yǎng)殖缸水體1 L，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后保存在-80 ℃冰箱備用。無菌方式從每個(gè)生物濾池取生物填料樣品0.5 g，保存在滅菌蒸餾水中，劇烈振蕩使生物膜表面的微生物脫落，再經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后保存在-80 ℃冰箱備用。

1.6 測(cè)定方法

1.6.1 水質(zhì)測(cè)定 水溫、溶氧和pH 值采用哈希Hq40d 便攜式水質(zhì)分析儀進(jìn)行檢測(cè)，氨氮濃度采用納氏試劑分光光度法測(cè)定[13]，亞硝酸鹽氮濃度采用鹽酸萘乙二胺分光光度法檢測(cè)[14]。

1.6.2 養(yǎng)殖性能測(cè)定 魚體的增重率、飼料系數(shù)和存活率的計(jì)算公式如下。

增重率=（魚體末體質(zhì)量－魚體初體質(zhì)量）/初體質(zhì)量×100%；

飼料系數(shù)=飼料消耗量/增質(zhì)量；

存活率=（試驗(yàn)結(jié)束后魚尾數(shù)/試驗(yàn)初始魚尾數(shù)）×100%。

1.6.3 微生物高通量測(cè)序 采用細(xì)菌DNA 提取試劑盒提取水體和生物膜上的細(xì)菌DNA（OMEGA Biotech 公司，美國(guó)），利用特異性引物338F（5′–ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′ –GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對(duì) 細(xì) 菌 16S rDNA 的V3 和V4 區(qū) 進(jìn) 行PCR 擴(kuò) 增。PCR 采 用TransGen AP221-02 反 應(yīng) 體 系：5×FastPfu 緩 沖 液4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、FastPfu聚合酶0.4 μL、5 μmol/L 上下游引物各0.8 μL、BSA 0.2 μL、DNA 模板10 ng，補(bǔ)ddH2O 至20 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃3 min；95 ℃30 s，53 ℃45 s，72 ℃1 min，28 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 擴(kuò)增在PCR 反應(yīng)儀9700（Applied Biosystems?GeneAmp?，美 國(guó)）上 進(jìn) 行。PCR 產(chǎn)物使用Beads 純化之后進(jìn)行上機(jī)測(cè)序，測(cè)序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行。

1.6.4 微生物多樣性分析 首先對(duì)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，之后對(duì)reads的質(zhì)量和拼接效果進(jìn)行質(zhì)控過濾，并校正序列方向，即為優(yōu)化數(shù)據(jù)。對(duì)最終獲得Clean 數(shù)據(jù)歸一化之后，按照97%相似性進(jìn)行OTU（Operational taxonomic units）聚類分析和物種分類學(xué)分析。樣品的柱狀圖采用Excel 繪制，熱圖繪制利用美吉生物云平臺(tái)完成。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析，利用方差分析（ANOVA）中Duncan’s 法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生物填料的掛膜時(shí)間

由圖2可知，自然掛膜條件下，生物濾池中水體氨氮含量呈快速上升后逐漸降低的趨勢(shì)，方形海綿對(duì)應(yīng)的生物濾池中水體氨氮含量在17 d 達(dá)到峰值，為8.13 mg/L，之后逐漸下降，41 d 降至最低，之后保持在0.20 mg/L 左右，表明方形海綿掛膜時(shí)間約為17 d。Biochip 和流化球?qū)?yīng)生物濾池水體中氨氮含量變化趨勢(shì)基本相同，呈波動(dòng)變化，氨氮峰值出現(xiàn) 在21 d，分 別 為7.88 mg/L 和7.57 mg/L，表 明Biochip 和流化球生物填料掛膜時(shí)間約為21 d，二者對(duì)應(yīng)的生物濾池氨氮含量分別在43 d 和45 d 降至最低。

圖2 不同生物濾池中氨氮含量變化Fig.2 The changes of TAN in different biofilters

2.2 不同養(yǎng)殖缸中水體pH值變化

從圖3 可以看出，養(yǎng)殖水體的初始pH 值為7.3，隨著養(yǎng)殖時(shí)間的延長(zhǎng)，各養(yǎng)殖缸水體的pH 值呈下降趨勢(shì)，12 d 后，所有養(yǎng)殖缸的pH 值均小于6.0，不利于養(yǎng)殖對(duì)象生長(zhǎng)。因此，掛膜12 d 后應(yīng)注意調(diào)節(jié)養(yǎng)殖缸水體的pH值。

2.3 不同生物填料上生物膜及水體中微生物群落組成分析

2.3.1 門水平微生物群落組成 由圖4 可知，在門水平，3種生物填料上生物膜的優(yōu)勢(shì)菌相同，均為變形 菌 門（Proteobacteria）、放 線 菌 門（Actinobacteriota）、擬桿菌門（Bacteroidota）、綠彎菌門（Chloroflexi）。三者相對(duì)豐度之和分別為68.96%、64.74%、65.45%。對(duì)應(yīng)的養(yǎng)殖水體中優(yōu)勢(shì)菌有所差異，W1 優(yōu)勢(shì)菌為放線菌門（Actinobacteriota），相對(duì)豐度為64.66%，W2和W3的優(yōu)勢(shì)菌為變形菌門（Proteobacteria），相對(duì)豐度分別為34.93%和50.10%。

圖4 不同生物填料上生物膜及水體中細(xì)菌群落在門水平的組成Fig.4 Community composition of bacteria in different biofilm and water at phylum level

2.3.2 科水平微生物群落組成 由圖5 可知，在3種填料生物膜上，約48%的細(xì)菌為相對(duì)豐度均小于3%的細(xì)菌群落。B1和B2的優(yōu)勢(shì)菌相同，均為黃色單胞菌科（Xanthomonadaceae），相對(duì)豐度分別為11.64%和9.16%；B3 的優(yōu)勢(shì)菌為JG30-KF-CM45，相對(duì)豐度為10.54%。養(yǎng)殖水體中的優(yōu)勢(shì)菌和生物填料不同，微桿菌科（Microbacteriaceae）為W1 的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌，相對(duì)豐度為62.10%；W2的優(yōu)勢(shì)菌除微桿菌科（13.82%）外，還包含一定比例的根瘤菌科（Rhizobiales）（8.57%）；W3的優(yōu)勢(shì)菌為根瘤菌科，相對(duì) 豐 度 為 38.94%，其 次 為 黃 桿 菌 科（Flavobacteriaceae），相對(duì)豐度為15.89%。

圖5 不同生物填料上生物膜及水體中細(xì)菌群落在科水平的組成Fig.5 Community composition of bacteria in different biofilm and water at family level

統(tǒng)計(jì)屬水平排名前50 的物種，數(shù)值經(jīng)處理后，通過色塊顏色梯度來展示樣本中不同物種的豐度變化情況，結(jié)果如圖6所示。雷夫松氏菌（Leifsonia）是W1 的優(yōu)勢(shì)菌，相對(duì)豐度為56.16%；W2 的優(yōu)勢(shì)菌為雷夫松氏菌（10.30%）、根瘤菌科Incertae_sedis（8.47%）；W3 的優(yōu)勢(shì)菌為根瘤菌科Incertae_sedis，相對(duì)豐度為38.92%。生物膜可鑒別的細(xì)菌中，熱單胞菌屬（Thermomonas）是B1 的優(yōu)勢(shì)菌，相對(duì)豐度為4.71%；B2 和B3 的優(yōu)勢(shì)菌為硝化螺旋菌屬（Nitrospira），相對(duì)豐度分別為4.41%、2.70%。

2.4 不同生物填料上生物膜和水體中微生物群落的α-多樣性分析

由表1 可知，不同填料上生物膜微生物群落的香農(nóng)指數(shù)大于對(duì)應(yīng)的養(yǎng)殖水體，辛普森指數(shù)則相反。分析對(duì)應(yīng)的養(yǎng)殖水體，W2 的細(xì)菌群落香農(nóng)指數(shù)最高，顯著高于W1 和W3，辛普森指數(shù)則顯著低于W1 和W3，表明其α-多樣性最高。與養(yǎng)殖水體的α-多樣性不同，雖然B2 填料中細(xì)菌微生物群落的香農(nóng)指數(shù)最大、辛普森指數(shù)最小，但3種生物填料之間無顯著差異。所有樣本的測(cè)序覆蓋率在0.990以上，表明測(cè)序深度可以反映樣本的真實(shí)水平。

表1 不同生物填料上生物膜及養(yǎng)殖水體的微生物多樣性指數(shù)Tab.1 The microbial diversity index in different biofilm and water samples

2.5 不同生物填料對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)的影響

質(zhì)量和增重率顯著高于流化球和Biochip組，飼料系數(shù)顯著低于組。各組大口黑鱸的存活率均在97%以上，各組間無顯著差異。

3 結(jié)論與討論

3.1 不同生物填料的掛膜時(shí)間

生物膜附著于生物填料表面，生物填料的材質(zhì)、結(jié)構(gòu)和比表面積是影響生物膜形成的主要因素[18-20]。生物膜培養(yǎng)有2種常用方法，自然掛膜法和接種掛膜法，不同掛膜方法影響生物膜的成熟時(shí)間。胡小兵等[21]采用4 種不同的方法進(jìn)行掛膜，結(jié)果表明，采用添加殼聚糖、鐵離子、接種排泥法掛膜時(shí)，生物膜的成熟時(shí)間較自然掛膜法短。雖然添加有益微生物或活性物質(zhì)可以縮短掛膜時(shí)間，但是存在接種物質(zhì)獲取困難、工藝構(gòu)建復(fù)雜、成本高等問題[22]。管敏等[23]在低有機(jī)物含量條件下，直接采用原水進(jìn)行掛膜，經(jīng)過約38 d 生物濾池自然掛膜啟動(dòng)成功，這一研究結(jié)果與本研究結(jié)果相似。本研究結(jié)果表明，在相同的掛膜條件下，方形海綿的掛膜時(shí)間少于其他2 種生物填料，這可能與方形海綿比表面積大、親水性強(qiáng)、易于生物膜附著有關(guān)。方形海綿的比表面積高達(dá)32 000～35 000 m2/m3，遠(yuǎn)大于其他2種填料。此外，方形海綿的材質(zhì)為聚氨酯，遇水膨脹，親水性高，有利于水體中微生物的附著和生長(zhǎng)。黎鏞等[24]的研究結(jié)果也表明，聚氨酯海綿的啟動(dòng)性能和氨氮去除性能優(yōu)于聚丙烯，與本研究結(jié)果一致。另外，本研究中，Biochip 生物填料的比表面積高達(dá)5 500 m2/m3，遠(yuǎn)大于流化球生物填料，但掛膜時(shí)間和流化球填料基本相同，這可能和孔隙大小有關(guān)。有研究指出，生物填料內(nèi)部空間尺度會(huì)影響生物膜的生長(zhǎng)[24]。有的生物填料盡管比表面積大，但孔隙細(xì)小，孔徑遠(yuǎn)小于成熟生物膜厚度，容易導(dǎo)致孔隙堵塞，從而孔隙中的生物膜量難以達(dá)到最大積累[25]。Biochip 孔隙較小，導(dǎo)致其生物膜生長(zhǎng)較慢，掛膜時(shí)間較長(zhǎng)。

3.2 生物填料及養(yǎng)殖水體的微生物群落組成

本研究中，生物填料和對(duì)應(yīng)養(yǎng)殖水體中的優(yōu)勢(shì)菌不同，生物填料上生物膜的香農(nóng)指數(shù)大于對(duì)應(yīng)養(yǎng)殖水體，說明生物填料具有富集微生物的作用，這與胡高宇等[26]的研究結(jié)果一致。影響微生物群落結(jié)構(gòu)的因素眾多，如載體類型[27]、濾池深度[28]、鹽度[29]、有機(jī)物濃度[30]等。同一種生物填料，在不同養(yǎng)殖條件下，生物膜上的微生物群落也不相同。筆者曾對(duì)流化球生物填料在羅氏沼蝦循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中的掛膜情況進(jìn)行研究，結(jié)果表明，其生物膜上的優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門（Firmicutes）[31]，而本研究中流化球生物膜上的優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門（Proteobacteria），造成這種差異的主要原因可能是養(yǎng)殖環(huán)境不同。本研究采用的3 種生物填料，培養(yǎng)生物膜的初始條件相同，可能由于填料的物理特性不同，形成的生物膜厚度和內(nèi)環(huán)境也不同，造成了微生物群落的差異，因此，載體不同是造成微生物群落差異的主要原因。此外，養(yǎng)殖過程中水環(huán)境與微生物群落之間相互影響，微生物群落差異的原因可能和環(huán)境因子有關(guān)。如袁翠霖[32]的研究表明，pH 值能顯著影響水體異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)；范廷玉等[33]認(rèn)為，總氮含量在內(nèi)河河段的水生細(xì)菌群落分布中起關(guān)鍵作用，氨氮、總磷以及葉綠素a也在不同程度上影響著水體中的細(xì)菌群落組成。本研究中造成微生物群落組成差異的環(huán)境因子仍需進(jìn)一步確認(rèn)。

3.3 不同生物填料對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)的影響

從生長(zhǎng)結(jié)果看，方形海綿組大口黑鱸生長(zhǎng)最快，增重率顯著高于其他2 種填料，且飼料系數(shù)最低。這與前人[34-35]研究結(jié)果一致。本研究中，邊掛膜邊養(yǎng)殖，從掛膜時(shí)間來看，方形海綿生物膜較早成熟，且生物膜成熟后水體中的氨氮和亞硝酸鹽氮濃度一直低于其他2 種填料。另外，方形海綿具有一定的過濾能力，養(yǎng)殖水體中固體懸浮物的含量較低，水體較為清澈，方形海綿組大口黑鱸生長(zhǎng)較好可能與良好的水質(zhì)有關(guān)，但方形海綿填料對(duì)水體總氮、總磷和高錳酸鹽指數(shù)的凈化效果有待進(jìn)一步研究。值得注意的是，在試驗(yàn)過程中，pH 值整體呈下降趨勢(shì)，養(yǎng)殖12 d 后，所有養(yǎng)殖缸的pH 值均小于6.0，與張龍等[28]的研究結(jié)果一致。pH 值降低是因?yàn)榕囵B(yǎng)生物膜的過程中，有大量氫離子產(chǎn)生，導(dǎo)致水體pH 值下降。因此，掛膜過程中要及時(shí)調(diào)節(jié)養(yǎng)殖缸水體的pH 值，保證其在養(yǎng)殖對(duì)象正常生長(zhǎng)范圍內(nèi)。從經(jīng)濟(jì)成本考慮，方形海綿市場(chǎng)價(jià)在70～100元/kg，成本介于其他2 種生物填料之間，結(jié)合生長(zhǎng)結(jié)果，短期內(nèi)方形海綿是一種較為實(shí)用的循環(huán)水養(yǎng)殖水處理生物填料，但方形海綿韌性較差，使用壽命較短，長(zhǎng)期的使用效果和養(yǎng)殖效果有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上，在自然掛膜條件下，方形海綿生物填料的掛膜時(shí)間最短，價(jià)格適中，且方形海綿組大口黑鱸的末體質(zhì)量和增重率顯著高于其他2 種生物填料，短期內(nèi)是一種較為實(shí)用的循環(huán)水水處理生物填料。

致謝：浙江大學(xué)舟山海洋研究中心鄭剛老師為本研究提供了可緩釋碳源，特此致謝。