水產(chǎn)品中己烯雌酚殘留檢測方法

金麗瓊，張 睿，劉 妤，楊 靜

（甘肅省分析測試中心，蘭州 730000）

隨著中國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，以及人們生活水平的日益提高，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)得到了快速發(fā)展。食品質(zhì)量安全問題備受關(guān)注，特別是水產(chǎn)品中藥物殘留問題成為人們關(guān)注的重點(diǎn)，雖然國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)對水產(chǎn)品飼料添加劑的使用做出了嚴(yán)格規(guī)定，但是大量使用違禁藥物的現(xiàn)象依然存在［1］。己烯雌酚是一種人工合成的非甾體雌激素類藥物，在水產(chǎn)品養(yǎng)殖過程中，將其添加在養(yǎng)殖飼料中可以很好地促進(jìn)水產(chǎn)品的生長，從而有效縮短養(yǎng)殖時(shí)間［2］。同時(shí)己烯雌酚已經(jīng)被研究者證實(shí)在水產(chǎn)品養(yǎng)殖過程中存在嚴(yán)重的殘留問題［3］，這種殘留會對人類和環(huán)境造成嚴(yán)重危害。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，己烯雌酚可以破壞機(jī)體的遺傳物質(zhì)，導(dǎo)致基因突變，引發(fā)腫瘤［4］。由于己烯雌酚等激素藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的濫用，對水產(chǎn)品中己烯雌酚等激素藥物的殘留監(jiān)測已經(jīng)引起了全世界的高度重視。歐盟已經(jīng)在食用性動(dòng)物飼養(yǎng)中將其列為禁用品，2002年中國農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《禁止在飼料和動(dòng)物飲用水中使用的藥物品種目錄》（農(nóng)業(yè)部公告第176號）中也禁止在畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中使用己烯雌酚［5］。農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY∕T 842—2021《綠色食品魚》中要求己烯雌酚不得檢出［6］。由此可以看出，己烯雌酚嚴(yán)重威脅著人們的食品安全，需要嚴(yán)格禁止其在水產(chǎn)品養(yǎng)殖過程中使用［7］，因此，分析水產(chǎn)品中己烯雌酚殘留檢測方法具有重要的意義。

1 己烯雌酚簡介

己烯雌酚（Diethylstilbestrol，DES），化學(xué)名為（E）-4，4′-（1，2-二乙基-1，2-亞乙烯基）雙苯酚，分子量268.35，分子式為C18H20O2，CAS：6898-97-1，沸點(diǎn)為（407.1±25.0）℃，結(jié)構(gòu)式見圖1。己烯雌酚是一種人工合成的非甾體雌激素藥物，為無色結(jié)晶或白色結(jié)晶性粉末，難溶于水，易溶于醇及脂肪油。

圖1 己烯雌酚

2 己烯雌酚的檢測方法

水產(chǎn)品中己烯雌酚的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法、氣相色譜-質(zhì)譜法和高效液相色譜-質(zhì)譜法等?，F(xiàn)將近10年報(bào)道的相關(guān)檢測方法分別進(jìn)行分析綜述，分析現(xiàn)有檢測方法的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，以及需要改進(jìn)的技術(shù)難點(diǎn)。

2.1 酶聯(lián)免疫法

農(nóng)業(yè)部1163號公告—1—2009《動(dòng)物性食品中己烯雌酚殘留檢測酶聯(lián)免疫吸附測定法》中規(guī)定了標(biāo)準(zhǔn)的適用范圍是豬肉、豬肝、蝦樣本中己烯雌酚殘留量的檢測，該標(biāo)準(zhǔn)是一種快速篩選陽性樣品的檢測方法，如果出現(xiàn)陽性樣品時(shí)，還需要用儀器進(jìn)行再次確認(rèn)。該標(biāo)準(zhǔn)的方法原理是采用間接競爭ELISA方法，首先在微孔條上包被偶聯(lián)抗原，樣品中如果存在己烯雌酚，己烯雌酚就會與偶聯(lián)抗原競爭酶標(biāo)板上的己烯雌酚抗體的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，結(jié)合成功的己烯雌酚酶標(biāo)記物可以將顯色劑顯色，顯色后的樣品通過酶標(biāo)儀測定吸光度（450 nm 波長），吸光度與己烯雌酚含量形成負(fù)相關(guān)，通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較后，就可以計(jì)算出己烯雌酚殘留的含量［8］。方法檢出限為2 μg∕kg，本方法在3～12 μg∕kg 添加濃度水平上回收率為60%～110%。該標(biāo)準(zhǔn)方法具有操作簡單、實(shí)際使用量少、適合大批量檢測任務(wù)的優(yōu)點(diǎn)。

行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SC∕T 3020—2004適用于水產(chǎn)品肌肉中己烯雌酚的檢測，該標(biāo)準(zhǔn)的方法原理與農(nóng)業(yè)部1163號公告—1—2009相同，方法檢出限為0.6 μg∕kg，回收率≥70%［9］。該標(biāo)準(zhǔn)方法靈敏度有所提高，但是樣品前處理過程需要用C18固相萃取小柱純化，前處理過程繁瑣。張瑞凌等［10］對現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)中采用酶聯(lián)免疫法檢測己烯雌酚的方法進(jìn)行了優(yōu)化，樣品用乙腈提取，中性氧化鋁小柱凈化，用己烯雌酚ELISA 試劑盒檢測，簡化了前處理過程，方法檢出限為0.35 μg∕kg，加標(biāo)回收率為77%～91%，可以滿足檢測要求，并采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法驗(yàn)證了結(jié)果。

2.2 氣相色譜-質(zhì)譜法

農(nóng)業(yè)部1163號公告—9—2009 標(biāo)準(zhǔn)適用于水產(chǎn)品中可食部分中己烯雌酚殘留量的測定［11］。該標(biāo)準(zhǔn)的方法是用乙酸乙酯提取樣品中的藥物殘留，通過SLH 固相萃取小柱凈化樣品，再用硅烷化試劑進(jìn)行衍生化后，用氣相色譜-質(zhì)譜儀測定，外標(biāo)法定量。 方法檢出限為0.5 μg∕kg，本方法添加濃度為0.5～10.0 μg∕kg 時(shí)，回收率≥70%。己烯雌酚沸點(diǎn)為407 ℃，已經(jīng)超出了色譜柱的最高溫度325 ℃，因此，需要將己烯雌酚衍生成沸點(diǎn)較低的硅烷化衍生物進(jìn)行檢測，該標(biāo)準(zhǔn)前處理過程復(fù)雜。尹怡等［12］在此基礎(chǔ)上分別建立了基質(zhì)固相分散法、固相萃取法與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定水產(chǎn)品中己烯雌酚殘留量的分析方法，其中基質(zhì)固相分散法回收率大于90%，檢出限為0.3 μg∕kg；固相萃取法回收率大于80%，檢出限為0.5 μg∕kg；并比較了2 種前處理方法，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)固相分散法更簡便、省時(shí)、經(jīng)濟(jì)環(huán)保。朱金蘭等［13］簡化了采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中己烯雌酚含量時(shí)的前處理過程，樣品直接用乙腈、正己烷和乙酸乙酯提取，不需要通過固相小柱萃取，直接經(jīng)BSTFA-TMCS 吡啶溶液在50 ℃衍生后，上機(jī)測定；該方法的定量限為0.5 μg∕kg，檢測限為0.1 μg∕kg。馬麗莎等［2］建立了QuEchERs∕Gc-Ms 法測定魚、蝦中雌二醇和己烯雌酚（DES）的殘留情況，該方法的平均回收率為86.1%～115.0%，檢出限（LOD，S∕N≥3）為0.3 μg∕kg；QuEchERs 處理方法與固相萃取法比較，縮短了前處理時(shí)間，減少了試劑的使用量，檢測過程經(jīng)濟(jì)環(huán)保。

2.3 高效液相色譜-質(zhì)譜法

國家標(biāo)準(zhǔn)GB∕T 22963—2008 適用于多種水產(chǎn)品中激素類藥物殘留的測定，該標(biāo)準(zhǔn)的方法檢出限為1.0 μg∕kg，方法回收率≥80%［14］。該標(biāo)準(zhǔn)方法適用范圍限制了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法在水產(chǎn)品中己烯雌酚殘留量的檢測使用。李向軍等［15］建立了采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定水產(chǎn)品中24種性激素的方法，樣品用乙酸乙酯提取2 次，硅膠柱凈化后，可同時(shí)測定24 種激素，其中己烯雌酚的定量限為1.0 μg∕kg，回收率大于80%。李佩佩等［16］建立了采用凝膠滲透色譜和固相萃取小柱凈化樣品后，用高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中藥物殘留的分析方法，其中己烯雌酚的回收率大于80%，定量限為5.0 μg∕kg。王宏亮等［17］建立了配備有二極管陣列檢測器的高效液相色譜儀，同時(shí)對蝦中雌三醇、雌二醇、己烯雌酚等8 種雌激素進(jìn)行鑒別和含量測定的方法，樣品經(jīng)超聲提取，濾膜過濾，待測上機(jī)，該方法樣品前處理過程簡單，減少了化學(xué)試劑的使用，適合大批量檢測任務(wù)，并可以同時(shí)完成8 種激素的檢測，其中己烯雌酚的回收率大于90%，定量限為0.09 μg∕mL。王丹華等［18］采用高效液相色譜儀實(shí)現(xiàn)了同時(shí)測定水產(chǎn)品中15 種激素殘留的檢測方法，樣品經(jīng)超聲提取，濾膜過濾，直接用高效液相色譜分析，其中己烯雌酚的回收率大于90%，定量限為0.09 mg∕kg，該方法實(shí)現(xiàn)了檢測水產(chǎn)品中的多種激素殘留，前處理過程簡單，靈敏度高。楊帆等［19］采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品及其制品中3 種抗生素和14種性激素的殘留量，樣品經(jīng)乙酸乙酯提取后，過GCB∕NH2固相萃取柱凈化，待測，其中己烯雌酚的回收率大于60%，定量限為3 μg∕kg。

2.4 其他方法

在酶聯(lián)免疫、氣相色譜儀串聯(lián)質(zhì)譜和液相色譜儀串聯(lián)質(zhì)譜檢測己烯雌酚的基礎(chǔ)上，盧安根等［20］提出了將熒光素酶報(bào)告基因檢測技術(shù)應(yīng)用到水產(chǎn)品中己烯雌酚含量的測定，常用的檢測方法檢出限高，通常只能檢測一種激素的含量，該方法雖然前處理過程復(fù)雜，檢測成本較高，但是具有靈敏度高、可以同時(shí)檢測多種激素含量的優(yōu)點(diǎn)，其中己烯雌酚的加標(biāo)濃度為1.0×10-3μg∕kg 時(shí)，回收率為75%。呂楊等［21］將電致化學(xué)發(fā)光方法應(yīng)用到水產(chǎn)品中己烯雌酚含量的測定，電致化學(xué)發(fā)光具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、檢測設(shè)備簡單、適合大批量樣品檢測等優(yōu)點(diǎn)，試驗(yàn)結(jié)果表明，線性范圍為1～50 pg∕mL 時(shí)，線性相關(guān)系數(shù)為0.993，電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感平臺的檢測限為1 pg∕mL，可以滿足己烯雌酚殘留量測定的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。隨著分子印跡技術(shù)的快速發(fā)展，因其具有特異性識別的特點(diǎn)，也被應(yīng)用到己烯雌酚的檢測技術(shù)中。何雨等［22］將分子印跡技術(shù)和新型熒光碳納米粒子技術(shù)應(yīng)用到己烯雌酚的檢測方法中，在0.02～7.45 mg∕L 濃度內(nèi)，方法檢出限為0.059 μg∕L，回收率在81.7%～110.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10.7%。結(jié)果表明，該方法制備的己烯雌酚熒光印跡聚合物可以滿足己烯雌酚殘留量的檢測。

3 小結(jié)

目前可以參考的水產(chǎn)品中己烯雌酚的標(biāo)準(zhǔn)測定方法中，酶聯(lián)免疫法只適合快速篩選檢測，可疑樣品仍然需要用儀器進(jìn)行確認(rèn)。由于己烯雌酚的沸點(diǎn)較高，采用氣相色譜-質(zhì)譜法檢測時(shí)，需要將己烯雌酚進(jìn)行衍生后再檢測，存在前處理過程復(fù)雜的問題。高效液相色譜-質(zhì)譜法靈敏度低，但方法檢出限高。因此，本研究通過解析現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法存在的問題，綜述近10年報(bào)道的相關(guān)水產(chǎn)品中己烯雌酚檢測方法的研究進(jìn)展，以期為建立前處理方法簡單、檢測效率高的己烯雌酚檢測方法提供一定的研究依據(jù)，為水產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展奠定基礎(chǔ)。