高效液相色譜-高錳酸鉀氧化化學(xué)發(fā)光法測定水中的痕量苯二酚研究

鄧依婷

（廣東省中山生態(tài)環(huán)境監(jiān)測站，廣東中山 528400）

苯二酚是一種有機物，常用在顯影劑、橡膠防老劑、食品穩(wěn)定劑、石油抗凝劑中，應(yīng)用領(lǐng)域廣泛。但苯二酚也是一種具有較高毒性的會對環(huán)境和人體有極大危害的物質(zhì)，其一般是以微量形式存在于植物或水體中，一旦被人體吸入或食入，會對人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝功能等有抑制作用。因此在環(huán)境監(jiān)測、食物檢驗等方面，有效測定苯二酚非常重要。

常規(guī)測定苯二酚的方法有氣相色譜法、液相色譜法、化學(xué)發(fā)光法等，不同的測定方法均有各自的優(yōu)缺點。其中，采用氣相色譜法進行苯二酚測定，雖能檢測出苯二酚異構(gòu)體，但若是在進樣溫度一致的前提下，苯二酚會轉(zhuǎn)變?yōu)楸锦?，使得檢測誤差發(fā)生的概率增加；液相色譜法是以液體作為流動相的色譜法，這一測定方法無法通過色譜圖直接給出未知物的定性結(jié)構(gòu)，需要有已知標準進行對照參考，當在對照無純物質(zhì)時，難以進行定性鑒定，此時就需要借助紅外、質(zhì)譜和化學(xué)法等來配合，且對于一些穩(wěn)定性較差的物質(zhì)難以實現(xiàn)有效分析，因此需要高效液相色譜法來克服困難。但高效液相色譜法一般是紫外檢測，靈敏度相對較低；而化學(xué)發(fā)光法可實現(xiàn)苯二酚總量的測定，其優(yōu)點是靈敏度高、準確度高、儀器設(shè)備簡單、操作簡便快速等，對比高效液相色譜法，有更高的選擇性。因此化學(xué)發(fā)光法尤其是高效液相色譜-化學(xué)發(fā)光柱后法受到了廣泛關(guān)注。

我國對于酚類化合物的化學(xué)發(fā)光分析做了相應(yīng)的研究，但較多是對基體成分簡單的溶液中的單組分酚進行測定分析，對于高效液相色譜-化學(xué)發(fā)光柱后檢測分析混合酚的研究較少。對此，構(gòu)建了高效液相色譜法-化學(xué)發(fā)光柱后法用以測定苯二酚，以期實現(xiàn)痕量苯二酚的有效測定，同時希望能為關(guān)于酚類化合物測定分析提供一定的參考。

1 高效液相色譜法

高效液相色譜法主要是指以高壓液體為流動性的液相色譜分析法，該種方式是從20世紀70年代初形成的一種新型色譜分離分析技術(shù)，本身有著選擇性良好、靈敏程度極高、分析速度快、適用范圍廣等一系列特征，比較適合應(yīng)用在高沸點、不穩(wěn)定有機及生化試樣的分離分析環(huán)節(jié)中。采取高壓泵將有著一定極性的單一溶液或者是不同比例的混合溶液泵裝到填充劑的色譜柱內(nèi)，被流動相帶入色譜柱內(nèi)加以分離，然后進入檢測器，借助記錄儀或者數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號，分析數(shù)據(jù)獲取準確的分析結(jié)果，按照固定相的不同可以將高效液相色譜法分為多方面，分別是液色譜法和液-固色譜法以及凝膠色譜法。從實際情況來看，高效液相色譜法是在氣相色譜和經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上形成的現(xiàn)代液相色譜，和經(jīng)典液相色譜沒有明顯的區(qū)別，不同點是現(xiàn)代液相色譜效率極高，能夠達到自動化操作的目的，高效液相色譜的原理與經(jīng)典液相色譜是相同的，不過它采用了高效色譜柱高壓輸液泵以及高靈敏度的檢測器等，因此可以進一步提升高效液相色譜的分離效率、分析速度以及靈敏度，在借助計算機技術(shù)的基礎(chǔ)上逐漸發(fā)展成為自動化和智能化的現(xiàn)代分析儀器。雖然氣相色譜法是一項較好的分離和分析方式，有著分析速度快和分離效能好的特征，然而從實際情況來看，氣相色譜法只可以分析處于操作溫度下可以氣化而不分解的物質(zhì)。高效液相色譜法將經(jīng)典色譜法與氣相色譜法進行了融合，在技術(shù)層面使流動相成為高壓輸送相，色譜柱則用特殊的方法用小粒徑填料進行填充，柱效要比經(jīng)典液相色譜法更優(yōu)，且柱后連接有靈敏度高的檢測器，可實現(xiàn)對流出物的連續(xù)檢測。

具體來看，高效液相色譜法主要具有這幾個方面的特征：①高壓性，流動相為高壓輸送，最高輸送壓力可達29.4MPa，可使液體快速通過色譜柱；②高速性，對比經(jīng)典色譜法，高效液相色譜法的流動相在柱內(nèi)的流速更快，且分析所需要的時間也較少；③高效性，這一特征主要體現(xiàn)在其分離效率較高，在發(fā)展過程中還會形成較多新型的固定相，進而有效提高分離效率；④高靈敏性，這是因為廣泛應(yīng)用了靈敏度較高的檢測器，可有效提升分析的靈敏度，如常用的熒光檢測器，其靈敏度可達10~12g/mL，可有效檢測出有熒光的化合物；⑤應(yīng)用范圍廣泛，對比氣相色譜法和高效液相色譜法，雖然氣相色譜法具有分離能力強、靈敏度高、分析速度快速等優(yōu)點，但受到技術(shù)方面的現(xiàn)狀，對于一些沸點較高的物質(zhì)或者穩(wěn)定性較差的物質(zhì)，難以實現(xiàn)有效的分析。而高效液相色譜法靈敏度高，且在實際應(yīng)用過程中只需要將試樣制作成為溶液，不需要氣化，因此不受試樣的揮發(fā)性限制，這樣對于沸點較高、穩(wěn)定性較差、不經(jīng)常揮發(fā)的有機物，便可應(yīng)用高效液相色譜法進行分離分析。高效液相色譜法應(yīng)用極為廣泛，在高分子化合物、生物活性物質(zhì)以及經(jīng)常分解、沸點高、不經(jīng)常揮發(fā)的物質(zhì)中應(yīng)用非常普遍，并且該項方式也依靠自身優(yōu)勢被引進了生物醫(yī)學(xué)、石油化工以及食品等多項領(lǐng)域內(nèi)。在液相色譜儀中，包含了多種類型的裝置，分別表現(xiàn)為紫外檢測裝置和光電二極管陣列檢測裝置，兩者是經(jīng)常使用的檢測系統(tǒng)。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

高效液相色譜化學(xué)發(fā)光檢測系期間使用的實驗儀器主要有：輸液泵、通閥進樣器、化學(xué)發(fā)光檢測器、蠕動泵等；使用的實驗試劑主要有：固相萃取小柱3mL、乙腈色譜純、鄰苯二酚、間苯二酚和對苯二酚、分析純、B-環(huán)糊精、高錳酸鉀、甲酸、硫酸、磷酸等；實驗用水為超純水，通過純水系統(tǒng)制備而成。

苯二酚標準溶液制備：稱取0.01g的苯二酚用水定容于100mL容量瓶中；稱取3.95g高錳酸鉀用水定容于250mL容量瓶中；用1.0mol/L硫酸將溶液稀釋獲得100mg/L的苯二酚標準溶液；所制得的標準溶液存儲在4℃冰箱中。

2.2 色譜條件

色譜柱150mm×4.6mm，5μm、流動相：甲醇0.1mmol/L、環(huán)糊精水溶液、體積比為30：70、流速0.6mL/min、進樣體積50μL。

2.3 樣品前處理

取200mL水樣，用0.45目的濾膜對水樣進行過濾，將水樣中存在的顆粒物去除，隨后用硫酸將其pH調(diào)整至1.5~2.0。依次用10mL甲醇對固相萃取小柱進行水活化，之后通過真空抽吸上樣。待水樣完全通過固相萃取小柱后，還需繼續(xù)抽吸，目的是去除柱內(nèi)的殘余水分。最后用2.0mL甲醇對柱上的苯二酚洗脫吸附，收集洗脫液以備后續(xù)測定使用。

2.4 操作過程

將高錳酸鉀溶液與甲酸溶液經(jīng)混合管進行充分混合，隨后與色譜柱洗脫液一同進入到發(fā)光檢測系統(tǒng)中，待基線平穩(wěn)后，在流動相注入50μL苯二酚試樣中進行色譜分離，待有效分離之后，與混合液在檢測系統(tǒng)流通池中發(fā)生反應(yīng)，從而形成化學(xué)發(fā)光。最后用光電倍增管對發(fā)光信號進行檢測，色譜工作站形成色譜圖，根據(jù)峰值進行定量分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 高錳酸鉀濃度與化學(xué)發(fā)光強度的關(guān)系

分析高錳酸鉀濃度對化學(xué)發(fā)光強度的影響可得知，高錳酸鉀的濃度越大，發(fā)光強度越強，但在高錳酸鉀濃度為0.6mol/L時，發(fā)光強度達到最大值，若增加高錳酸鉀的濃度，發(fā)光強度會有所降低。分析這一現(xiàn)象產(chǎn)生的原因，主要是高錳酸鉀自身形成的吸光作用。所以在具體的實驗分析過程中，需合理確定高錳酸鉀的濃度，宜為0.60mmol/L。

3.2 反應(yīng)介質(zhì)與化學(xué)發(fā)光強度的關(guān)系

基于酸性條件下，高錳酸鉀氧化發(fā)光反應(yīng)介質(zhì)主要有鹽酸、硝酸、硫酸、磷酸、多聚磷酸等。經(jīng)過相關(guān)實驗研究得知，在硫酸介質(zhì)中發(fā)光信號最為穩(wěn)定。進一步分析硫酸濃度對發(fā)光強度的影響，得知在硫酸濃度為1.0mol/L時，發(fā)光信號最強。因此，在本次實驗分析過程中，選取的發(fā)光反應(yīng)介質(zhì)為1.0mol/L硫酸。

3.3 增敏劑與化學(xué)發(fā)光強度的關(guān)系

為增強化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的信號，通常會在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系中加入相應(yīng)比例的增敏劑，常用的增敏劑有熒光棒、核黃素、聚乙二醇、十二烷基磺酸鈉、甲酸、甲醛等。相關(guān)研究表明，甲酸與甲醛的增敏效果非常明顯。這主要是因為甲酸與甲醛的氧化中間活性對高錳酸鉀氧化苯二酚發(fā)光反應(yīng)具有協(xié)同作用。同時，對比這兩種增敏劑，甲酸的信噪比比甲醛更低。進一步分析甲酸濃度對化學(xué)發(fā)光強度的影響得知，甲酸水溶液體積分數(shù)為16%時，對發(fā)光強度的增敏效果最佳。因此，在本次實驗中，選取體積分數(shù)為16%的甲酸水溶液作為發(fā)光反應(yīng)的增敏劑。

3.4 流速及管路設(shè)計與發(fā)光強度的關(guān)系

化學(xué)發(fā)光強度也會受載液流速及管路設(shè)計的影響。有相關(guān)研究表明，在高錳酸鉀與甲酸混合液流速為0.5~2.0mL/min時，不僅會減小發(fā)光信號，且會加劇柱后洗脫液在流通池中的擴散，使得色譜峰有所拓展，而如果載液流速較小，還會對信號的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，從而增加信噪比。對此，通過在載液流路中設(shè)置一段混合管進行優(yōu)化，讓載液在進入流通池之前使其充分反應(yīng)形成阻力足量的活性中間體。進一步分析得知，在混合管長度為150mm時，高錳酸鉀與甲酸載液最佳流速為1.0mL/min。

3.5 色譜分離條件與化學(xué)發(fā)光強度的關(guān)系

在本次實驗分析中，也重點考察了色譜分離條件對化學(xué)發(fā)光強度的影響，主要是對甲醇和乙腈作為流動相的有機相時，分別對苯二酚異構(gòu)體分離效果及發(fā)光強度造成的影響。經(jīng)過實驗得知，甲醇和乙腈可實現(xiàn)3種苯二酚異構(gòu)體的有效分離，但乙腈對化學(xué)發(fā)光反應(yīng)有明顯的淬滅作用，因此在實驗中不適合使用。因此將甲醇作為流動相的有機相，并分別加入如磷酸、β-環(huán)糊精、十二烷基磺酸鈉等改性劑用以進一步分析甲酸對苯二酚異構(gòu)體的分析效果。實驗結(jié)果表明，磷酸和β-環(huán)糊精水溶液的分離效果最優(yōu)，且對發(fā)光信號基本無影響，其中以0.1mmol/Lβ-環(huán)糊精溶液的分離效果最好。通過實驗，最終獲得最佳的色譜分離條件：流動相為甲醇-0.1mmol/Lβ-環(huán)糊精水溶液（30∶70，體積比），流速為0.6mL/min，柱溫為25℃。

3.6 樣品分析

鑒于天然水體中苯二酚含量一般是在痕量水平，所以必須對樣品進行富集處理后才能檢測。結(jié)合實際情況，樣品富集處理方法為固相萃取法。取200mL水樣，經(jīng)過固相萃取小柱富集處理后，再用2mL甲醇洗脫，可保證處理后的樣品滿足水中痕量苯二酚測定的各項要求，且富集效果好，操作便捷。

3.7 標準曲線及檢出限

在確定最佳實驗條件的情況下，結(jié)合配制所得的苯二酚標準溶液進行測定分析，并繪制標準曲線圖。實驗結(jié)果得知，3種苯二酚在2個濃度數(shù)量級范圍內(nèi)與發(fā)光強度呈良好線性關(guān)系。設(shè)信噪比為3，對3種苯二酚的檢出限進行確定，結(jié)果得知，對比紫外檢測法，高效液相色譜-高錳酸鉀氧化化學(xué)發(fā)光法的檢出限要低1~2數(shù)量級。同時，對質(zhì)量濃度為0.10mg/L的3種苯二酚混合溶液進行連續(xù)測定，測定結(jié)果得知，鄰苯二酚的相對標準偏差為2.8%，間苯二酚的相對標準偏差為3.4%，對苯二酚的相對標準偏差為6.5%。

4 結(jié)束語

基于酸性介質(zhì)條件下，提出了高效液相色譜-化學(xué)發(fā)光法的新測定方法，將該方法用于苯二酚化合物測定中，有較高的靈敏度，且選擇性良好。在具體的實驗設(shè)計中，對苯二酚異構(gòu)體分離及發(fā)光檢測條件進行了優(yōu)化改善，并配合固相萃取技術(shù)，實現(xiàn)了對自然水體中痕量苯二酚的有效測定，獲取的效果極佳。