鏈格孢毒素化學(xué)結(jié)構(gòu)、毒性效應(yīng)和檢測(cè)方法研究進(jìn)展

王 冉，李欲軻，乙 引，唐 明

（1.貴州師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州師范大學(xué) 西南喀斯特山地生物多樣性保護(hù)國家林草局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；3.貴州師范大學(xué) 貴州省植物生理與發(fā)育調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025）

鏈格孢（Alternariasp.）是自然界中普遍存在的真菌，包括腐生菌、內(nèi)生菌[1]。鏈格孢目前已被報(bào)道300 多個(gè)種，如互隔鏈格孢（Alternaria alternata）、細(xì)極 鏈 格 孢（Alternaria tenuissima）、樹 棲 鏈 格 孢（Alternaria arborescense）、蕓 薹 鏈 格 孢（Alternaria brassicicola）和茄鏈格孢（Alternaria solani）等，由于鏈格孢寄主范圍大（在世界范圍內(nèi)分布），危害多種谷物、蔬菜、水果和經(jīng)濟(jì)作物（如小麥、大豆、番茄、柑橘、梨、油葵、煙草等），造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2-8]。另外，鏈格孢還會(huì)引起收獲后的谷物發(fā)生病害，從而引起人類過敏性鼻炎和特應(yīng)性哮喘[9-11]。

鏈格孢毒素（Alternariatoxin）是鏈格孢真菌致病種產(chǎn)生的具有不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的小分子次級(jí)代謝產(chǎn)物，目前已經(jīng)鑒定出70 多種，這些毒素通常表現(xiàn)出多種生物活性，如植物毒性、遺傳毒性、細(xì)胞毒性和抗菌特性等[12-13]。鏈格孢毒素是鏈格孢重要的致病因子，對(duì)葉綠體、線粒體、質(zhì)膜、細(xì)胞核、高爾基體等多種細(xì)胞器有負(fù)面影響[14]。鏈格孢毒素可以通過細(xì)胞膜、葉綠體和線粒體功能障礙等方式影響細(xì)胞正常生長代謝過程[15-17]；通過抑制與脫氧核糖核酸（DNA）超螺旋調(diào)節(jié)有關(guān)的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ和Ⅱ的活性，參與細(xì)胞的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和修復(fù)等過程[18]；在核糖體水平上抑制蛋白質(zhì)的生物合成[19]，最終導(dǎo)致植物患病甚至死亡。

根據(jù)鏈格孢毒素對(duì)宿主作用的特異性差異，可將鏈格孢毒素分為宿主特異性毒素（Host-specific toxin，HST）和宿主非特異性毒素（Non-host-specific toxin，nHST）[20]。HST 能夠在植物病原體特異性的宿主范圍起作用，只有宿主的特定基因型對(duì)毒素敏感，因此，僅對(duì)宿主有毒，而對(duì)大多數(shù)其他植物無害。nHST 可以影響包括產(chǎn)生毒素病原體的宿主和非宿主在內(nèi)的許多植物。大多數(shù)HST 被認(rèn)為是鏈格孢入侵組織和致病所需的致病因子，導(dǎo)致發(fā)病加重和病原體增殖[21]。

鏈格孢毒素的毒性作用尚未被系統(tǒng)闡明。目前，關(guān)于鏈格孢毒素的綜述主要聚焦于鏈格孢毒素合成相關(guān)基因、致病機(jī)制等，關(guān)于鏈格孢毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)、毒性效應(yīng)等方面報(bào)道較少。鑒于此，擬綜述多種重要的鏈格孢毒素化學(xué)結(jié)構(gòu)、毒性效應(yīng)、靶向位點(diǎn)以及檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展，以期為毒素結(jié)構(gòu)改造和檢測(cè)方法開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 鏈格孢宿主特異性毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)和毒性效應(yīng)

1.1 鏈格孢宿主特異性毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)

不同鏈格孢特異性毒素在寄主植物致病過程中具有不同的作用方式、生化反應(yīng)和信號(hào)機(jī)制[20]。鏈格孢HST根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)不同可分為7類：（1）環(huán)氧癸三烯酸類（AK-toxin、AF-toxin 和ACT-toxin）；（2）鞘 氨 醇 類 似 物 類（AAL-toxin）；（3）吡 喃 酮 類（ACR-toxin）；（4）環(huán)肽類（AM-toxin、Destruxin B 和HC-toxin）；（5）四肽類（AS-I toxin）；（6）核糖體肽類（ABR-toxin）；（7）二酮哌嗪類（Maculosin）。其化學(xué)結(jié)構(gòu)、化學(xué)式和靶向位點(diǎn)如表1所示。

續(xù)表1 鏈格孢產(chǎn)生的宿主特異性毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)、化學(xué)式和靶向位點(diǎn)Tab.1（Continued）Chemical structure，chemical formula，and target site of host-specific toxins produced by Alternaria

1.2 鏈格孢宿主特異性毒素的毒性效應(yīng)

AK-toxin、AF-toxin 和ACT-toxin 屬于環(huán)氧癸三烯酸類毒素。研究表明，AK-toxin 是從日本梨黑斑病發(fā)現(xiàn)的鏈格孢毒素[23]，能夠造成易感宿主質(zhì)膜的破壞，引起鉀離子（K+）外流，導(dǎo)致未成熟果實(shí)脫落。AF-toxin 是從草莓黑斑病發(fā)現(xiàn)的鏈格孢毒素[24]，會(huì)引起細(xì)胞質(zhì)膜上的鉀離子（K+）滲漏，還影響質(zhì)膜氫離子轉(zhuǎn)位ATP 酶（H+-ATP 酶）的功能[17]。ACT-toxin是從柑橘褐斑病發(fā)現(xiàn)的鏈格孢毒素[25]，被確定是柑橘類植物的主要宿主特異性毒素，對(duì)柑橘類植物具有極強(qiáng)的致病性，會(huì)在橘子的嫩葉、樹枝和果實(shí)上造成褐色或黑色斑點(diǎn)，也可以通過葉脈傳播并導(dǎo)致更嚴(yán)重的損傷[14]。AF-toxin、AK-toxin 和ACT-toxin的毒性效應(yīng)相似，靶向位點(diǎn)都是質(zhì)膜，能夠引起膜內(nèi)陷、泡狀形成、碎裂和去極化，導(dǎo)致膜電位梯度降低，誘導(dǎo)易感細(xì)胞壞死，增加易感細(xì)胞區(qū)室質(zhì)膜上的K+流出，造成鉀滲漏，引起高爾基體囊泡與受損的質(zhì)膜融合[26]。

AAL-toxin屬于鞘氨醇類似物類毒素，最早發(fā)現(xiàn)于番茄，是番茄鏈格孢致病菌引起番茄莖部潰瘍病產(chǎn)生的毒素[27]。AAL-toxin 是鞘氨醇霉菌毒素（SAMT）的類似物，SAMT 誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡（PCD）的潛在機(jī)制與神經(jīng)酰胺合酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制有關(guān)，AAL-toxin 能夠抑制二氫鞘氨醇、植物鞘氨醇和其他游離鞘氨醇?jí)A基轉(zhuǎn)化為神經(jīng)酰胺的過程，游離鞘氨醇?jí)A基的積累會(huì)激活PCD 轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，最終造成細(xì)胞程序性死亡[28]。

ACR-toxin屬于吡喃酮類毒素，最早發(fā)現(xiàn)于患葉斑病的粗檸檬[29]，會(huì)造成線粒體中嵴和囊泡的破壞，并在膜上形成孔洞[30]。ACR-toxin 還會(huì)引起線粒體氧化磷酸化與線粒體電子傳遞鏈的解偶聯(lián)和膜電位的喪失，使煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）從三羧酸循環(huán)（TCA）中退出[31]。

AM-toxin、Destruxin B 和HC-toxin 屬于環(huán)肽類毒素。AM-toxin 是從蘋果葉斑病發(fā)現(xiàn)的鏈格孢毒素[32]。AM-toxin 有質(zhì)膜和葉綠體2 個(gè)主要作用部位，被毒素作用后，質(zhì)膜和葉綠體中的顆粒片狀結(jié)構(gòu)以宿主特異性的方式呈現(xiàn)，質(zhì)膜破壞造成細(xì)胞中細(xì)胞液滲出；利用放射性標(biāo)記的二氧化碳（CO2）研究AM-toxin 對(duì)葉綠體影響的研究結(jié)果表明，毒素處理過的蘋果植株能夠抑制CO2的氧化作用[33]。Destruxin B 最早從蕓薹屬植物中分離[34]。Destruxin B 會(huì)引起甘藍(lán)褪綠病和細(xì)胞壞死，電子顯微鏡下褪綠病植株細(xì)胞具有正常的質(zhì)膜，但線粒體腫脹，嵴數(shù)量減少，包膜出現(xiàn)水泡，葉綠體隨著質(zhì)體球數(shù)量的增加顯示出顆粒微結(jié)構(gòu)的退化，壞死細(xì)胞出現(xiàn)質(zhì)壁分離和細(xì)胞器完全破壞[22]。Destruxin B 具有抗病毒活性，CHEN 等[35]的研究發(fā)現(xiàn)，Destruxin B 能夠抑制人類肝癌Hep3B 細(xì)胞中乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg基因的表達(dá)，未來可能具有作為特異性抗肝癌藥物的發(fā)展?jié)摿ΑC-toxin 最早發(fā)現(xiàn)于美國北方患葉斑病的玉米，玉米圓斑病菌是主要病原菌[36]，0.5～2.0 μg/mL 等低劑量的HC-toxin 可以抑制易感玉米的根系生長[37]。除了植物毒性之外，HC-toxin還能夠抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞中使核心組蛋白（H3 和H4）去乙?；慕M蛋白去乙?；福℉DAC）活性[38]。

AS-I toxin 屬于四肽類毒素。AS-I toxin 最早從鏈格孢的培養(yǎng)濾液中分離，經(jīng)化學(xué)和物理化學(xué)技術(shù)鑒定，其為四肽。AS-I toxin 能夠造成向日葵葉片和其他部分的萎黃或壞死，抑制種子發(fā)芽[39]。目前，關(guān)于AS-I toxin的研究很少，需要進(jìn)一步詳細(xì)研究。

ABR-toxin屬于核糖體肽毒素，最早從蕓薹屬植物甘藍(lán)葉片上的孢子萌發(fā)液中分離純化得到。進(jìn)一步的研究表明，將ABR-toxin 與非致病性的鏈格孢孢子混合液接種到蕓薹屬植物葉子上時(shí)，植物的葉子上出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)，隨后出現(xiàn)與蕓薹鏈格孢感染癥狀相似的褪綠癥狀，ABR-toxin不僅誘導(dǎo)寄主植物的初始定殖，而且參與病害的發(fā)展過程[34]。目前，關(guān)于ABR-toxin 的報(bào)道較少，尚不清楚毒素的作用位點(diǎn)和毒性效應(yīng)。

Maculosin 屬于二酮哌嗪類毒素。斑點(diǎn)矢車菊（Centaurea maculosa）是北美主要雜草，對(duì)牧草生產(chǎn)具有很大破壞作用。Maculosin 是互隔鏈格孢侵染蘭科植物后分離獲得，被確定是斑點(diǎn)矢車菊上的主要HST，造成斑點(diǎn)矢車菊黑葉枯萎病[40]。Maculosin的靶向位點(diǎn)是葉綠體，有潛力成為一種安全、環(huán)保的抗雜草生物除草劑[21]。目前，關(guān)于Maculosin 生物合成途徑尚未有報(bào)道。

2 鏈格孢宿主非特異性毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)和毒性效應(yīng)

2.1 鏈格孢宿主非特異性毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)

鏈格孢宿主非特異性毒素的毒性作用比特異性毒素更復(fù)雜。根據(jù)毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征可將nHST 分為4類：（1）二苯并吡喃酮類衍生物類，如交鏈格孢酚單甲醚（Alternariol monomethyl ether，AME）、交鏈格孢酚（Alternariol，AOH）；（2）四氨基酸衍生物類，如細(xì)交鏈格孢酮酸（Tenuazonic acid，TeA）；（3）環(huán)狀四肽類，如騰毒素（Tentoxin，TEN）；（4）苝醌衍生物類，如交鏈格孢毒素（ATX-Ⅰ、ATX-Ⅱ、ATX-Ⅲ）。其化學(xué)結(jié)構(gòu)、化學(xué)式和靶向位點(diǎn)如表2所示。

表2 鏈格孢產(chǎn)生的宿主非特異性毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)、化學(xué)式和靶向位點(diǎn)Tab.2 Chemical structure，chemical formula，and target site of non-host-specific toxins produced by Alternaria

2.2 鏈格孢宿主非特異性毒素的毒性效應(yīng)

AME 和AOH 屬于二苯并吡喃酮類衍生物類毒素。研究表明，AME 能夠抑制植物葉綠體光合作用過程中的電子傳遞[44]。AOH 會(huì)引起意大利蒼耳的葉斑病，其毒性能夠抑制單子葉植物狼尾草、雙子葉植物紫葉苜蓿和反枝莧根系的增長[45]。WENDEROTH 等[46]的研究發(fā)現(xiàn)，AOH 及其衍生物作為毒力因子感染番茄，并參與其定殖過程。還有研究表明，對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞，AME 和AOH 具有致突變性、基因毒性和雌激素活性，能夠抑制人類癌細(xì)胞（HT29、A431）的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ和Ⅱ的活性，影響細(xì)胞的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和修復(fù)過程[47]。AOH和AME在交鏈孢酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下可以相互轉(zhuǎn)化[48]。由于AOH 芳族羥基化的所有產(chǎn)物是兒茶酚或?qū)Ρ蕉?，它們可以產(chǎn)生反應(yīng)性半醌和醌進(jìn)行氧化還原循環(huán)，因此，其甲基化或葡萄糖醛酸化/硫酸化的失活被認(rèn)為是可能的毒理學(xué)原因[49]。AOH 可能通過阻斷細(xì)胞周期、減少細(xì)胞增殖和增加細(xì)胞凋亡干擾哺乳動(dòng)物增殖細(xì)胞的正常進(jìn)程，引起細(xì)胞毒性作用[50]。AOH 在哺乳動(dòng)物中通過產(chǎn)生活性氧（ROS）和脂質(zhì)過氧化（LPO）誘導(dǎo)強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激，從而降低人結(jié)腸腺癌細(xì)胞（Caco-2）的活性[51]。AOH 激活芳香烴受體（AhR）和核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）的核易位，控制細(xì)胞代謝能力和結(jié)構(gòu)完整性，通過控制細(xì)胞結(jié)構(gòu)影響結(jié)腸上皮完整性[43]。

TeA 屬于四氨基酸衍生物類毒素，最早于棉花中分離得到，隨后在多種谷物、蔬菜和水果病害中分離得到[21]。TeA 通過抑制60S 核糖體亞基釋放新合成的蛋白質(zhì)，因此，能夠在核糖體水平上抑制蛋白質(zhì)的生物合成[20]。TeA 可以通過抑制光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）受體側(cè)的電子傳遞和葉綠體ATP 酶活性引起葉綠體來源的ROS 暴發(fā)，導(dǎo)致植物細(xì)胞死亡和組織壞死[52]。進(jìn)一步的研究表明，TeA 誘導(dǎo)的單線態(tài)氧激活了蛋白質(zhì)依賴性信號(hào)通路并引發(fā)了擬南芥幼苗中的細(xì)胞死亡[53]，SHI 等[54]的研究發(fā)現(xiàn)，野生型鏈格孢可以誘導(dǎo)宿主葉片中的ROS 暴發(fā)并在菌絲入侵之前殺死光合細(xì)胞。由TeA 引發(fā)的細(xì)胞死亡是病原體感染期間在宿主葉片中成功定殖和引起病害的必要條件。KANG 等[55]的研究發(fā)現(xiàn)，TeA 不僅會(huì)對(duì)寄主植物造成損害，而且還參與維持ROS 含量、宿主識(shí)別、誘導(dǎo)附著胞感染宿主和完成感染過程。

TEN 屬于環(huán)狀四肽類毒素，最早于紫莖澤蘭枯萎葉片中分離得到[56]。TEN 是一種特異性的、非競(jìng)爭(zhēng)性的光磷酸化抑制劑，作用部位與葉綠體F1-ATP酶（CF1）有關(guān)[57]。SANTOLINI等[58]的研究表明，低濃度的TEN 會(huì)抑制ATP 的水解和合成，高濃度的TEN會(huì)影響ATP酶的活性。

ATX 屬于苝醌衍生物交替毒素。ATX-Ⅰ和ATX-Ⅱ最早從鏈格孢蘋果?；停ˋ.mali）中分離，ATX-Ⅲ從互隔鏈格孢（A.alternata）分離[59]。目前，對(duì)于ATX 毒素的研究主要集中于對(duì)哺乳動(dòng)物的毒性效應(yīng)，在植物中的靶向位點(diǎn)和致病機(jī)制尚不清楚。研究表明，ATX 對(duì)動(dòng)物細(xì)胞的誘變強(qiáng)度要高于AOH 和AME[60-63]。ATX 對(duì)宮頸癌HeLa 細(xì)胞和中國倉鼠肺細(xì)胞株V79 均具有細(xì)胞毒性[59，62]。ATX-Ⅱ誘導(dǎo)AhR 和Nrf2 的核易位，在細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平上抑制腸道免疫反應(yīng)，通過控制細(xì)胞結(jié)構(gòu)影響結(jié)腸上皮完整性[43]。

3 鏈格孢毒素檢測(cè)方法

準(zhǔn)確、迅速、高效的檢測(cè)技術(shù)是鏈格孢毒素研究的基礎(chǔ)。目前，鏈格孢毒素檢測(cè)方法有高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、加壓毛細(xì)管電色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法、生物發(fā)光酶免疫測(cè)定法、薄層色譜法等。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（High performance liquid chromatography mass spectrometry，HPLC-MS/MS）利用高效液相色譜對(duì)復(fù)雜樣品進(jìn)行分離，質(zhì)譜提供鏈格孢毒素相對(duì)分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息。HPLC-MS/MS 具有靈敏度高、操作方便、自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，近年來廣泛用于毒素的定性和定量測(cè)定。GUO 等[64]開發(fā)了一種改進(jìn)的基于快速、簡(jiǎn)便、便宜、有效、堅(jiān)固、安全的萃取方法（Quick，easy，cheap，effective，rugged and safe simple，rapid and safe method，QuEChERS）的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-MS/MS）方法，測(cè)定果汁中常見的曲霉、青霉和鏈格孢毒素發(fā)現(xiàn)，其中5 種鏈格孢毒素[TEN、TeA、AOH、AME、鏈格孢烯（ALT）]的檢測(cè)限（LOD）為0.05～0.50 ng/mL，定量限（LOQ）為0.1～1.0 ng/mL。RAUSCH 等[65]使用基于QuEChERS 的萃取方法，在不同條件下進(jìn)行HPLC-MS/MS分析，測(cè)定38種真菌毒素發(fā)現(xiàn)，小麥中4 種鏈格孢毒素（ALT、AME、AOH、TEN）的LOD 為0.01～0.30 μg/kg，LOQ 為0.40～1.50 μg/kg。XING 等[66]使 用 改 進(jìn) 的QuEChERS 方法，用乙腈和水萃取，用NaCl 鹽析，測(cè)定果泥中7 種鏈格孢毒素發(fā)現(xiàn)，其LOD為0.18～0.53 μg/kg，LOQ為0.56～2.17 μg/kg。SCHEIBENZUBER 等[67]建立了一種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）方法，測(cè)定不同啤酒類型中13 種游離和改性的鏈格孢毒素發(fā)現(xiàn)，AME和ALT的LOD 在0.03 ～5.48 μg/L，LOQ 在0.09～16.24 μg/L。但HPLC-MS/MS 缺點(diǎn)在于儀器價(jià)格較為昂貴，測(cè)定成本較高；存在基質(zhì)效應(yīng)等缺點(diǎn)，需要進(jìn)行固相萃取等復(fù)雜前處理，改善凈化效果，降低基質(zhì)效應(yīng)。

氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Gas chromatography mass spectrometry，GC-MS/MS）利用樣品的沸點(diǎn)或極性的差異對(duì)真菌毒素進(jìn)行分離。GC-MS/MS具有分離度高、靈敏度高和應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，SCOTT 等[68]利 用 衍 生 化GC-MS/MS 和HPLC 2 種 方法同時(shí)測(cè)定蘋果汁中的鏈格孢毒素，經(jīng)分析比較發(fā)現(xiàn)，GC-MS/MS 的靈敏度高于HPLC。GC-MS/MS 適用于非極性、半極性、揮發(fā)性和半揮發(fā)性化合物的檢測(cè)，但大多數(shù)鏈格孢毒素是低揮發(fā)性的極性小分子，因此，GC-MS/MS檢測(cè)前通常要對(duì)鏈格孢毒素樣品進(jìn)行衍生化處理。衍生化處理會(huì)出現(xiàn)基質(zhì)干擾和耗時(shí)長等不可避免的問題，檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性差。此外，GC-MS/MS 還存在前一個(gè)樣品進(jìn)樣的記憶效應(yīng)問題。因此，GC-MS/MS 在鏈格孢毒素檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用較少。

加壓毛細(xì)管電色譜法（Pressure capillary electrochromatography combined，pCEC）是結(jié)合毛細(xì)管電泳的高柱效性和高效液相色譜的高選擇性的新型電動(dòng)微分離技術(shù)，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏、檢出限低和重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)[69]。薛羚偉等[70]利用pCEC技術(shù)對(duì)霉變柑橘中的AME、AOH 和ALT 3 種鏈格孢毒素進(jìn)行測(cè)定，LOD 為0.1～0.9 μg/kg，LOQ 在0.2～0.9 μg/kg。但是pCEC 分析復(fù)雜樣品時(shí)，數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性以及方法靈敏度易受基質(zhì)效應(yīng)的影響。

酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是利用抗體三維結(jié)構(gòu)特點(diǎn)區(qū)分毒素的方法。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒樣本量要求低，而且通常樣本量更少，具有快速、簡(jiǎn)單、特異、靈敏、便攜的特點(diǎn)。綴合物的設(shè)計(jì)是一種創(chuàng)新的合成策略，綴合物是通過非共價(jià)作用或共價(jià)鍵對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾得到的，可以有效調(diào)控蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和功能性[71]。SZURDOKI 等[72]開 發(fā) 了 合 成AAL-toxin TA 蛋白綴合物的新方法。選擇的綴合物是制備檢測(cè)AAL 毒素的單克隆抗體和多克隆抗血清的候選免疫原。用綴合物免疫小鼠，所得多克隆抗血清用于設(shè)計(jì)AAL 化合物的類別選擇性ELISA。檢測(cè)限在十億分之幾的低范圍內(nèi)，對(duì)許多結(jié)構(gòu)相似的化合物（包括伏馬菌素B1 和鞘氨醇）沒有顯著的交叉反應(yīng)性。利用綴合物作為候選免疫原，可產(chǎn)生單克隆抗體和多克隆抗血清，AAL-toxin 是第1 個(gè)通過ELISA檢測(cè)到的鏈格孢毒素。LIANG 等[73]以TeA 為靶點(diǎn)，基于產(chǎn)生抗TeA 單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞（3F10）的重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL），開發(fā)了針對(duì)鏈格孢毒素TeA 的增強(qiáng)型開放夾心酶聯(lián)免疫吸附法（Open sandwich enzyme-linked immunosorbent assay，OS-ELISA）抗體，LOD 為0.08 ng/mL，靈敏度是基于單克隆抗體間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 的13倍，利用該方法檢測(cè)果汁、面粉和番茄醬樣品中的TeA 含量，回收率為87.6%～111.3%，OS-ELISA 可以作為TeA檢測(cè)的一種新穎可行的分析方法。但酶聯(lián)免疫吸附法具有重現(xiàn)性差、抗體制備不易的缺點(diǎn)，有時(shí)候會(huì)有假陽性等情況發(fā)生，因此，在鏈格孢毒素檢測(cè)方面受到限制。

生物發(fā)光酶免疫測(cè)定法（Bioluminescent enzyme immunoassay，BLEIA），是將高靈敏的生物發(fā)光分析與特異性的酶聯(lián)免疫技術(shù)相結(jié)合的測(cè)定方法，可消除含有劇毒的毒素標(biāo)準(zhǔn)品存在的安全隱患，且不需要標(biāo)準(zhǔn)品，降低檢測(cè)成本。WANG等[74]以鏈格孢毒素TeA 為靶點(diǎn)，基于鐵蛋白顯示的抗獨(dú)特型納米體-納米熒光素酶多聚體，建立了一種增強(qiáng)的無毒免疫分析法（Non-toxic direct competitive bioluminescent enzyme immunoassay，dc BLEIA）。dc BLEIA 以具有特殊內(nèi)部圖像的β 型抗獨(dú)特型抗體作為抗原的替代品。增強(qiáng)型dc BLEIA 的LOD 為0.7 ng/mL，回收率在80.0%～93.2%，與傳統(tǒng)儀器方法相比，基于抗體的免疫測(cè)定具有快速、高靈敏度、高特異性、高通量和安全性的優(yōu)勢(shì)，但只限于單一毒素的檢測(cè)。

薄層色譜法（Thin layer chromatography，TLC）是在紫外光線照射下，根據(jù)毒素產(chǎn)生的熒光的強(qiáng)弱和斑點(diǎn)的大小對(duì)毒素的種類和含量進(jìn)行測(cè)定[75]。TLC具有成本低、溶劑消耗少、樣品預(yù)處理和操作簡(jiǎn)單以及顯影快等優(yōu)點(diǎn)。HASAN[76]使用氯仿-丙酮作為溶劑，對(duì)番茄中的鏈格孢毒素進(jìn)行TLC 測(cè)定，結(jié)果表明，腐爛番茄中的主要鏈格孢毒素為AOH、AME和TeA，LOD 分別為100、100、700 μg/kg。與其他檢測(cè)方法相比，TLC存在檢出限較高、重現(xiàn)性差和誤差大等缺陷。

綜上，TLC、GC-MS/MS 等傳統(tǒng)分析檢測(cè)方式存在檢出限高和需要衍生化處理等缺點(diǎn)；HPLC-MS/MS 靈敏度和自動(dòng)化程度較高，但是儀器較為昂貴且體積較大，不能進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)定；pCEC 具有準(zhǔn)確、快速和靈敏等優(yōu)點(diǎn)，但存在易受基質(zhì)效應(yīng)影響等缺點(diǎn)；ELISA 回收率高，方便攜帶，但抗體制備要求較高且困難，假陽性情況時(shí)有發(fā)生；dc BLEIA 具有檢出限低、靈敏、快速、安全、方便等優(yōu)勢(shì)，是今后研究的熱點(diǎn)。檢測(cè)儀器體積小、快速、靈敏、操作簡(jiǎn)便、低成本將是未來鏈格孢毒素檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)。

4 展望

鏈格孢毒素被公認(rèn)為是植物致病性的重要決定因素，在各種鏈格孢的致病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。目前，鏈格孢宿主非特異性毒素的合成相關(guān)基因已經(jīng)有較多研究報(bào)道，但是多種宿主特異性毒素合成相關(guān)基因和作用通路尚不明確。未來應(yīng)進(jìn)一步挖掘毒性靶標(biāo)基因和抗性機(jī)制，重點(diǎn)研究系統(tǒng)中各種影響因素的調(diào)節(jié)過程，深入了解毒素代謝途徑，助力抗病植物品種的開發(fā)。

由于鏈格孢毒素在植物上廣泛存在，并被動(dòng)物和人類食用，因此，需要對(duì)其進(jìn)行更多的毒理學(xué)和毒性動(dòng)力學(xué)研究。目前的鏈格孢毒素研究大多僅限于體外試驗(yàn)，人們對(duì)鏈格孢毒素的毒性動(dòng)力學(xué)知之甚少。新的研究結(jié)果表明，鏈格孢毒素和腸道微生物之間存在實(shí)質(zhì)性的相互作用[77]，這一方面可能會(huì)影響腸道微生物組成，另一方面可能會(huì)影響毒理學(xué)和毒性動(dòng)力學(xué)。未來需要在體內(nèi)應(yīng)用創(chuàng)新穩(wěn)定同位素輔助代謝組研究[78]，以詳細(xì)揭示鏈格孢毒素在體內(nèi)的代謝過程。新開發(fā)的LC-MS/MS方法能夠同時(shí)檢測(cè)多種鏈格孢毒素[79]，預(yù)計(jì)將廣泛應(yīng)用于食品和飼料中目前尚未充分評(píng)估的具有潛在毒理學(xué)相關(guān)性的代謝物的檢測(cè)。

在目前的全球真菌毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)中，與農(nóng)產(chǎn)品相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)尚未包括鏈格孢毒素[80]。因此，有必要制定符合中國國情的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和法規(guī)，有效控制污染的谷物、水果及其衍生產(chǎn)品中的鏈格孢毒素，保證食品安全。