血清4 型禽腺病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷方法研究進(jìn)展

鄭洪玲

（遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心， 遼寧 沈陽(yáng) 110033）

心包積液綜合征是肉雞的一種嚴(yán)重傳染病，其特征是心包囊內(nèi)積有一種透明的液體，并伴有腎炎和肝炎[1]。血清4 型禽腺病毒（Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4）是心包積液綜合征的病原體，該病毒對(duì)雞，特別是對(duì)3～5 周齡的肉雞具有很強(qiáng)的致病性，可以通過(guò)垂直和水平傳播[2]。自1987 年FAdV-4 在巴基斯坦首次暴發(fā)以來(lái)，該病毒已傳播到亞洲、中南美洲和歐洲一些國(guó)家和許多地區(qū)，成為過(guò)去30 年給家禽業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的首要原因之一[3]。FAdV-4 感染的主要靶器官是肝臟，臨床上能夠從感染肉雞的肝臟勻漿中分離出該病毒，并能通過(guò)多種實(shí)驗(yàn)室診斷方法檢測(cè)到。本文對(duì)FAdV-4 實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，以期為我國(guó)新發(fā)FAdV-4 的防控提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 透射電鏡診斷

臨床中，診斷疑似感染FAdV-4 病例的依據(jù)主要是3～6 周齡肉雞突然出現(xiàn)高死亡率，并表現(xiàn)出心包積液、腎炎和肝炎等癥狀和病理變化。透射電鏡的應(yīng)用，使病毒、細(xì)菌、真菌及原生動(dòng)物的超微結(jié)構(gòu)檢查成為可能，在微生物的診斷中起著至關(guān)重要的作用。它利用透射電鏡從疑似感染FAdV-4 肉雞的肝臟勻漿、肝細(xì)胞中觀察到離散的病毒顆粒，具有典型腺病毒外觀，六邊形、二十面體、無(wú)包膜，直徑約75 nm，從而對(duì)疑似病例進(jìn)行確診，并證實(shí)了FAdV-4 是心包積液綜合征的病原體。從受感染動(dòng)物的血液、體液或組織中分離病毒也是病毒感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，而原代雞腎、雞胚腎、雞胚肝、雞胚成纖維細(xì)胞和QT-35 細(xì)胞均可用于FAdV-4 的分離。李喬斌等選用雞肝癌細(xì)胞進(jìn)行FAdV-4 的分離培養(yǎng)，并利用電鏡技術(shù)等對(duì)分離病毒進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示在電鏡下可觀察到FAdV-4 的細(xì)胞培養(yǎng)物有大量病毒粒子的存在[4]。

2 分子生物學(xué)診斷技術(shù)

目前，限制性內(nèi)切酶分析、DNA 探針原位雜交、PCR、實(shí)時(shí)PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（LMAP）和高分辨率熔解曲線分析（HRM）等分子生物學(xué)診斷方法均可用于FAdV-4 的檢測(cè)和鑒定[5]。限制性內(nèi)切酶分析最初用于禽腺病毒分離株的分組和毒株的分型。根據(jù)BamH I 和Hind III消化產(chǎn)生的DNA 基因組相似性，將17 株禽腺病毒菌株的11 個(gè)血清型分為5 組（A～E）。盡管血清4 型和10 型禽腺病毒之間存在雙向交叉中和作用，但采用Hind III、Dra I、Xba I、Not I、Sfi I、Bgl II、Sma I 和NaeI 的限制性內(nèi)切酶分析發(fā)現(xiàn)差異不大。一些報(bào)道稱可以利用原位雜交直接檢測(cè)禽腺病毒DNA 與特定探針，但由于該方法操作復(fù)雜，還有更方便、可靠的其它診斷方法，因此目前在臨床診斷上的應(yīng)用并不廣泛。

PCR 方法具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單和快速的優(yōu)點(diǎn)，一直以來(lái)是檢測(cè)禽腺病毒的主要方法。目前已發(fā)表的禽腺病毒PCR 檢測(cè)技術(shù)的主要靶基因包括腺病毒的六鄰體基因（hexon）的保守基因區(qū)（P1，P2）和可變環(huán)區(qū)域（L1～L4），研究者針對(duì)可變區(qū)和保守區(qū)都設(shè)計(jì)過(guò)引物[6]。利用2 對(duì)在保守區(qū)雜交的PCR 引物與限制性內(nèi)切酶分析結(jié)合，使PCR 和限制性內(nèi)切酶分析能夠檢測(cè)和區(qū)分所有12 株禽腺病毒參考菌株。利用針對(duì)hexon 基因可變區(qū)域的引物，通過(guò)PCR 結(jié)合Southern 雜交成功地從印度一例心包積液綜合征病例中檢測(cè)到FAdV-4[7]。目前，將hexon 基因的PCR 產(chǎn)物直接測(cè)序，所得信息可用于鑒定禽腺病毒及其血清型。Fu 等從臨床診斷為心包積液綜合征的廣東雞中分離出FAdV-4 毒株，并建立了基于hexon 基因的禽腺病毒特異性PCR 檢測(cè)方法，能夠快速對(duì)死雞的心臟和肝臟組織樣本進(jìn)行FAdV-4 檢測(cè)，并研究其hexon 基因核苷酸序列的異同[8]。此外，F(xiàn)iber 是禽病毒表面重要的纖突蛋白，能夠編碼型特異性中和、型特異性非中和和亞屬特異性中和表位，因此常被用于檢測(cè)禽腺病毒。有人建立了基于Fiber 的PCR-限制性內(nèi)切酶分析技術(shù)，這是一種新的、可靠的方法，可以用來(lái)鑒定FAdV-4 分離株[9]。

上述傳統(tǒng)的PCR 方法是臨床快速檢測(cè)禽類病毒病原體的一種簡(jiǎn)單而敏感的工具，但該技術(shù)無(wú)法量化病毒載量。為了克服這一缺陷，研究者們進(jìn)一步報(bào)道了使用基于SYBR green 的實(shí)時(shí)PCR方法來(lái)檢測(cè)和量化所有禽腺病毒。劉琳等[10]、羅洋洋等[11]、宋玲玲等[12]眾多研究者分別針對(duì)Hexon 基因序列設(shè)計(jì)引物和探針，建立了FAdV-4的TaqMan 探針熒光定量PCR 檢測(cè)方法，這些方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好的特點(diǎn)，均可用于臨床樣本的檢測(cè)。與此同時(shí)，研究者還開(kāi)發(fā)了qPCR、巢式 PCR 和LAMP 等靈敏度更高、特異性更強(qiáng)的方法。鐘鳴針對(duì)已公布的禽腺病毒全基因序列的高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物建立了一種FAdV-4 巢式PCR 檢測(cè)方法，同時(shí)針對(duì)FAdV-4 的Hexon 基因序列建立了特異性LAMP檢測(cè)方法，并對(duì)其反應(yīng)條件和反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示兩種檢測(cè)方法中，LAMP 檢測(cè)方法的特異性和靈敏性更佳[7]。欒勇嬌設(shè)計(jì)篩選了兩套LAMP 引物和2 條分子信標(biāo)探針，建立了鑒別診斷FAdV-4 變異株和非變異株的雙重?zé)晒釲AMP檢測(cè)方法[5]。如前所述，將PCR 與限制性內(nèi)切酶分析和/或DNA 測(cè)序相結(jié)合，可用于基因分型和區(qū)分所有12 種禽腺病毒血清型，但這些組合方法相對(duì)昂貴和耗時(shí)，而且往往需要大量的分析，這就限制了它們作為常規(guī)血清分型方法的使用范圍。近年來(lái)，高分辨率熔解曲線分析為遺傳變異的直接基因分型提供了一種簡(jiǎn)單且成本較低的替代方法。該方法針對(duì)禽腺病毒結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因hexon的L1 區(qū)設(shè)計(jì)引物HexL1s/HexL1，通過(guò)對(duì)約590 bp大小的 PCR 產(chǎn)物的熔解曲線分析顯示，熔解曲線具有高度重復(fù)性和可區(qū)分性，有一個(gè)或多個(gè)主峰，是一種簡(jiǎn)單、靈敏和特異的基因分型和區(qū)分所有12 種禽腺病毒血清型的方法。王冬雪建立的PCRHRM 方法對(duì)腺病毒實(shí)現(xiàn)了準(zhǔn)確、快速的基因分型，該方法主要是針對(duì)Ⅰ群禽腺病毒進(jìn)行鑒定[13]，而目前針對(duì)FAdV-4 的PCR-HRM 方法還有待進(jìn)一步探索。

3 血清學(xué)技術(shù)

目前，間接血凝試驗(yàn)、間接免疫熒光試驗(yàn)、瓊脂糖凝膠沉淀試驗(yàn)、瓊脂糖凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、病毒中和試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等多種血清學(xué)技術(shù)已用于診斷家禽FAdV-4 感染。最初，基于實(shí)驗(yàn)室制備的高免血清，利用間接免疫熒光試驗(yàn)、瓊脂糖凝膠沉淀試驗(yàn)和瓊脂糖凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)，在感染后家禽的肝臟或不同組織的勻漿提取液中檢測(cè)到FAdV-4。而間接血凝試驗(yàn)可以用于疫苗接種后的抗體效價(jià)檢測(cè)，還可用于從被感染的雞中檢測(cè)針對(duì)FAdV-4的抗體。研究顯示，病毒中和試驗(yàn)被用于區(qū)分禽腺病毒的血清型和評(píng)估疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體反應(yīng)，是一種敏感性和準(zhǔn)確率更高的方法，但病毒中和試驗(yàn)的缺點(diǎn)是昂貴和耗時(shí)，因此，必須在合理的情況和有條件時(shí)使用。

近年來(lái)，F(xiàn)AdV-4 血清學(xué)技術(shù)的研究進(jìn)展主要集中在對(duì)ELISA 方法的改進(jìn)和優(yōu)化方面。在早期研究中，采用全病毒作為包被抗原的間接ELISA法，被用來(lái)檢測(cè)自然感染和實(shí)驗(yàn)感染雞的組織樣本中的FAdV-4 抗體，但試驗(yàn)中病毒抗原的制備相對(duì)繁瑣和低效，敏感性和特異性也不是很高。后來(lái)，研究人員開(kāi)發(fā)了一種夾心ELISA 方法，用來(lái)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)感染雞的各種組織，包括肝臟、脾臟、法氏囊、胸腺和腎臟中的FAdV-4 抗原[14]；該方法具有較高的靈敏度和特異性，可在較低濃度條件下檢測(cè)出FAdV-4 抗原。最近，有研究者利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)和純化了FAdV-4 結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。武小倩[15]、He[16]等分別建立了基于fiber-1和fiber-2 蛋白的FAdV-4 特異性間接ELISA 檢測(cè)方法；田開(kāi)月等針對(duì)中國(guó)流行株的fiber-2 蛋白進(jìn)行原核表達(dá)后建立了間接ELISA 檢測(cè)方法[17]；申秋平建立的ELISA 檢測(cè)方法則是基于FAdV-4 的非結(jié)構(gòu)蛋白[18]。這幾種重組蛋白的ELISA 方法具有較高的靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性和重復(fù)性，易于標(biāo)準(zhǔn)化，更適合大規(guī)模應(yīng)用。

4 小結(jié)

在感染雞的12 種血清型FAdV 中，F(xiàn)AdV-4是主要的流行株，對(duì)肉雞具有較高的致病性，嚴(yán)重危害我國(guó)的養(yǎng)雞業(yè)，帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失近年來(lái)也迅速增長(zhǎng)。因此，我們應(yīng)該格外重視該病原的流行病學(xué)調(diào)查、診斷檢測(cè)和防控等工作，而使用快速有效的檢測(cè)方法尤為重要。本文提到的瓊脂糖凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、間接免疫熒光分析、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、限制性內(nèi)切酶分析、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、實(shí)時(shí)PCR、LAMP 和HRM 等方法，主要?dú)w納為分子生物學(xué)和血清學(xué)檢測(cè)兩類，是目前檢測(cè)FAdV-4 感染常用的實(shí)驗(yàn)室診斷方法。研究者根據(jù)實(shí)際感染情況和試驗(yàn)條件從中選擇合適的方法，能夠快速檢測(cè)禽腺病毒感染，從而為該病的防控贏得時(shí)間。