了解臨床微生物檢驗(yàn)的常用染色方法

李玉梅

微生物細(xì)胞含有大量的水分（通常在80%以上），對(duì)光線(xiàn)的吸收和反射與水溶液差別不大，與周?chē)尘皼](méi)有明顯的明暗差。所以，除了觀察活體微生物細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性和直接計(jì)算菌數(shù)外，絕大多數(shù)情況下都要經(jīng)過(guò)染色后，才能在顯微鏡下進(jìn)行觀察。但是，染色就意味著微生物處于死亡狀態(tài)，其形態(tài)、結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生一些變化，并不能完全代替活細(xì)胞的真實(shí)狀況。

基本原理

微生物染色通常有化學(xué)和物理兩種方法。其中，物理方式通常采用滲透、染料吸附等，化學(xué)方法則利用染料與細(xì)胞物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)。通常來(lái)說(shuō)，酸性物質(zhì)對(duì)于堿性染料較易吸附，且吸附作用穩(wěn)固；同樣，堿性物質(zhì)對(duì)酸性染料較易于吸附。但是，要使酸性物質(zhì)染上酸性材料，必須把它們的物理形式加以改變（如改變pH值），才利于吸附作用的發(fā)生。細(xì)菌的等電點(diǎn)較低，呈現(xiàn)出酸性。因此，一般細(xì)菌學(xué)經(jīng)常會(huì)使用堿性染料染色。染色還可能與菌體結(jié)構(gòu)、膜的狀況（通透性、孔大小等）、細(xì)胞結(jié)構(gòu)，以及染色時(shí)的電解質(zhì)、溫度等有一定關(guān)系。

染料

染料分為人工和天然兩種。天然染料存在于自然界當(dāng)中，例如蘇木素、胭脂蟲(chóng)紅等，通常提取于植物當(dāng)中。人工染料一般在煤焦油當(dāng)中獲得，屬于苯衍生物。染料通常為有機(jī)酸或堿類(lèi)，在有機(jī)溶劑當(dāng)中易溶解，水中難溶解，但可以制成鹽類(lèi)而溶于水。染料還可分為酸性、堿性、中性、單純四大類(lèi)。

其中，酸堿染料并不是依據(jù)溶液的pH值決定，而是其自身所帶的助色基團(tuán)決定。將助色基團(tuán)電離之后，查看電荷的帶電情況。通常而言，堿性染料助色基團(tuán)為正電荷，酸性染料助色基團(tuán)為負(fù)電荷。因此，堿性染料通常能電離無(wú)色陰離子和有色陽(yáng)離子，如龍膽紫、亞甲基藍(lán)等；酸性染料通常能電離一些無(wú)色陽(yáng)離子和彩色陰離子，如伊紅、苦味酸、加那綠等。中性染料是一種復(fù)合型染料，通常是將酸堿染料進(jìn)行混合。單純?nèi)玖贤ǔＳH和力低，染色的能力通常由被染色物決定，若能夠較好地溶于被染色物當(dāng)中，則染色能力強(qiáng)，且單純?nèi)玖想y以溶于水，可溶脂肪溶劑，例如紫丹類(lèi)。

微生物染色程序

雖然微生物有許多染色方式，但一般的操作程序大體相同，通常的流程為制片—干燥—固定—染色—干燥—鏡檢。

（1）制片：在進(jìn)行微生物染色前，制作相應(yīng)的載玻片。操作時(shí)，將生理鹽水滴1滴在載玻片上，而后應(yīng)用無(wú)菌接種環(huán)挑選少許培養(yǎng)物混入生理鹽水中研磨至均勻乳濁狀，再涂抹成直徑1.5 cm左右的橢圓形薄菌膜。如果是液體培養(yǎng)基中的菌液，可直接涂在載玻片上。（2）干燥：涂片通常是在室溫當(dāng)中進(jìn)行自然干燥。為加快干燥速度，可以將菌膜面向上放在酒精燈火焰上方進(jìn)行微加熱，使水分快速蒸發(fā)，但應(yīng)注意不能夠與火焰靠得太近，否則會(huì)使菌體出現(xiàn)變形而影響鏡下觀察。（3）固定：通常是將細(xì)胞的結(jié)構(gòu)進(jìn)行固定。殺死微生物，將菌體與載玻片牢牢相粘，防止水沖洗掉。固定時(shí)需要將載玻片來(lái)回幾次通過(guò)酒精燈火焰最外層，溫度以玻片不燙手背為宜，冷卻之后進(jìn)行染色。（4）染色：根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康牟煌?，選擇不同的染色方法，染液應(yīng)完全覆蓋菌膜。（5）干燥：染色沖洗完成后的涂片可自然晾干，也可用吸水紙吸水后晾干或烘干。（6）鏡檢：應(yīng)用光學(xué)顯微鏡在油鏡下對(duì)菌體的染色性、形態(tài)、排列進(jìn)行觀察。

微生物染色方法

通常，微生物有單染和復(fù)染兩種染色方法 。

單染

即用一種染料對(duì)涂片進(jìn)行染色，簡(jiǎn)單方便，適用于觀察微生物的形態(tài)，但是不能夠?qū)ξ⑸镞M(jìn)行鑒別。常用堿性染料，如亞甲基藍(lán)、孔雀石綠、堿性品紅、結(jié)晶紫、中性紅等。如果使用酸性染料，通常使用剛果紅、伊紅、藻紅和酸性品紅。當(dāng)使用酸性染料時(shí)，必須降低染料溶液的pH值，使其呈強(qiáng)酸性（低于細(xì)菌細(xì)胞的等電點(diǎn)），使細(xì)胞帶正電，從而容易被酸性染料染色。

比如棉藍(lán)染色是一種用于真菌檢驗(yàn)的染色方法。首先在一個(gè)干凈的載玻片上，滴入1～2滴乳酸酚棉藍(lán)染液，然后應(yīng)用解剖針將霉菌菌落邊緣地區(qū)含有孢子及菌絲的部分切割取下，放置于染色液當(dāng)中，蓋上蓋玻片稍用力按壓（注意不要產(chǎn)生氣泡），放至顯微鏡下進(jìn)行觀察。先使用低倍鏡，再換高倍鏡。在鏡下，真菌孢子和菌絲會(huì)呈現(xiàn)出藍(lán)色，利于觀察真菌完整的形態(tài)。

復(fù)染

復(fù)染是應(yīng)用兩種及以上的染料進(jìn)行染色的方法。

革蘭氏染色

革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法。其被用于對(duì)肺炎鏈球菌以及克雷伯菌進(jìn)行鑒定，包括了四個(gè)步驟，初染—媒染—脫色—復(fù)染。未染色的細(xì)菌在顯微鏡下很難分辨，因?yàn)榕c周?chē)h(huán)境的折射率相差不大。在染色后，陰性菌為紅色，陽(yáng)性菌為紫色，然后再對(duì)于細(xì)菌的整體形態(tài)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，以初步鑒定細(xì)菌的種類(lèi)。

具體操作：首先使用接種環(huán)蘸取細(xì)菌，均勻涂抹于加有生理鹽水的載玻片上；對(duì)載玻片背面加熱殺死細(xì)菌并固定粘附，應(yīng)用紫色染液進(jìn)行初染色，時(shí)長(zhǎng)為1 min左右；應(yīng)用自來(lái)水沖洗多余的染料后，應(yīng)用碘液媒染，持續(xù)1 min后進(jìn)行沖洗；應(yīng)用脫色劑脫色，例如95%酒精、丙酮酸，持續(xù)30 s，陽(yáng)性菌在這一過(guò)程中不變色，陰性菌變?yōu)闊o(wú)色；應(yīng)用紅色染液復(fù)染，持續(xù)30 s，陰性菌變?yōu)榧t色。

這一方式的原理為在對(duì)細(xì)菌應(yīng)用紫色染料初染以及碘溶液媒染后，細(xì)菌的細(xì)胞壁當(dāng)中會(huì)形成結(jié)晶紫碘絡(luò)合物，其物理性質(zhì)不溶于水。陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁厚，肽聚糖非常緊密，在應(yīng)用脫色劑進(jìn)行脫色時(shí)，陽(yáng)性菌失水出現(xiàn)收縮，不容易脫色，且不含脂類(lèi)物質(zhì)，在乙醇處理時(shí)沒(méi)有空隙，所以呈現(xiàn)為紫色。而陰性菌的細(xì)胞壁薄，結(jié)構(gòu)并不緊密，同時(shí)含有大量脂質(zhì)，在脫色時(shí)脂肪溶解，結(jié)構(gòu)變得更為松散，故非常容易脫色，呈現(xiàn)無(wú)色；在應(yīng)用紅色染料進(jìn)行第二次染色時(shí)，著色呈現(xiàn)為紅色。

抗酸染色

抗酸染色法是一種對(duì)具有抗酸性的細(xì)菌進(jìn)行檢查的特殊染色方法。如分枝桿菌這類(lèi)抗酸細(xì)菌的細(xì)胞壁含有大量脂質(zhì)，不容易被著色，需要進(jìn)行加熱或延長(zhǎng)染色時(shí)間才能著色。若一旦與染料進(jìn)行結(jié)合后，很難被酸性的脫色劑脫色。該染色方法首先使用石炭酸復(fù)紅進(jìn)行初染；然后使用鹽酸酒精脫色；最后用亞甲藍(lán)染液進(jìn)行復(fù)染。

具體操作：首先將石碳酸復(fù)紅染液滴加在涂片上，可用玻片夾將涂片固定在火焰的高處進(jìn)行加熱，待出現(xiàn)蒸汽后短暫移開(kāi)（若是染液蒸發(fā)減少，可以進(jìn)行添加，避免干涸）；當(dāng)染液冷卻后，可再加熱。如此循環(huán)10 min后，將標(biāo)本冷卻水洗。不進(jìn)行加熱染色時(shí)，可將染色時(shí)間延長(zhǎng)至20 min，隨后應(yīng)用3%的鹽酸酒精進(jìn)行脫色至涂片無(wú)色為止，再使用自來(lái)水進(jìn)行沖洗，最后使用亞甲藍(lán)染液復(fù)染1 min，水洗，自然待干或用吸水紙吸干后進(jìn)行鏡下觀察。

可見(jiàn)，單染和復(fù)染兩種染色方式存在著較大的區(qū)別。單染只染一種顏色，一般應(yīng)用于對(duì)菌體的形態(tài)和排列方式的觀察，但不能夠?qū)?xì)菌進(jìn)行鑒別。復(fù)染應(yīng)用的染料較多，因菌體的結(jié)構(gòu)組成不同呈現(xiàn)出不一樣的顏色，且不同的細(xì)菌種類(lèi)也存在不同的染料反應(yīng)，因此能夠鑒別細(xì)菌，在臨床應(yīng)用也較多。