基于膠體金免疫層析法快速檢測藍(lán)莓中的百菌清殘留

馬 琳, 趙 穎, 陳建波, 趙 莉*,

(1.上海市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，上海 201103；2.浙江昊天檢測技術(shù)服務(wù)有限公司，杭州 311122)

藍(lán)莓Semen Trigonellae杜鵑花科(Ericaceae)越橘亞科越橘屬(VacciniumLinn.)多年生果樹，落葉或常綠性灌木，其風(fēng)味獨(dú)特、營養(yǎng)豐富，被聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織列為“人類五大健康食品之一”和“最佳營養(yǎng)價值水果”[1]。上海于21 世紀(jì)初期在金山區(qū)開始引種藍(lán)莓，至2020 年底藍(lán)莓種植面積達(dá)50 hm2，其經(jīng)濟(jì)效益逐漸顯現(xiàn)，為上海市推進(jìn)鄉(xiāng)村振興、加快農(nóng)業(yè)農(nóng)村現(xiàn)代化樹立了典范。隨著藍(lán)莓商業(yè)化種植面積和年限的不斷增加，藍(lán)莓病蟲害特別是病害逐年加重，種類增多，呈多元化發(fā)生態(tài)勢，嚴(yán)重影響產(chǎn)量和產(chǎn)業(yè)發(fā)展，生產(chǎn)上除選用抗病品種、輪作換茬、避雨栽培等常規(guī)措施外，藥劑防治仍然是主要措施[2]。通過查詢中國農(nóng)藥信息網(wǎng)的農(nóng)藥登記數(shù)據(jù)[3]，截止2022 年8 月，我國尚未有農(nóng)藥在藍(lán)莓上獲得登記許可，生產(chǎn)中農(nóng)民只能憑經(jīng)驗(yàn)施藥，導(dǎo)致藍(lán)莓的質(zhì)量安全風(fēng)險較高。此外，藍(lán)莓采收期長達(dá)3 月余，每日連續(xù)采收，且沒有外果皮，屬于直接入口的鮮食水果，因此給藍(lán)莓的食用安全帶來了極大的風(fēng)險。

百菌清 (chlorothalonil，圖式1) 是一種具有多作用位點(diǎn)的保護(hù)性廣譜殺菌劑，主要用于葉面噴灑，防治多種作物如蔬菜、果樹和小麥等的多種病害。鑒于百菌清對魚類和兩棲類動物有較高風(fēng)險，且降解產(chǎn)物也可能對地下水有較高污染，歐盟于2019 年4 月29 日，發(fā)布委員會執(zhí)行法規(guī)2019/677，決定不再批準(zhǔn)百菌清原藥的續(xù)展申請[4]。安雪花等[5]研究表明，在草莓溫室中施用百菌清，對田間操作人員存在職業(yè)暴露風(fēng)險。張志恒等[6]研究發(fā)現(xiàn)，食用噴施75%百菌清可濕性粉劑 400倍液后7 d內(nèi)的草莓對2～4 歲兒童以及1 d 內(nèi)對18～30 歲女性的風(fēng)險都是不可接受的。因此，研發(fā)快速、精準(zhǔn)的百菌清殘留分析方法，是進(jìn)行有效監(jiān)管的重要環(huán)節(jié)。

圖式 1 百菌清結(jié)構(gòu)式Scheme 1 The structural formula of chlorothalonil

免疫分析法是依靠小分子半抗原與抗體或者蛋白抗原與抗體之間特異反應(yīng)的分析方法。采用各種示蹤物如酶、納米金、熒光素等對抗體或抗原進(jìn)行標(biāo)記，通過對示蹤物的測定得知免疫復(fù)合物的量，從而對免疫反應(yīng)進(jìn)行監(jiān)測[7]。構(gòu)建農(nóng)藥殘留免疫檢測方法的關(guān)鍵在于農(nóng)藥抗原和抗體的制備，而由于農(nóng)藥大多分子較小，難以引起生物體的免疫應(yīng)答，因此通常將它們與大分子蛋白質(zhì)載體結(jié)合，制備出人工抗原來刺激生物體的免疫系統(tǒng)，從而產(chǎn)生抗體。根據(jù)標(biāo)記物的不同，免疫分析技術(shù)可以分為酶聯(lián)免疫吸附分析、熒光免疫分析、化學(xué)發(fā)光免疫分析、放射免疫分析和膠體金免疫分析等，其中膠體金免疫分析由于價格低廉、方便攜帶、分析結(jié)果可肉眼辨別等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于各個檢測領(lǐng)域[8-10]。

目前，對百菌清基于膠體金免疫層析分析技術(shù) (colloidal gold immuno-chromatographic assay，GICA) 的分析報道不多，僅見鄧家軍等[11]報道了采用免疫層析法測定圓白菜和蘋果中百菌清殘留，檢出限為0.2 mg/kg；周佳等[12]采用膠體金免疫層析法檢測果蔬中百菌清，檢出限為3 mg/kg。本研究以前期設(shè)計的半抗原制備的抗百菌清高特異性、高親和力單克隆抗體為材料，建立了半定量膠體金免疫層析試紙條分析方法，實(shí)現(xiàn)裸眼觀察判斷百菌清殘留；同時，建立了基于超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 (UPLC-MS/MS) 的檢測方法，以藍(lán)莓樣品為對象進(jìn)行了方法的驗(yàn)證，表明兩種檢測方法配合使用可以實(shí)現(xiàn)對百菌清的精準(zhǔn)、快速檢測，優(yōu)勢互補(bǔ)。其中，膠體金免疫層析試紙快速、方便，能用于現(xiàn)場檢測，UPLC-MS/MS 方法準(zhǔn)確、靈敏，可用于大量樣品的高通量定量檢測。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、試劑與供試材料

Agilent 1290 UPLC-Agilent 6460 MS/MS 超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：配APCI 源(UPLC-MS/MS，美國安捷倫公司)；離心機(jī)(TDL-5-A，上海安亭科學(xué)儀器廠)；Milli Q 超純水系統(tǒng)(德國默克公司)；旋渦混合器(SCI LoGex MX-S，上海珂淮儀器有限公司)；紫外可見分光光度計(UV-7504 PC，上海精密儀器儀表有限公司)；透射電子顯微鏡(Talos F200X S/TEM，賽默飛世爾科技(中國)有限公司) ；金標(biāo)免疫層析讀數(shù)儀(杭州和邁科技有限公司)。

百菌清單克隆抗體 (浙江大學(xué)研制)；1000 mg/L百菌清標(biāo)準(zhǔn)品、1000 mg/L 4-羥基百菌清標(biāo)準(zhǔn)品、1000 mg/L 五氯硝基苯標(biāo)準(zhǔn)品、1000 mg/L 多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品和1000 mg/L 腐霉利標(biāo)準(zhǔn)品 (農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心 (天津) )；乙腈 (色譜純，德國Merck)；鹽酸 (國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；牛血清蛋白BSA (MW67000)、羊抗鼠IgG、鑰孔血藍(lán)蛋白BCP (MW500000) (華美生物工程公司)；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、N,N-二環(huán)已基碳二亞胺(DCC)、N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)、N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS) (中國醫(yī)藥 (集團(tuán)) 上海化學(xué)試劑公司)；NANO 分散型固相萃取柱(博納艾杰爾科技有限公司)；MAS-QuEChERS 分散型固相萃取柱(博納艾杰爾科技有限公司)。藍(lán)莓購于當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試紙條的材料制備及組裝檢測

1.2.1.1 百菌清全抗原制備 首先，在百菌清苯環(huán)上兩個 -CN 之間引入氨基己酸基團(tuán)，替代之前的氯原子，按照文獻(xiàn)[13]方法合成百菌清半抗原，如圖式2 所示。

圖式 2 百菌清半抗原的制備示意圖Scheme 2 Schematic of synthesis pathway of the hapten of chlorothalonil

然后，采用活化酯法和混合酸酐法[14]將百菌清半抗原與BSA 偶聯(lián)制備競爭抗原，與BCP 偶聯(lián)制備免疫抗原：1) 稱取0.022 mmol 百菌清半抗原20 mg，用1.6 mL DMF 溶解后逐滴加入0.2 mL DMF 溶液 (含有1.8 μmol NHS 和12 μmol DCC)中，室溫下攪拌過夜，將反應(yīng)后的混合液于4000 r/min 下離心10 min，取上清液即為半抗原活性酯溶液。2) 先將0.24 μmol BSA[n(半抗原) :n(BSA) =20 : 1]溶解于3 mL 0.05 mol/L 的碳酸鹽緩沖液(CBS) 中，另取0.006 μmol BCP[n(半抗原) :n(BCP) = 100 : 1] 溶解于750 μL 0.05 mol/L 的CBS 中，然后分別加入到上述1.6 mL 百菌清半抗原活性酯溶液中，室溫條件攪拌下反應(yīng)4 h。3) 將反應(yīng)完成后的溶液裝入到預(yù)處理好的透析袋中，用0.01 mol/L 的磷酸鹽緩沖液 (PBS) 透析3 d。將得到的反應(yīng)物透析，分裝后于120 ℃保存，備用。4) 采用微量板酶標(biāo)儀測試偶聯(lián)物、蛋白和半抗原的吸光度，按 (1) 式計算3 種溶液的摩爾吸光系數(shù)ε，按 (2) 式計算偶聯(lián)比 (K)。

式中：ε為摩爾吸光系數(shù)L/(mol·cm)；Abs為吸光度，L/(g·cm)；ρ為質(zhì)量濃度，%；Mr為摩爾分子質(zhì)量；K為偶聯(lián)比；IC 為偶聯(lián)物；pro 為蛋白；hap 為半抗原。

1.2.1.2 膠體金的制備 膠體金的制備采用檸檬酸三鈉還原法[15]。將1000 mL 待還原的體積分?jǐn)?shù)為0.01%的氯金酸溶液倒入三口圓底燒瓶中，磁力攪拌器中加熱，待氯金酸溶液沸騰時迅速注入12～30 mL 體積分?jǐn)?shù)為1%的檸檬酸三鈉溶液，攪拌反應(yīng)8 min，待反應(yīng)液變?yōu)轷r亮的酒紅色時停止加熱，制備得到膠體金溶液，置于試劑瓶中4 ℃保存。采用紫外分光光度計對膠體金顆粒進(jìn)行掃描，測定400～600 nm 波長范圍內(nèi)的最大吸收峰，并采用透射電子顯微鏡觀察鑒定膠體金顆粒的粒徑及分散性。

1.2.1.3 膠體金標(biāo)記抗體探針的制備 用浙江大學(xué)提供的百菌清單克隆抗體對上述制備的膠體金進(jìn)行標(biāo)記：用10 mmol/L 碳酸鉀溶液將10 mL 膠體金溶液調(diào)節(jié)至合適的pH 值后，將3 μL 50 mg/L的百菌清單克隆抗體用雙蒸水 (dd H2O) 稀釋至1 mL后逐滴加入，邊加邊攪拌使抗體與膠體金顆粒均勻混合，室溫條件下靜置60 min；加入1.25 mL封閉液[m(BSA) :m(PEG) :m(ddH2O) = 10 : 1 :89] 進(jìn)行60 min 的封閉反應(yīng)；通過離心 (4 ℃、10000 r/min、30 min) 除去游離抗體，用洗滌液復(fù)溶，將復(fù)溶液[m(BSA) :m(PEG) :m(ddH2O) =1 : 0.1 : 98.9]再次離心，用儲存液[m(蔗糖) :m(BSA) :m(PEG) :m(ddH2O) = 5 : 1 : 0.1 : 93.9]定容至1 mL，4 ℃保存，保存期為30 d。

1.2.1.4 膠體金免疫試層析紙條的組裝 完整的試紙條包括聚氯乙烯 (PVC) 底板、吸水墊、NC 膜、金標(biāo)墊和樣品墊 (圖1)。將NC 膜貼在PVC 底板的中間，用噴膜儀在NC 膜上分別噴涂百菌清競爭抗原 (百菌清-BSA) 和羊抗鼠二抗 (IgG)，作為檢測線 (T) 和質(zhì)控線 (C)，T 線和C 線間隔6 mm；金標(biāo)抗體結(jié)合墊和吸水墊于NC 膜兩端重合1～2 mm 貼在PVC 底板上，金標(biāo)結(jié)合墊貼靠近檢測線 (T) 端，吸水墊靠近質(zhì)控線 (C) 端；樣品墊與金標(biāo)結(jié)合墊重合1～2 mm 貼在 PVC 底板上，組裝完畢后用切條機(jī)將整板的試紙切成3 mm 寬的條狀，即制成金標(biāo)試紙條，將試紙條裝入帶干燥劑的密封袋中，4 ℃密封干燥保存。

圖1 膠體金免疫層析試紙條構(gòu)成截面圖Fig.1 Cross section of the colloidal gold immuno-chromatographic test strip

1.2.1.5 膠體金免疫試層析紙條檢測結(jié)果的判定

向樣品墊中滴加約75 μL 待測樣品液或不同濃度的百菌清標(biāo)準(zhǔn)品溶液 (20%甲醇-PBS 緩沖液稀釋配制)，5 min 后裸眼觀察判定檢測結(jié)果，如圖2所示。1) 當(dāng)待測液中不含百菌清或濃度極低不足以檢出時，金標(biāo)抗體與固定于T 線上的競爭抗原結(jié)合，形成肉眼可見的紅色條帶，同時，過量的金標(biāo)抗體與C 線上固定的羊抗鼠 (IgG) 抗體結(jié)合，形成肉眼可見的紅色條帶，此時T 線與C 線均為紅色條帶，結(jié)果判定為陰性；2) 當(dāng)待測液中百菌清濃度高于檢出限時，百菌清優(yōu)先與金標(biāo)抗體結(jié)合，導(dǎo)致T 線顏色變淺 (淺于C 線顏色) 或不顯色，而免疫復(fù)合物或者多余的金標(biāo)抗體與C 線上固定的羊抗鼠 (IgG) 抗體結(jié)合顯紅色，結(jié)果判斷為陽性；3) 當(dāng)C 線不顯色時，無論T 線是否顯色，均判為試紙條失效。

圖2 百菌清免疫層析試紙條檢測結(jié)果判定示意圖Fig.2 Schematic diagram for determination of test results of chlorothalonil immuno-chromatographic strip

1.2.2 試紙條參數(shù)及檢測條件的優(yōu)化 為了實(shí)現(xiàn)最佳的檢測靈敏度、穩(wěn)定性與顯色效果，分別對幾個重要參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，包括膠體金顆粒的粒徑、標(biāo)記pH 值、抗體的標(biāo)記濃度、探針的標(biāo)記量和檢測線的包被濃度等 (表1)，在優(yōu)化過程中，分別在無藥物以及0.01 mg/L 的百菌清質(zhì)量濃度下進(jìn)行測試。

表1 試紙條參數(shù)優(yōu)化表Table 1 Optimization parameters of the test strip

1.2.3 樣品檢測

1.2.3.1 檢測條件 色譜條件：Agilent Proshell 120 EC-C18不銹鋼色譜柱 (3 mm × 100 mm，2.7 μm)；流動相A 為乙腈，B 為5.0 mmol/L 甲酸銨水溶液；流速0.7 mL/min。梯度洗脫程序：0～0.5 min，10% A～30% A；＞0.5～1 min，30% A～50% A；＞1～3 min，50% A～90% A；＞3～5 min，90% A；＞5～5.5 min，90% A～10% A。進(jìn)樣量10 μL。

質(zhì)譜條件：APCI 源；負(fù)離子掃描模式；多反應(yīng)監(jiān)測模式；鞘氣溫度325 ℃；鞘氣流量4 L/min；霧化氣壓力0.4 MPa；毛細(xì)管電壓3500 V。百菌清定性離子對 (m/z)：244.9/181.9 及244.9/146.8，定量離子對 (m/z) 244.9/146.8，碎裂電壓120 V，碰撞能量35/35 V。

1.2.3.2 樣品前處理 稱取10 g (精確至0.01 g)藍(lán)莓樣品至100 mL 具塞塑料離心管內(nèi)，加入1 mL體積分?jǐn)?shù)為10%的鹽酸溶液旋渦混合1 min；加入10 mL 乙腈，高速勻漿1 min 后加入3 g 氯化鈉，旋渦混合1 min，以4000 r/min 離心5 min；取2 mL 上清液，過0.22 μm 有機(jī)系濾膜后分成兩份：一份供UPLC-MS/MS 檢測；另一份用ddH2O稀釋20 倍后進(jìn)行膠體金試紙條測試，并與UPLCMS/MS 結(jié)果進(jìn)行對比。

1.2.4 試紙條性能評價

1.2.4.1 靈敏度評價 向藍(lán)莓空白樣品中分別添加0、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5 和1 mg/kg 7 個水平的百菌清標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個水平重復(fù)5 次，按照1.2.3.2 節(jié)的方法提取樣品。分別取75 μL 樣品提取液用于試紙條檢測，T 線不顯色時的百菌清濃度即為試紙條的肉眼觀察檢出限(LOD)。

1.2.4.2 特異性評價 將百菌清的代謝物4-羥基百菌清、結(jié)構(gòu)類似物 (五氯硝基苯) 及功能類似物(多菌靈和腐霉利) 分別配制成0.1 mg/L 和1 mg/L，用試紙條檢測，觀察試紙條的交叉反應(yīng)情況。

1.2.4.3 準(zhǔn)確性評價 實(shí)驗(yàn)室添加陽性樣本的假陰性率：向藍(lán)莓空白樣品中分別添加0.1、0.2、0.5 和1 mg/kg 4 個水平的百菌清標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個水平重復(fù)5 次，測定方法判定的假陰性率。

田間陽性樣本的假陰性率：選擇在基地生產(chǎn)過程中未噴灑過農(nóng)藥百菌清的藍(lán)莓植株，按照75%百菌清可濕性粉劑有效成分1642.5 g/hm2的劑量施藥，于藥后3 d 采摘，先用UPLC-MS/MS法對百菌清殘留量進(jìn)行測定，再將樣品稀釋到產(chǎn)品肉眼觀察檢出限的0.5、1.0、2.0 倍水平，每個檢出水平做10 個重復(fù)。

驗(yàn)證結(jié)果用《食品快速檢測方法評價技術(shù)規(guī)范》[16]來評價膠體金方法的靈敏度、特異性、假陽/陰性率和與參比方法一致性。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫抗原和競爭抗原的鑒定

采用紫外分光光度法 (240～400 nm) 掃描百菌清半抗原、載體蛋白BCP、BSA 及偶聯(lián)物競爭抗原、免疫抗原。結(jié)果表明，競爭抗原 (半抗原-BSA) 和免疫抗原 (半抗原-BCP) 有明顯的吸收峰偏移，表明偶聯(lián)成功。計算競爭抗原和免疫抗原的偶聯(lián)比分別為18 和36。

2.2 膠體金探針的制備

抗體標(biāo)記是影響膠體金免疫層析方法性能最為關(guān)鍵的技術(shù)要點(diǎn)，因此重點(diǎn)研究了膠體金粒徑大小、抗體標(biāo)記pH 值以及標(biāo)記量對膠體金探針穩(wěn)定性與生物活性的影響。

2.2.1 膠體金制備 金納米顆粒的大小與形狀對膠體金顏色、穩(wěn)定性、試紙條的顯色效果以及檢測靈敏度有顯著影響[17]。本研究用傳統(tǒng)的檸檬酸鈉鹽還原法制備膠體金，通過改變氯金酸與檸檬酸三鈉的比例來控制膠體金的粒徑大小。設(shè)計了3 種不同的投料比，分別在1000 mL 0.01%氯金酸溶液中添加30、15 和12 mL 0.1% 的檸檬酸三鈉。通過紫外分光光度計對膠體金顆粒進(jìn)行可見光范圍 (400～600 nm) 掃描，測得其最大吸收波長λmax分別為516、521、525 nm，并用透射電子顯微鏡測定膠體金顆粒粒徑，觀察其粒徑分布在15、25、35 nm 左右，大小均一性較佳。根據(jù)試紙條顯色亮度，15 nm 粒徑的膠體金顯色較淺，而35 nm 粒徑顯色偏紫黑 (圖3)，這種容易出現(xiàn)聚沉的現(xiàn)象也導(dǎo)致了較大的批間差異。故從膠體金的顏色、試紙條的顯色程度以及靈敏度等方面綜合考慮，選擇投料比為n(0.01% 氯金酸溶液) :n(0.1%檸檬酸三鈉) = 1000 : 15，粒徑為25 nm 粒徑的膠體金用于標(biāo)記單克隆抗體。

圖3 不同粒徑膠體金的試紙條顯色亮度情況Fig.3 Color development of test strips based on colloidal gold with different particle sizes

2.2.2 最佳標(biāo)記pH 值的優(yōu)化 蛋白分子在其標(biāo)記pH 值為蛋白等電點(diǎn)pI 附近時可最大程度地吸附在金表面上[18]。本研究將百菌清單克隆抗體溶液加入到以10 mmol/L 碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)的不同pH 值的膠體金溶液中，然后加入0.1 mL 10% 氯化鈉溶液，靜置0、15、30、60 min，分別測定氯化鈉加入前、后不同靜置時間點(diǎn)的吸光度值 (OD521nm)。結(jié)果表明，當(dāng)1 mL 膠體金溶液加入8 μL 10 mmol/L碳酸鉀時，膠體金溶液的pH 值為6.5，此時氯化鈉加入前后4 個時間點(diǎn)吸光度變化的變異系數(shù)(CV) 最小，此即膠體金顆粒與百菌清單克隆抗體結(jié)合的最佳標(biāo)記pH 值。

2.2.3 抗體標(biāo)記濃度、探針體積與檢測線濃度優(yōu)化

2.2.3.1 抗體最佳標(biāo)記濃度優(yōu)化 檸檬酸根保護(hù)的膠體金顆粒外層帶有負(fù)電荷，在靜電作用下，膠體金溶液為穩(wěn)定的膠體狀，在加入10% 氯化鈉時，由于高濃度鹽離子的作用，膠體金溶液發(fā)生聚沉，由均一的酒紅色變?yōu)樗{(lán)色?？贵w蛋白可通過物理吸附與檸檬酸根包裹的膠體金結(jié)合，增加分子間距，在較高濃度鹽離子下，使膠體金顆粒仍能保持良好的分散性。鹽析誘導(dǎo)沉聚實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)抗體標(biāo)記質(zhì)量濃度≥50 μg/mL 時，在鹽析作用下，膠體金標(biāo)記的抗體仍保持穩(wěn)定，溶液顏色與原膠體金溶液顏色一致，且氯化鈉加入前后吸光度變化的CV 值最先低于15%，即百菌清單克隆抗體最佳標(biāo)記質(zhì)量濃度為50 μg/mL。

2.2.3.2 試紙條探針體積優(yōu)化 分別在試紙條金標(biāo)結(jié)合墊上添加1、2、3、5 μL 的百菌清金標(biāo)抗體溶液，測試空白樣品及含0.01 mg/L 百菌清的20%甲醇PBS 溶液，觀察試紙條的顯色情況與抑制情況。結(jié)果 (圖4) 表明，百菌清金標(biāo)抗體溶液用量為3 μL 時，紙條顯色較亮且抑制明顯易于觀察，因此選擇3 μL 為金標(biāo)探針最適附著量。

圖4 百菌清金標(biāo)抗體不同添加量的試紙條顯色情況Fig.4 Color development of test strips with different amounts of chlorothalonil gold labeled antibody

2.2.3.3 試紙條檢測線與質(zhì)控線試劑的工作濃度優(yōu)化 優(yōu)化了硝酸纖維素膜 (NC 膜) 上的百菌清競爭抗原 (T 線) 和羊抗鼠二抗包被 (C 線) 的工作濃度。當(dāng)T 線百菌清競爭抗原的質(zhì)量濃度為1 mg/L、噴涂量為0.9 μL/cm 時，空白對照測試時T 線顯色灰度值達(dá)到1000 左右，百菌清標(biāo)準(zhǔn)溶液0.01 mg/L測試時T 線顯色灰度值≤100，此即最佳抗原工作濃度；當(dāng)最優(yōu)C 線羊抗鼠二抗質(zhì)量濃度為0.1 mg/L、噴涂量為0.9 μL/cm 時，C 線顯色效果與測試線顯色灰度值最接近，此即最佳二抗包被工作濃度。

2.3 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇 百菌清在中性條件下穩(wěn)定性較差，為提高樣品提取過程中百菌清的穩(wěn)定性和回收率，通常在樣品中加入硫酸[19]等強(qiáng)酸調(diào)節(jié)提取環(huán)境至酸性。本研究中對傳統(tǒng)QuEChERS方法 (AOAC 2007.01) 的前處理步驟進(jìn)行改進(jìn)，用鹽酸替代乙酸/乙酸鈉緩沖鹽。比較了加入不同體積酸度調(diào)節(jié)劑 (10%鹽酸) 時目標(biāo)分析物的回收率。結(jié)果 (圖5) 顯示，當(dāng)不添加酸度調(diào)節(jié)劑時，百菌清的回收率不足40%，隨著酸度調(diào)節(jié)劑添加量增大，百菌清回收率逐步改善，當(dāng)添加量高于1 mL 時百菌清平均回收率可以穩(wěn)定在90%以上。故最終選擇以1 mL 10%的鹽酸溶液為酸度調(diào)節(jié)劑加入10 g 藍(lán)莓樣品。

2.3.2 樣品提取液凈化 藍(lán)莓中含有大量花青素，提取液顏色較深，如果不進(jìn)行適當(dāng)?shù)膬艋幚?，會?yán)重影響試紙條的顯色。常用增大基質(zhì)稀釋倍數(shù)或固相吸附凈化等方法降低提取液中色素干擾。本研究以百菌清添加濃度為0.1 mg/kg 的藍(lán)莓樣品為例，考察了不同稀釋倍數(shù)和不同固相吸附劑的凈化效果。試驗(yàn)設(shè)計了5 倍、10 倍、20 倍ddH2O 稀釋；加入質(zhì)量體積比為2%、5%、10%的PSA 凈化，離心后上清液用ddH2O 稀釋20 倍；以及使用NANO 和MAS-QuEChERS 兩種商品化固相吸附凈化管進(jìn)行凈化，離心后上清液用ddH2O稀釋20 倍，結(jié)果如圖6 所示。提取液用ddH2O稀釋5 倍和10 倍時，由于待測液中乙腈含量偏高導(dǎo)致試紙條失效，當(dāng)ddH2O 稀釋20 倍時，試紙條C 線顯色正常且T 線消失，檢測結(jié)果為陽性；比較不同質(zhì)量體積比PSA 對樣品凈化效果及靈敏度影響發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PSA 用量超過5%時，試紙條T 線不消失，考慮是凈化劑用量過多對目標(biāo)農(nóng)藥有吸附；使用兩種商品化凈化管結(jié)果顯示，NANO 凈化管對色素的凈化效果與MAS-QuEChERS 相當(dāng)，但由于MAS-QuEChERS 凈化劑填料過多，對目標(biāo)農(nóng)藥有吸附，因此造成結(jié)果假陰性。綜上，選取ddH2O 稀釋20 倍為樣品提取液凈化方法，該方法簡單易操作，且成本相對較低。

2.4 試紙條性能的評價

2.4.1 靈敏度 按照1.2.4.1 節(jié)方法，向藍(lán)莓空白樣品中添加不同水平百菌清標(biāo)準(zhǔn)溶液，并按照1.2.3 節(jié)的方法提取樣品，檢測結(jié)果如圖7 所示，藍(lán)莓基質(zhì)在稀釋20 倍后對試紙條均無影響，肉眼觀察檢出限為0.1 mg/kg，表明添加水平 ≥ 0.1 mg/kg時，樣品經(jīng)酸化后乙腈提取，純水稀釋20 倍后，檢測結(jié)果為陽性。

圖7 添加樣品中百菌清的試紙條檢測結(jié)果Fig.7 Results of strip test for chlorothalonil in spiked samples

2.4.2 特異性 在上述的最佳條件下，按照1.2.4.2 節(jié)方法采用百菌清試紙條百菌清、百菌清的代謝物 (4-羥基百菌清) 及其結(jié)構(gòu)與功能的類似物 (五氯硝基苯、多菌靈、腐霉利)。通過試紙條顯色情況評估此速測方法的交叉反應(yīng)情況。結(jié)果表明，只有測試0.1 mg/L 和1 mg/L 的百菌清標(biāo)準(zhǔn)溶液時，T 線消失 (圖8)，表明此試紙條對百菌清有較高的特異性，可用于百菌清的特異性檢測。

2.4.3 準(zhǔn)確性

2.4.3.1 UPLC-MS/MS 方法驗(yàn)證 按照1.2.3 節(jié)的方法提取樣品，得到空白基質(zhì)溶液，用該空白基質(zhì)溶液將標(biāo)準(zhǔn)工作溶液稀釋成0.01、0.1、0.2、0.5、1 mg/L 的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行UPLCMS/MS 分析，外標(biāo)法定量。以百菌清的峰面積為縱坐標(biāo) (y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) (x)，繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果如表2 所示，百菌清在0.01～1 mg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，決定系數(shù) (R2) 均大于 0.99。

表2 采用UPLC-MS/MS 法測定百菌清的添加回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差、線性方程、決定系數(shù)和定量限Table 2 Recoveries, RSDs, linear equations, R2 and LOQs for chlorothalonil by UPLC-MS/MS

向藍(lán)莓空白樣品中分別添加0.01、0.1、0.2、0.5 和1.0 mg/kg 5 個水平的百菌清標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個水平重復(fù)5 次。結(jié)果 (表2) 表明：百菌清的平均回收率為81%～96%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD) 為8.9%～13.9%，方法定量限0.01 mg/kg。本研究所建立的殘留檢測方法可滿足《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》[20]的要求，適用于百菌清在藍(lán)莓中的殘留分析研究。

2.4.3.2 免疫層析方法驗(yàn)證

1) 實(shí)驗(yàn)室添加陽性樣本的假陰性率

按照1.2.4.3 節(jié)方法，向藍(lán)莓空白樣品中添加不同水平百菌清標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于實(shí)驗(yàn)室添加陽性樣本的假陰性率檢測。結(jié)果 (表2)表明，使用百菌清試紙條檢測藍(lán)莓中百菌清殘留時無假陰性現(xiàn)象，假陰性率均為0。

2) 市場監(jiān)測假陽性率

市場隨機(jī)抽檢40 份藍(lán)莓樣品，并用UPLCMS/MS 確認(rèn)濃度低于膠體金的最低檢出含量，再用膠體金試紙條進(jìn)行檢測以驗(yàn)證其假陽性率。結(jié)果顯示，40 份藍(lán)莓樣品未有百菌清檢出，膠體金法假陽性率均為0。

3) 田間陽性樣本的假陰性率

本試驗(yàn)在基地選擇生產(chǎn)過程中未使用過百菌清的藍(lán)莓，噴灑主要藥效成分為百菌清的農(nóng)藥產(chǎn)品，于噴灑后3 d 采摘新鮮果實(shí)，先用UPLCMS/MS 法對百菌清殘留量進(jìn)行測定，再分別將樣品稀釋到百菌清試紙條最低檢出限的0.5 倍、1.0 倍、2.0 倍水平。每個檢出水平做10 個重復(fù)。驗(yàn)證結(jié)果用《食品快速檢測方法評價技術(shù)規(guī)范》[15]來評價膠體金方法的靈敏度、特異性、假陽/陰性率和與參比方法的一致性，結(jié)果如表3 所示。田間陽性樣品驗(yàn)證百菌清的假陽性率和假陰性率均為0，與參比方法均無顯著性差異 (χ2＜3.84)。

表3 百菌清的田間陽性樣品的驗(yàn)證結(jié)果Table 3 Verification results of positive field samples of chlorothalonil

3 結(jié)論與討論

本研究構(gòu)建了快速準(zhǔn)確檢測藍(lán)莓中百菌清殘留的膠體金免疫層析試紙條方法，肉眼觀察檢出限為0.1 mg/kg，相比于鄧家軍等[11]報道的采用免疫層析法測定圓白菜和蘋果中百菌清殘留 (檢出限0.2 mg/kg) 及周佳等[12]報道的采用膠體金免疫層析法檢測果蔬中百菌清殘留 (檢出限為3 mg/kg)，本方法靈敏度更高，分析時間更短，整個過程能在15 min 內(nèi)完成。此外，與UPLC-MS/MS 測試結(jié)果比對表明，方法的假陽性率、假陰性率都能滿足快速檢測方法評價要求，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。本研究的百菌清膠體金免疫層析試紙條方法特異性高，對樣品中4-羥基百菌清、五氯硝基苯、多菌靈和腐霉利的檢測不存在交叉反應(yīng)。該方法耗時短、操作簡便，無需大型設(shè)備儀器，適合上市前自測及基層農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)督，具有應(yīng)用價值。