雞細小病毒NS1和VP2蛋白的原核表達及多克隆抗體制備

廖健淇,謝芝勛,張民秀,張艷芳,羅思思,李 孟,謝志勤,謝麗基,鄧顯文,范 晴,曾婷婷,黃嬌玲,王 盛

(1.廣西大學動物科學技術學院,南寧 530004;2.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部中國(廣西) —東盟跨境動物疫病防控重點實驗室,南寧 530001)

【研究意義】自首次在美國發(fā)現(xiàn)雞細小病毒(Chicken parvovirus,ChPV)以來[1],不斷有其他地區(qū)發(fā)現(xiàn)雞群感染ChPV的案例報道,截至目前,該病已經(jīng)在美國、波蘭、韓國及中國廣泛傳播[2]。在我國廣西地區(qū),ChPV及與其同屬的火雞細小病毒(Turkey parvovirus,ThPV)在大部分商品雞雞場中均廣泛存在,ChPV在肉雞中的陽性率達60.18%,在種雞和蛋雞中也存在約39.00%的陽性率,ThPV的陽性率高達83.33%,其中在柳州、玉林、北海、南寧和梧州的流行情況較嚴重,陽性率均在60.00%以上[3]。ChPV/ThPV在健康雞群中也廣泛存在,且存在垂直傳播的可能性[4-5],但目前對于該病致病機理及快速診斷方法的研究不夠深入。因此,原核表達ChPV的NS1和VP2蛋白,制備其多克隆抗體,對深入探究ChPV的蛋白結構功能及建立其血清學診斷方法有效防控ChPV具有重要意義。【前人研究進展】ChPV是無包膜單鏈的DNA病毒,其結構為正二十面體對稱結構,與ThPV同屬細小病毒科細小病毒亞科Aveparvovirus屬[6],在抗原上ChPV與ThPV密切相關,二者的NS1蛋白同源性達91.5%～99.6%[7]。Sunil等[8]研究表明,ChPV基因長約5.3 kb,具有3個開放閱讀框(ORF),其中,ORF1和ORF3分別編碼非結構蛋白NS1和NP1,ORF2編碼結構蛋白VP1和VP2;VP1蛋白由675個氨基酸組成,是ChPV的結構蛋白之一,該蛋白可能具有影響病毒侵入和釋放的功能。VP1蛋白基因包含VP2蛋白基因完整序列,且共同擁有536個相同的C末端氨基酸。NP1蛋白是ChPV中的最小蛋白,由101個氨基酸組成,目前對該蛋白的研究報道較少,推測該蛋白可能與衣殼蛋白的表達及病毒DNA復制有關[9]。NS1蛋白約由695個氨基酸組成,在細胞核中復制,是病毒DNA復制和包裝的必需磷蛋白,具有重疊的N端雙鏈DNA特異性識別位點和鏈特異性核酸內(nèi)切酶結構域及復制啟動功能[10],NS1蛋白基因在ChPV中具有保守性,常被用作分子診斷的靶點[11]。VP2蛋白約由537個氨基酸組成,是ChPV最重要的結構蛋白和主要衣殼蛋白,在病毒生命周期中具有包裝病毒衣殼和DNA復制及對宿主細胞產(chǎn)生細胞毒性等多種功能[12],能刺激機體產(chǎn)生強烈的免疫應答,因此有望用于疫苗制備和血清學診斷,已有學者基于該蛋白構建了重組黑色素皰疹病毒1型(MeHV1)病毒,為抗ChPV疫苗的制備提供了新思路[13]。迄今,國內(nèi)外針對ChPV的研究少有報道,對該病毒在腸道疾病中的致病機制尚不明確,且該病毒在體外增殖較困難[14],導致對該病的研究進展較緩慢?！颈狙芯壳腥朦c】NS1和VP2蛋白基因是ChPV疫苗研制和檢測診斷的重要基因,但目前缺少商品化的抗NS1和VP2蛋白抗體及ChPV抗體檢測試劑盒,針對ChPV的NS1和VP2蛋白結構和功能研究及ChPV在雞群中的血清學調(diào)查鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】構建ChPV的NS1和VP2蛋白重組表達載體pET-32a-VP2和pET-32a-NS1并進行原核表達,制備NS1和VP2蛋白的多克隆抗體,為后續(xù)針對NS1和VP2蛋白的生物學作用研究及建立ChPV血清學檢測方法防控ChPV提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

pET-32a表達載體和ChPV感染性克隆株pBluescript II SK(+)-ChPV質(zhì)粒由廣西獸醫(yī)生物技術重點實驗室保存提供,DL10000 DNA Marker、Sacl和Hind III限制性內(nèi)切酶和DNA片段純化試劑盒購自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司;大腸桿菌thanssetta(DE3)感受態(tài)細胞和thans 5α感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自Omega Bio-Tek公司;AP標記羊抗鼠二抗、His標簽抗鼠抗體、HRP標記抗雞二抗和BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒購自碧云天生物技術公司;辣根過氧化物酶DAB顯色試劑盒購自上海生工生物工程公司;包涵體蛋白純化試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司;PMV-VP2和PMV-NS1為分別含有VP2和NS1蛋白基因序列全長的重組質(zhì)粒,由深圳華大基因科技有限公司構建。

1.2 試驗方法

1.2.1 NS1和VP2蛋白基因序列引物的設計及PCR擴增 根據(jù)GenBank上公布的GX-Ch-PV-21毒株基因序列(登錄號MG602511),應用Primer Premier 5.0設計NS1和VP2蛋白基因序列的擴增引物,NS1-F:5′-ACGGAGCTCGCATTCCCAACACGC GGTGGGTTTT-3′,NS1-R:5′-CCCAAGCTTTTGAACCAGACAGCACTGTCGACAC-3′,NS1蛋白基因序列大小為2088 bp;VP2-F:5′-ACGGAGCTCGCAGATGAAAATGAACCAACTCAG-3′,VP2-R:5′-CCCAAGCTTATTGGATTTCGGTACCCGACGGGTT-3′,VP2蛋白基因序列大小為1607 bp(下劃線部分為酶切位點Sacl和Hind III),引物送至深圳華大基因科技有限公司合成。

以重組質(zhì)粒PMV-VP2和PMV-NS1為模板,分別進行NS1和VP2蛋白的全長基因序列PCR擴增。PCR反應體系50.0 μL:上、下游引物(10 μmol/L)各2.5 μL,PrimeSTAR GXL Premix(2×) 25.0 μL,DNA模板2.5 μL,ddH2O 17.5 μL;NS1蛋白基因序列的PCR擴增程序:95 ℃預變性3 min;95 ℃ 30 s,65 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,進行35個循環(huán);72 ℃延伸10 min;VP2蛋白基因序列的PCR擴增程序:95 ℃預變性3 min;95 ℃ 30 s,62 ℃ 30 s,72 ℃ 1.5 min,進行35個循環(huán);72 ℃延伸10 min;PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證條帶正確后,根據(jù)膠回收試劑盒操作說明進行回收。

1.2.2 重組克隆載體的構建與鑒定 使用Sacl和Hind III內(nèi)切酶分別對VP2和NS1蛋白的基因片段和pET-32a表達載體進行雙酶切,按照連接酶試劑盒說明將VP2和NS1蛋白的基因片段分別與pET-32a表達載體連接并轉化thans 5α感受態(tài)細胞,通過PCR及雙酶切方法鑒定后,將陽性克隆菌液送至北京六合華大基因科技有限公司進行測序,將測序正確的重組質(zhì)粒分別命名為pET-32a-VP2和pET-32a-NS1。

將重組質(zhì)粒pET-32a-VP2和pET-32a-NS1分別轉化thansetta(DE3)感受態(tài)細胞,構建重組菌pET-32a-VP2/thansetta(DE3)和pET-32a-NS1/thansetta(DE3)。

1.2.3 重組蛋白最佳誘導條件篩選 將1.2.2的重組菌pET-32a-VP2/thansetta(DE3)和pET-32a-NS1/thansetta(DE3)分別接種于含100.0 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中,置于37 ℃搖床培養(yǎng),當菌液濃度(OD600 nm)約為0.8時,加入終濃度為0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 mmol/L的IPTG,20 ℃過夜誘導表達,4000 r/min室溫離心10 min,棄上清,菌體經(jīng)放射免疫沉淀法裂解緩沖液(RIPA裂解液)和超聲機超聲處理后加入蛋白上樣緩沖液,沸水水浴10 min使蛋白樣品變性,取30.0 μL蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳,確定IPTG最佳誘導濃度;在最佳IPTG濃度下,分別于12、16、20、24和37 ℃下過夜誘導,確定誘導表達的最佳溫度。

1.2.4 重組蛋白的可溶性分析 根據(jù)1.2.3篩選出的最佳誘導條件誘導表達重組菌pET-32a-VP2/thansetta(DE3)和pET-32a-NS1/thansetta(DE3)各400.0 mL,4000 r/min離心10 min,收集菌液沉淀,加入適量無乙二胺四乙酸(EDTA)細胞裂解液及蛋白酶抑制劑,超聲破碎細菌后離心,收集上清和沉淀,進行 SDS-PAGE電泳,對重組蛋白進行可溶性分析。

1.2.5 包涵體蛋白的純化及復性 參考His標簽蛋白純化試劑盒(包涵體蛋白)說明分別對表達的重組NS1和VP2蛋白進行純化。制備蛋白復性緩沖液[1.0 mmol/L EDTA,50.0 mmol/L Tris-HCl,磷酸鹽緩沖液(PBS),pH=8.0],將純化蛋白放入10 kD孔徑的分子透析袋中,依次使用1.0 L含6.0、4.0、2.0和0 mol尿素的蛋白復性緩沖液透析,4 ℃條件下各透析10 h,最后置于1.0 L PBS溶液中4 ℃過夜透析,以紫外可見光分光光度法測定蛋白濃度。

1.2.6 重組VP2蛋白和NS1蛋白多克隆抗體制備 使用純化的VP2和NS1蛋白對4周齡無特定病原體(SPF)雞進行免疫,首次免疫將VP2和NS1蛋白稀釋至200.0 μg/mL,并分別與等體積完全弗氏佐劑混合乳化后,取1.0 mL通過皮下注射對SPF雞進行免疫,首次免疫后21和42 d采用VP2和NS1蛋白分別與等體積不完全弗氏佐劑混合乳化后進行加強免疫,第3次免疫后14 d進行翅下靜脈采血,采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)方法測定多克隆抗體效價,第3次免疫后21 d進行第4次免疫,翅下靜脈采血后處死SPF雞,將收集的血液37 ℃水浴1 h后4 ℃過夜,收集的血清置于-40 ℃冰箱凍存。

1.2.7 重組VP2和NS1蛋白及多克隆抗體的免疫印跡(Western-blotting)鑒定 取純化并復性后的VP2和NS1蛋白,處理后進行SDS-PAGE電泳,將蛋白從變性膠轉移至NC膜上,以封閉后加入稀釋2000倍的商品化His標簽抗體為一抗,以稀釋2000倍的AP標記羊抗鼠IgG為二抗,參考BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒說明進行顯色。以純化后的VP2 和NS1蛋白為抗原,以VP2和NS1蛋白的雞多克隆抗體為一抗,HRP標記羊抗雞IgG為二抗,使用DAB顯色試劑盒顯色度并拍照保存。

1.2.8 多克隆抗體的間接免疫熒光(IFA)鑒定 在6孔板中培養(yǎng)雞肝癌細胞(LMH),待細胞長至匯合度約80%后,將由廣西獸醫(yī)生物技術重點實驗室制備的ChPV感染性克隆株pBluescript II SK(+)-ChPV質(zhì)粒轉染細胞,5%CO2條件下在37 ℃恒溫箱培養(yǎng)3 d;使用細胞固定液(50%甲醇+50%丙酮)將LMH細胞在室溫下固定20 min;用5%脫脂奶粉37 ℃封閉后,分別加入NS1和VP2蛋白的多克隆抗體(1∶500稀釋),37 ℃孵育1 h;磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗滌3次,加入FITC—山羊抗雞IgG抗體(1∶500稀釋)37 ℃孵育1 h;使用PBST洗凈后置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2 結果與分析

2.1 NS1和VP2 蛋白基因的PCR擴增

使用設計的引物分別對NS1和VP2蛋白基因進行PCR擴增,電泳檢測結果顯示,NS1蛋白基因片段大小約為2088 bp(圖1-A),VP2蛋白基因片段大小約為1607 bp(圖1-B),均符合預期結果。

2.2 重組克隆載體的構建與鑒定

對重組質(zhì)粒pET-32a-NS1和pET-32a-VP2使用Sacl和Hind III內(nèi)切酶進行雙酶切后,均得到符合預期的目的片段條帶,重組質(zhì)粒pET-32a-NS1的Sacl和Hind III內(nèi)切酶酶切片段大小約為5900和2088 bp(圖2-A),重組質(zhì)粒pET-32a-VP2的Sacl和Hind III內(nèi)切酶酶切片段大小約為5900和1607 bp(圖2-B),表明已成功將目的基因克隆到表達載體pET-32a中。

2.3 重組蛋白最佳誘導條件的篩選及可溶性分析

將VP2和NS1蛋白分別在不同溫度和不同IPTG終濃度條件下進行誘導表達,結果顯示,VP2蛋白在IPTG 終濃度為0.1～0.4 mmol/L時表達效果不理想,最終確定VP2蛋白在IPTG終濃度為0.8 mmol/L(部分結果見圖3-A)、20 ℃下過夜誘導為最佳誘導表達條件(圖3-B);NS1蛋白在IPTG終濃度為0.1～0.6 mmol/L時表達效果不理想,最終確定NS1蛋白在IPTG終濃度為1.0 mmol/L(部分結果見圖4-A)、16 ℃下過夜誘導為最佳誘導表達條件(圖4-B)?？扇苄苑治鼋Y果(圖5)表明,VP2和NS1蛋白在最佳誘導條件下主要以包涵體蛋白形式存在,說明在最佳誘導條件下已成功誘導出以包涵體形式存在的VP2和NS1蛋白。

M為130 kD蛋白Marker;1為已誘導pET-32a空載總蛋白;A:2為未誘導的重組菌株,3～7分別為0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 mmol/L IPTG 誘導條件下表達的蛋白;B:2～6分別為16、20、24、28和37 ℃誘導條件下表達的蛋白。M was 130 kD protein Marker;1 was pET-32a no-load total protein that has been induced;A:2 was uninduced recombinant strain;3-7 were 0.6,0.8,1.0,1.2 and 1.4 mmol/L IPTG induced protein expression respectively;B:2-6 were proteins expressed at 16,20,24,28 and 37 ℃,respectively.圖3 重組蛋白VP2的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of VP2 recombinant protein

M為180 kD蛋白Marker;1為已誘導pET-32a空載總蛋白;A:2為未誘導的重組菌株,3～5分別為0.8、1.0和1.2 mmol/L IPTG 誘導條件下表達的蛋白;B:2-5分別為12、16、20和25 ℃誘導條件下表達的蛋白。M was 180 kD protein Marker;1 was pET-32a no-load total protein that has been induced;A:2 was uninduced recombinant strain;3-5 were expressed under the IPTG induction condition of 0.8,1.0 and 1.2 mmol/L,respectively;B:2-5 were the proteins expressed under the induction conditions of 12,16,20 and 25 ℃,respectively.圖4 重組蛋白NS1的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of NS1 recombinant protein

M為180 kD蛋白Marker;1為誘導后pET-32a空載總蛋白;A:2為NS1蛋白誘導后沉淀,3為NS1蛋白誘導后上清;B:2為VP2蛋白誘導后沉淀,3為VP2蛋白誘導后上清。M was 180 kD protein Marker;1 was pET-32a no-load total protein after induction;A:2 was precipitation after induction of NS1 protein,3 was supernatant after induction of NS1 protein;B:2 was precipitation after induction of VP2 protein,3 was supernatant after induction VP2 protein.圖5 重組蛋白的可溶性分析Fig.5 Soluble analysis of recombinant protein

M為DL10000 DNA Marker;A:1為重組質(zhì)粒pET-32a-NS1雙酶切產(chǎn)物;B:1為重組質(zhì)粒pET-32a-VP2雙酶切產(chǎn)物。M was DL10000 DNA Marker;A:1 was recombinant plasmid pET-32a-NS1 double digestion product;B:1 was recombinant plasmid pET-32a-VP2 double digestion product.圖2 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmids by double digestion

M為DL10000 DNA Marker;A:1為NS1蛋白基因片段的擴增,2為陰性對照;B:1～5為VP2蛋白基因片段的擴增,6為陰性對照。M was DL10000 DNA Marker;A:1 was amplification of NS1 protein gene fragment,2 was negative control;B:1-5 were amplifications of VP2 protein gene fragment,6 was negative control.圖1 S1和VP2蛋白基因的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of NS1 and VP2 protein genes

2.4 包涵體蛋白的純化與復性

將重組菌pET-32a-VP2/thansetta(DE3)和pET-32a-NS1/thansetta(DE3)分別在最佳誘導條件下誘導表達,根據(jù)蛋白純化試劑盒說明純化后,經(jīng)SDS-PAGE鑒定均得到與預期蛋白大小相符的單一條帶(圖6),表明蛋白純化成功,使用透析復性方法逐步降低蛋白復性緩沖液中尿素濃度進行復性,復性后的蛋白在無尿素的PBS緩沖液中未出現(xiàn)沉淀,表明復性效果較好,通過蛋白濃度測定得到VP2和NS1蛋白濃度分別為0.558和0.439 mg/mL。

2.5 多克隆抗體的效價測定

通過間接ELISA方法測定VP2和NS1蛋白的多克隆抗體效價,以包被空載蛋白作為對照組,以P/N≥2.1時的最大稀釋度為該2種多克隆抗體的效價。ELISA分析結果(圖7)顯示,VP2和NS1蛋白的多克隆抗體效價均為1∶10 240 000,說明VP2和NS1蛋白具有良好的免疫原性。

圖7 重組蛋白多克隆抗體的效價測定Fig.7 Polyclonal antibody titer determination of recombinant proteins

M為180 kD蛋白Marker;1為pET-32a的誘導產(chǎn)物;A:2為重組VP2蛋白的誘導產(chǎn)物;B:2為重組NS1蛋白的誘導產(chǎn)物。M was 180 kD protein Marker;1 was induction product of pET-32a;A:2 was inducible product of recombinant VP2 protein;B:2 was induction product of recombinant NS1 protein.圖8 重組蛋白的Western-blotting結果Fig.8 Western-blotting result of recombinant protein

2.6 重組 VP2和NS1蛋白及多克隆抗體的Western-blotting鑒定

將純化后的VP2和NS1蛋白進行Western-blotting鑒定,以抗His標簽抗體為一抗,結果(圖8)表明,VP2和NS1蛋白均能與抗His標簽抗體特異性結合,說明目的蛋白表達正確。以雞多克隆抗體為一抗分別進行鑒定,結果(圖9)表明,VP2和NS1蛋白均能與多克隆抗體特異性結合。

2.7 多克隆抗體的IFA鑒定

使用制備的VP2和NS1多克隆抗體進行間接免疫熒光檢測,結果(圖10)表明,在感染ChPV的LMH細胞中均觀察到特異的綠色熒光信號,而加入雞陰性血清的對照中未見熒光信號,說明VP2和NS1多克隆抗體均能與ChPV蛋白特異性結合。

3 討 論

ChPV是引起雞腸道疾病的重要病原體之一,臨床表現(xiàn)與ThPV相似,在發(fā)育遲緩綜合征(RSS)中發(fā)揮著重要作用[15]。RSS主要發(fā)生于1周齡雛雞,臨床表現(xiàn)為羽毛蓬亂、泄殖腔粘連和個體矮小,且表現(xiàn)為腹瀉并伴隨免疫障礙、發(fā)育遲緩和死亡率上升,對養(yǎng)禽業(yè)危害嚴重[8]。已有研究表明,肉雞感染ChPV后,通過實時熒光定量(qPCR)方法鑒定在其回腸、空腸和十二指腸均存在較高滴度的病毒,顯微鏡下能觀察到十二指腸絨毛變性及腸隱窩腫脹[14]。ChPV由于常與其他腸道病毒共同感染,病理特征不明顯,且在健康集群中也能檢測到ChPV,導致該病的凈化存在困難,因此迫切需要建立實驗室檢測方法。本研究進行ChPV的NS1和VP2蛋白原核表達,通過制備單克隆抗體和建立ELISA方法,可為ChPV防控提供基于血清學的實驗室檢測手段。

由于尚未發(fā)現(xiàn)合適的細胞系用于增殖培養(yǎng)ChPV,因此對于ChPV生物學特性及致病機制的了解甚少,迄今也未研制出商品化的ChPV/ThPV疫苗,針對商品雞群中ChPV/ThPV的診斷和防控主要通過PCR檢測方法進行,如Carratalà等[16]對NS1和VP1/VP2蛋白基因序列的巢式PCR檢測方法和針對VP1/VP2蛋白基因序列建立的定量PCR檢測方法進行了優(yōu)化,Finkler等[17]根據(jù)NS1蛋白基因保守序列建立了一種基于SYBR?Green的實時快速qPCR檢測ChPV的相對定量方法,廣西獸醫(yī)生物技術重點實驗室建立了針對ChPV NS1蛋白基因序列的二溫式PCR、半巢式PCR和熒光LAMP快速檢測方法[18-20],同時還建立了分別與禽腎炎病毒、新城疫病毒、禽流感病毒和弧長孤病毒的進行多重PCR檢測方法[21-24],均可為防控ChPV提供技術支持,但目前基于ChPV血清學診斷方法的研究較少。Strother和Zsak[25]通過桿狀病毒表達系統(tǒng)成功表達NS1和VP2蛋白,并建立了間接ELISA方法,Spatz等[13]將VP2蛋白基因序列進行密碼子優(yōu)化后,成功用CEF細胞進行真核表達同樣建立了間接ELISA方法,但Spatz等[13]、Strother和Zsak[25]的ELISA方法均未商品化應用。本研究采用原核表達方法成功表達ChPV的VP2和NS1蛋白,原核表達相較于真核表達及桿狀病毒表達系統(tǒng)成本更低,表達蛋白所需周期更短,能在短時間內(nèi)獲得大量目的蛋白,且同樣可用于血清學檢測,可在實際生產(chǎn)中節(jié)約大量成本。

A:為NS1蛋白多克隆抗體;B:為VP2蛋白多克隆抗體;C:為陰性血清。A was polyclonal antibody to NS1 protein;B was polyclonal antibody to VP2 protein;C was negative serum.圖10 多克隆抗體的IFA鑒定(10×)Fig.10 IFA identification of polyclonal antibodies(10×)

M為180 kD蛋白Marker;1為pET-32a的誘導產(chǎn)物;A:2為重組VP2蛋白的誘導產(chǎn)物;B:2為重組NS1蛋白的誘導產(chǎn)物。M was 180 kD protein Marker;1 was induction product of pET-32a;A:2 was inducible product of recombinant VP2 protein;B:2 was induction product of recombinant NS1 protein.圖9 多克隆抗體的Western-blotting結果Fig.9 Western-blotting results of polyclonal antibodies

本研究成功表達VP2和NS1蛋白,通過以His標簽抗體為一抗進行Western-blotting鑒定,結果表明VP2和NS1蛋白的表達和純化效果較好;通過對SPF雞免疫成功制備了VP2和NS1蛋白的多克隆抗體,間接ELISA方法測定結果顯示其效價較高,Western-blotting鑒定結果顯示VP2和NS1蛋白具有較好的免疫原性,IFA鑒定結果顯示VP2和NS1蛋白的多克隆抗體均具有良好特異性。因此,成功表達ChPV的NS1和VP2蛋白可作為后續(xù)制備單克隆抗體及建立血清學快速診斷方法的基礎材料。

4 結 論

成功表達ChPV的NS1和VP2蛋白可作為深入探究ChPV蛋白結構功能的物質(zhì)基礎,為后續(xù)單克隆抗體的制備提供基礎材料;制備的NS1和VP2蛋白多克隆抗體效價高,有望應用于臨床抗原的檢測及ELISA方法的建立。