倉儲片煙中優(yōu)勢霉菌的分離鑒定及其霉變揮發(fā)性代謝產(chǎn)物研究

王 林，王宇棟，朱 寶，李 虎，周紅審，王凱悅，閆鐵軍，周 平，夏 海，周 敏，4

（1.湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)中心，湖北 武漢 430048；2.武漢輕工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；3.武漢輕工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430023；4.湖北省生鮮食品工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430023）

煙葉在制絲與卷包之前需要在一定條件下進(jìn)行自然醇化，這一過程通常持續(xù)12～30 個月[1-2]。煙葉中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、葡萄糖、有機(jī)酸[3-4]、煙堿等[5-6]，為煙葉本身帶有的真菌孢子提供了生存條件。片煙在醇化過程中，受環(huán)境濕度的影響，煙葉容易吸潮，從而導(dǎo)致發(fā)霉[7]。煙葉發(fā)霉后其內(nèi)含物分解，使煙葉的色、香、味等感官質(zhì)量下降，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失[8-9]。

目前，煙葉中霉菌檢測方法的相關(guān)研究已取得了一定的進(jìn)展。芯片級非對稱離子遷移譜技術(shù)可以根據(jù)霉變特征物質(zhì)吡啶和1-戊醇的離子電流值大小來進(jìn)行霉變煙葉的無損快速鑒別[10]。楊蕾[11]對正常及霉變煙葉進(jìn)行了近紅外光譜掃描，利用優(yōu)劣比值法（GBA）提取了4 個特征波長，并建立了霉變情況的監(jiān)測模型。上述方法的樣品前處理過程比較復(fù)雜，對操作人員的要求較高。

氣相色譜離子遷移譜聯(lián)用儀（Gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）具有響應(yīng)快速、靈敏度高和檢測周期短等優(yōu)勢，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于包括糧油、果蔬、水產(chǎn)品等在內(nèi)的農(nóng)產(chǎn)品的研究中，涵蓋食品成分分析、產(chǎn)地溯源、摻假檢測等方面[12]。黎家奇等[13]采用GC-IMS 對花生中黃曲霉侵染過程的揮發(fā)性有機(jī)化合物進(jìn)行分析，通過揮發(fā)性物質(zhì)的指紋圖譜分析侵染過程中各階段揮發(fā)性物質(zhì)的變化規(guī)律和相對含量的變化，得到花生早期霉變的潛在生物標(biāo)志物。田楠等[14]通過頂空氣相色譜-離子遷移譜技術(shù)分析不同品牌卷煙之間揮發(fā)性物質(zhì)的差異，并以此區(qū)分不同品牌卷煙，為不同品牌卷煙的風(fēng)格分析和品質(zhì)評定提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

目前，缺少一種簡單明了的方式快速判別倉儲片煙是否霉變或者是否有發(fā)霉的趨勢，導(dǎo)致不能及時(shí)做出處理以減少相應(yīng)的損失。為此，以霉變片煙為研究對象，分離純化優(yōu)勢霉菌，通過GC-IMS 檢測結(jié)合聚類分析比較霉變與未發(fā)生霉變的片煙中揮發(fā)性組分的差異，識別出霉變特有揮發(fā)性物質(zhì)，旨在為實(shí)現(xiàn)倉儲煙葉霉菌的實(shí)時(shí)監(jiān)控、提高煙葉品質(zhì)和安全性奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 片煙樣品 按照5 點(diǎn)3 層法，從武漢樂道煙葉倉庫中抽取產(chǎn)地為湖南的片煙，每個樣品采集點(diǎn)的采集量至少為500 g，采集到的樣品4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑 霉菌的分離培養(yǎng)利用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基、馬丁氏培養(yǎng)基和查氏培養(yǎng)基［15］。霉菌的液體培養(yǎng)利用馬鈴薯葡萄糖液體（PDB）培養(yǎng)基。DNA 的提取及18S rDNA 的鑒定利用TaKaRa 的真菌DNA 提取試劑盒和DNA 回收試劑盒。

1.2 儀器與設(shè)備

霉菌的分離、純化、初步鑒定利用無菌操作臺（SW-CJ-2FD）、恒溫振蕩培養(yǎng)箱（DDHZ-300）、恒溫恒濕培養(yǎng)箱（HWS-150）和無菌均質(zhì)機(jī)（HBW-400D）。18S rDNA 鑒 定 利 用 電 泳 儀（BIO-RAD PowerPac）、凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD MP）、紫外分析儀（UVG20）及PCR 儀（BIO-RAD T100）。片煙揮發(fā)性化合物的測定利用FlavourSpec 氣相色譜離子遷移譜聯(lián)用儀（德國G.A.S公司）。

1.3 方法

1.3.1 霉菌的分離、純化和初步鑒定

1.3.1.1 分離 稱取1 g 霉變煙葉[16]，在無菌水中將孢子洗脫，配成孢子懸浮液，將霉菌孢子懸液進(jìn)行適當(dāng)梯度稀釋，采用倒置平板法檢測孢子，28 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d。然后挑選形態(tài)各異、長勢良好的單個菌落進(jìn)行劃線分離，重復(fù)2～3 次。篩選用馬丁氏培養(yǎng)基，分離培養(yǎng)用查氏培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基。

1.3.1.2 純化 用無菌槍頭挑取在PDA 培養(yǎng)基平板上的單菌落，并在新的PDA 培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)，重復(fù)3 次。挑取多次純化后的單菌落于PDB 培養(yǎng)基中，在（28±1）℃、150 r/min下?lián)u床培養(yǎng)10～12 h。

1.3.1.3 形態(tài)學(xué)鑒定 參考GB 4789.16—2016《常見產(chǎn)毒霉菌的形態(tài)學(xué)鑒定》[17]綜合觀察菌落和鏡檢特征，反復(fù)比對結(jié)果，對霉菌進(jìn)行鑒定。

1.3.2 霉菌DNA提取與18S rDNA鑒定

1.3.2.1 霉菌DNA 的提取 將分離純化的霉菌保存于-80 ℃冰箱中，液體培養(yǎng)后離心獲得菌絲等沉淀。在研缽中加入液氮和菌絲沉淀物進(jìn)行研磨來破除真菌的細(xì)胞壁[18]，將研磨后的菌絲及沉淀物采用真菌DNA提取試劑盒提取其總DNA。

1.3.2.2 18S rDNA 的擴(kuò)增 參考李再新等[19]的方法擴(kuò)增霉菌18S rDNA 的序列。根據(jù)GenBank 上公布的霉菌18S rDNA 序列，采用DNAMAN 分析軟件設(shè)計(jì) 引 物，F(xiàn)：5′-GAACCTGCGGAAGGATCA-3′ ；R：5′-TGATACTGAAGCAGGCGT-3′。以霉菌的基因組DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增霉菌18S rDNA，目的片段長度為400 bp 左右。取1 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，利用紫外凝膠成像系統(tǒng)檢測目的基因擴(kuò)增情況。

1.3.2.3 18S rDNA 的序列分析 通過瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)在400 bp 處出現(xiàn)目的條帶，在紫外分析儀下切下包含目的片段的瓊脂糖凝膠，利用DNA回收試劑盒回收DNA 片段。將純化產(chǎn)物送往武漢擎科有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果利用NCBI 的GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。

1.3.3 米根霉的致霉性測定 參考向東紅[15]的方法進(jìn)行致霉性測定，取0.2 mL 制備好的米根霉孢子懸液，接種到經(jīng)濕熱滅菌的片煙上（1.0 g），使煙葉中的孢子濃度達(dá)到1.0×104cfu/mL，對照組（CK）接種等體積的0.85%的無菌生理鹽水。將樣品放置于28 ℃的恒溫恒濕箱中培養(yǎng)，觀察霉菌對煙葉有無致霉性。

1.3.4 片煙的人工污染和霉菌數(shù)量的變化分析片煙樣品經(jīng)濕熱滅菌處理后，裝入頂空瓶中，將片煙水分調(diào)整到13%左右，接種500 μL米根霉孢子懸液于0.25 g 煙葉上，使煙葉中的孢子濃度達(dá)到1.0×104cfu/mL，對照組接種等體積的0.85%的無菌生理鹽水。裝煙葉樣品的頂空瓶用無菌棉花封口，避免雜菌污染的同時(shí)保持空氣流通[15]。隨后，將樣品分別放置在25、30、35 ℃，相對濕度70%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 d。每隔3 d 取一次煙葉樣品，測定霉菌數(shù)量。米根霉侵染0、9、18 d 的樣品分別標(biāo)記為P0、P1、P2。

1.3.5 片煙揮發(fā)性化合物的GC-IMS 測定 在上述35 ℃、相對濕度70%的恒溫恒濕培養(yǎng)條件下，0、9、18 d時(shí)取煙葉樣品進(jìn)行GC-IMS檢測。

1.3.5.1 GC-IMS 檢測樣品 取經(jīng)米根霉人工污染的試驗(yàn)組煙葉和對照組煙葉，經(jīng)頂空進(jìn)樣，用GCIMS聯(lián)用儀進(jìn)行測試。

1.3.5.2 頂空進(jìn)樣條件 孵化溫度90 ℃，孵化時(shí)間10 min，進(jìn)樣方式為頂空進(jìn)樣，加熱方式為振蕩加熱，進(jìn)樣針溫度85 ℃。

1.3.5.3 GC-IMS 條件 色譜柱溫度60 ℃；載氣為高純度N2，載氣流速：初始流速2.0 mL/min，保持2 min，8 min 內(nèi)線性升至10 mL/min，10 min 內(nèi)線性升至100 mL/min，5 min 內(nèi)線性升至150 mL/min，保持2 min，總運(yùn)行時(shí)間27 min；漂移管溫度45 ℃，漂移氣為高純度N2，漂移氣流速150 mL/min。

利用GC-IMS 技術(shù)進(jìn)行霉變煙葉特殊揮發(fā)性物質(zhì)檢測，并對不同處理的煙葉中揮發(fā)性化合物進(jìn)行分析和鑒別[20]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用軟件LAV 和GC-IMS Library Search 對樣品進(jìn)行分析。使用LAV 分析軟件中Reporter、Gallery 和Dynamic PCA 插件程序以及GC-IMS Library Search 構(gòu)建揮發(fā)性有機(jī)物的指紋圖譜。使用R 軟件包pheatmap 程序構(gòu)建熱圖，進(jìn)行樣本聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 片煙中霉菌的分離純化以及優(yōu)勢霉菌的鑒定

對產(chǎn)地湖南的片煙樣品進(jìn)行了霉菌的分離純化，根據(jù)GB 4789.16—2016《常見產(chǎn)毒霉菌的形態(tài)學(xué)鑒定》[17]的判定標(biāo)準(zhǔn)以及18S rDNA 的測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)煙葉樣品中根霉數(shù)量最多（73.8%），其次是曲霉（6.0%）和毛霉（5.5%），青霉較少（1.7%）。對根霉進(jìn)一步鑒定表明，湖南片煙中出現(xiàn)頻率最高的根霉菌株與GenBank 基因庫中米根霉18S rDNA 序列（MT279283.1）間的覆蓋率為95.0%，同源性為99.73%，確定其屬于米根霉，其次為代氏根霉和葡枝根霉。

2.2 米根霉致霉性測定結(jié)果

將米根霉孢子懸液接種到濕熱滅菌的湖南片煙上，對照組接種等體積的0.85%的無菌生理鹽水，于28 ℃培養(yǎng)并觀察菌落生長情況，來判斷米根霉的致霉性。結(jié)果顯示，對照組煙葉未出現(xiàn)霉菌菌落，接種米根霉孢子懸液的煙葉生長情況如圖1 所示，菌落直徑為3 cm。

圖1 接種米根霉后的煙葉生長情況Fig.1 Tobacco inoculated with Rhizopus oryzae

2.3 人工污染片煙中霉菌數(shù)量的變化

將湖南片煙樣品放入頂空進(jìn)樣瓶，經(jīng)濕熱滅菌后進(jìn)行米根霉的人工污染，分別放置在25 ℃、30 ℃和35 ℃，相對濕度70%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。如圖2 所示，在25 ℃和30 ℃的煙葉上沒有出現(xiàn)霉斑，且煙葉中的霉菌數(shù)量至18 d 時(shí)一直維持在1.0×104cfu/mL 以下。35 ℃培養(yǎng)條件下，煙葉中的霉菌數(shù)量在9 d 以內(nèi)沒有太大變化，一直維持在1.0×104cfu/mL 以下。10～18 d，煙葉中的霉菌數(shù)量緩慢上升，在18 d 超過5.0×104cfu/mL，達(dá)到輕度霉變。整個過程中，煙葉中的霉菌數(shù)量一直都在1.0×105cfu/mL以下。

圖2 不同儲存溫度下片煙中霉菌數(shù)量隨時(shí)間的變化Fig.2 Changes of the number of mold in tobacco under different storage temperatures

2.4 米根霉侵染不同階段煙葉樣品中揮發(fā)性成分的差異

在35 ℃、相對濕度70%條件下的人工污染試驗(yàn)中，培養(yǎng)0、9、18 d 時(shí)，取煙葉樣品進(jìn)行GC-IMS 檢測。對照組（接種同體積生理鹽水）經(jīng)18 d 無霉變現(xiàn)象，試驗(yàn)組P1（9 d）樣品未出現(xiàn)明顯霉變現(xiàn)象，試驗(yàn)組P2（18 d）樣品出現(xiàn)輕度霉變現(xiàn)象。經(jīng)頂空進(jìn)樣，用GC-IMS 聯(lián)用儀進(jìn)行測試，結(jié)果如圖3 所示。反應(yīng)離子峰（Reaction ion peak，RIP）兩側(cè)的每個點(diǎn)代表從片煙中提取的揮發(fā)性化合物，通過顏色的深淺來判斷物質(zhì)的含量。大多數(shù)揮發(fā)性物質(zhì)在米根霉侵染過程中的遷移時(shí)間在1.0～1.9 s，保留時(shí)間在200～1 000 s。相比于P0（0 d），煙葉樣品P1、P2在米根霉侵染過程中的揮發(fā)性化合物具有較大的差異，主要表現(xiàn)在離子峰的位置、數(shù)量及強(qiáng)度上。通過GC-IMS 的Library Search 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)比對，共識別出42種揮發(fā)性化合物（表1）。

表1 米根霉侵染階段揮發(fā)性化合物的鑒定Tab.1 Identification of volatile compounds in the infection stage of Rhizopus oryzae

圖3 米根霉侵染不同階段的煙葉樣品GC-IMS圖譜Fig.3 GC-IMS spectra of tobacco leaves samples infected by Rhizopus oryzae at different stages

為進(jìn)一步比較煙葉樣品中揮發(fā)性物質(zhì)的差異，采用LAV 軟件，選取圖3 中分析區(qū)域，自動生成指紋圖譜（圖4）。結(jié)果顯示，a 區(qū)域P0 煙葉樣品中1-辛烯-3-酮、3-辛酮、3-乙基-苯丙酸、2-呋喃甲硫醇、松油醇、戊酸、正辛醇、蒎烯的信號強(qiáng)度較高，其中2-呋喃甲硫醇是存在于烤煙煙葉中的棕色化反應(yīng)產(chǎn)物[21]。這8 種化合物在米根霉侵染階段（P1、P2）含量明顯降低，可見霉變導(dǎo)致了煙葉本身具有的色、香、味的流失；b 區(qū)域庚2 酮、蒎烯為發(fā)霉過程的中期過渡揮發(fā)性物質(zhì)；c區(qū)域順式-3-己烯-1-醇、丁酸甲酯、2-戊酮、乙基丙酸、戊酸乙酯、苯乙醛、苯乙烯、2，4，5-三甲基噻唑、反式-2，4-庚二烯醛、2，6-二甲基吡嗪、3-戊酮含量高于P0，其中順式-3-己烯-1-醇、丁酸甲酯、2-戊酮、乙基丙酸這4 種化合物含量明顯升高。

圖4 煙葉樣品中揮發(fā)性化合物的指紋圖譜Fig.4 Fingerprint of volatile compounds in tobacco samples

通過對揮發(fā)性化合物進(jìn)行熱圖聚類分析，可以更加直觀地比較不同處理樣品之間的異同，結(jié)果如圖5 所示。其中b、c 區(qū)域的揮發(fā)性物質(zhì)主要存在于P0 樣品中，e 區(qū)域的揮發(fā)性物質(zhì)主要存在于中期階段P1 樣品中，a、d、f 區(qū)域中的揮發(fā)性物質(zhì)主要存在于P1 和P2 中。P0 中1-辛烯-3-酮、3-辛酮、3-乙基-苯丙酸、2-呋喃甲硫醇等的信號強(qiáng)度高于米根霉侵染的P1，說明煙葉中本來具有的一些揮發(fā)性物質(zhì)隨著霉變過程的進(jìn)行而減少。隨著米根霉侵染的時(shí)間延長，煙葉樣品中順式-3-己烯-1-醇、戊酸乙酯、苯乙醛、苯乙烯、2，4，5-三甲基噻唑、反式-2，4-庚二烯醛等揮發(fā)性物質(zhì)含量逐漸增大。a、d、f區(qū)域11 類化合物可以作為霉變預(yù)警的重要特征性物質(zhì)。

3 結(jié)論與討論

已有研究表明，片煙在儲存期間表面存在大量的微生物，張成省等[22]研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)地為河南、福建、山東、四川、云南等地的片煙主要霉菌類群為黃柄曲霉、黑曲霉、黃曲霉、桔青霉、純綠青霉、產(chǎn)黃青霉、總狀毛霉、匍枝根霉，以曲霉、青霉檢出率較高；劉強(qiáng)[23]從云南、貴州等產(chǎn)地的煙葉中分離到的主要霉變菌株為米曲霉、黑曲霉、黃曲霉、葡枝根霉、總狀毛霉、桔青霉、擴(kuò)展青霉；宋嘉寶等[24]研究發(fā)現(xiàn)，引起海南雪茄煙葉霉變的微生物主要為籃狀菌屬、帚霉屬和曲霉屬。本研究中，產(chǎn)地湖南的片煙中根霉檢出率最高，其次為曲霉，在根霉中米根霉檢出率最高，表明受地理、環(huán)境的影響各地?zé)熑~中優(yōu)勢種群不盡相同。

霉菌侵染煙葉的過程中，會消耗煙葉中自身的營養(yǎng)物質(zhì)，代謝出其他多種有機(jī)化合物，從而對煙葉的品質(zhì)造成影響。楊蕾[11]在煙葉霉變預(yù)測研究中發(fā)現(xiàn)，由曲霉和青霉引起發(fā)霉的煙葉中新產(chǎn)生的7種化合物有丁醇、2-甲基-丁醇、戊醇、己醇等，含量變化程度較大的11種化合物有棕櫚酸乙酯、棕櫚酸甲酯、3-甲基-丁醇、4-甲基苯酚等。本研究利用GC-IMS 結(jié)合指紋圖譜分析，發(fā)現(xiàn)受米根霉污染的倉儲片煙中揮發(fā)性有機(jī)化合物的成分、含量存在差異，識別出霉變煙葉中11 種特征揮發(fā)性化合物，其中順式-3-己烯-1-醇、丁酸甲酯、2-戊酮、乙基丙酸的含量在煙葉發(fā)生輕度霉變時(shí)明顯升高，這4 種揮發(fā)性化合物可作為煙葉輕度霉變的潛在標(biāo)識分子。

綜上，在米根霉不同的侵染階段，片煙樣品中的揮發(fā)性化合物組成和含量差異顯著，霉變早期的特征性氣體可作為潛在的檢測靶點(diǎn)。本研究為倉儲片煙早期霉菌污染的氣體監(jiān)測傳感器研制提供了一定的數(shù)據(jù)支撐，為片煙霉變預(yù)警監(jiān)測提供了新思路。