冷凍消融治療肺癌的免疫反應(yīng)及其增強機制的研究探析

摘 要：肺癌是全世界范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤疾病，死亡率也位居各類惡性腫瘤前列。給人們身心帶來巨大痛苦，因此尋找更高效的方式治療肺癌迫在眉睫，在外科治療微創(chuàng)化，甚至超微創(chuàng)化的大背景下，冷凍消融技術(shù)應(yīng)運而生，而且得到了蓬勃的發(fā)展。因其是純物理能量轉(zhuǎn)換、消融能力大、消融部位精確、療效確切、無明顯痛苦、不良反應(yīng)少及組織修復(fù)治療效果較好而被公認(rèn)為是惡性腫瘤治療的“綠色療法”。經(jīng)皮冷凍消融術(shù)是目前唯一可用于周圍肺腫瘤冷凍免疫治療的技術(shù)。除了上述優(yōu)點外，有研究表明冷凍消融治療過程中能夠產(chǎn)生疫苗樣作用，激活機體免疫，誘發(fā)“遠(yuǎn)位效應(yīng)”，對肺癌的局部和全身起到雙重治療作用。還有研究顯示冷凍消融與粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、Toll樣受體激動劑、細(xì)胞過繼療法、免疫檢查點抑制劑等結(jié)合能夠增強治療肺癌的效果。然而，如何利用、加強冷凍消融的遠(yuǎn)位效應(yīng)仍然是治療肺癌，尤其是晚期肺癌的關(guān)鍵。

關(guān)鍵詞：冷凍消融；免疫反應(yīng)；肺癌；免疫增強機制；綜述

中圖分類號：R734.2

肺癌是全世界范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤疾病，其中80%以上屬于非小細(xì)胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer， NSCLC）[1]，五年生存率平均為15%。往往早期就會侵犯血管，易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這些不適合手術(shù)切除的NSCLC患者，即使經(jīng)過化療后，患者的五年生存率也僅為5%[2]。為了最大限度地降低肺癌對患者影響，提出了“三早原則”，但是，大多數(shù)肺癌患者確診時病情已處于中晚期，能夠接受手術(shù)切除的腫瘤病例不足20%，大約有90%患者最后死于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的全身臟器功能衰竭。大量數(shù)據(jù)證明，肺癌是一種全身性的慢性消耗性疾病。因此，醫(yī)學(xué)界認(rèn)為肺癌最佳治療指導(dǎo)思想應(yīng)同時兼顧局部和全身治療。冷凍消融不僅可以實現(xiàn)局部精準(zhǔn)殺滅腫瘤原發(fā)灶，減輕瘤負(fù)荷，而且可以有效地誘導(dǎo)抗腫瘤免效應(yīng)，甚至誘發(fā)“遠(yuǎn)位效應(yīng)”，控制或消滅遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶或潛在轉(zhuǎn)移灶[3]。

1 冷凍消融治療肺癌和引起免疫反應(yīng)的原理

冷凍消融術(shù)作為一種局部物理治療，通過多個方面發(fā)揮抗腫瘤作用。焦耳-湯姆遜理論是低溫消融的基本原理。通過使用高壓氬氣，靶腫瘤被冷卻到-140 ℃，然后用氦快速加熱從+20 ℃到+40 ℃ CMS冷凍系統(tǒng)使用液氮，可以將腫瘤冷卻到-196 ℃。凍融循環(huán)不僅通過膜破裂和微血管血栓引起細(xì)胞死亡，而且由于存在極低的溫度，還會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性和細(xì)胞脫水[4]。此外，自20世紀(jì)60年代后期以來的許多實驗研究已經(jīng)證明了冷凍消融術(shù)的免疫作用。在小鼠模型中，冷凍的肺癌細(xì)胞可以釋放腫瘤抗原并引起機體抗腫瘤免疫反應(yīng)。然而，在大多數(shù)情況下所引發(fā)的免疫反應(yīng)不足以根除伴有全身擴散的腫瘤。

2 冷凍消融在肺癌中的反應(yīng)

冷凍免疫現(xiàn)象最早發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)60年代，Yantorno第一次發(fā)現(xiàn)冷凍兔精囊腺后體內(nèi)產(chǎn)生特異性抗體[5]。冷凍消融術(shù)引發(fā)免疫反應(yīng)的機制是實施冷凍消融術(shù)后，腫瘤組織大面積壞死并且釋放一定量的抗原，引起機體免疫反應(yīng)，實現(xiàn)殺死殘留癌細(xì)胞的重要目標(biāo)。在非小細(xì)胞肺癌冷凍消融的免疫學(xué)研究中，Katzman等[6]在C57BL/6小鼠兩側(cè)種植肺癌細(xì)胞（LLC），實驗研究發(fā)現(xiàn)冷凍消融治療異位LLC側(cè)翼腫瘤可顯著抑制未冷凍消融的對側(cè)腫瘤的生長，與“非鏡下樣”效應(yīng)一致，冷凍消融組CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞浸潤對側(cè)腫瘤的百分比顯著增加。此外，冷凍消融組腫瘤皮下周圍間隙有更高水平的促炎細(xì)胞因子，包括IL-2、腫瘤壞死因子-α和干擾素-γ。這些發(fā)現(xiàn)高度表明冷凍消融LLC的“非局部性”效應(yīng)在本質(zhì)上是免疫學(xué)的，并由細(xì)胞和細(xì)胞因子效應(yīng)機制介導(dǎo)。在治療非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中[7]，冷凍消融后IFN-γ，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+的數(shù)量都明顯升高，CD8+、IL-6的數(shù)量明顯下降，表明氬氦刀能夠改善非小細(xì)胞肺癌機體的免疫狀態(tài)，發(fā)揮抗腫瘤免疫效應(yīng)。在冷消融、熱消融與金屬刀治療Lewis肺癌荷瘤小鼠的實驗研究，王丹[8]運用冷消融治療LLC荷瘤小鼠的短期療效無明顯差異，但從機體免疫功能來看，冷消融更勝一籌，冷消融對LLC荷瘤小鼠免疫功能的增強作用強；其對LLC荷瘤小鼠IL-2、IL-6分泌有較強的促進(jìn)作用。表明冷消融能夠改善LLC荷瘤小鼠的免疫狀態(tài)，發(fā)揮抗腫瘤免疫效應(yīng)。

在臨床中，冷凍消融對不能外科手術(shù)治療的早期肺癌患者是一種有效、低風(fēng)險的治療方法。Moore等[9]的研究表明，經(jīng)冷凍消融治療后的Ⅰ期患者的5年總生存率、腫瘤特異性生存率、無進(jìn)展生存率都與早期NSCLC的RFA治療效果相當(dāng)。McDevitt等[10]用冷凍消融治療數(shù)十例原發(fā)性肺癌，T1期患者1年和3年的生存率分別高達(dá)100%和63%。有一項對14個 GGO患者的隨訪，患者治療1個月后肺功能恢復(fù)良好，24個月的隨訪中，GGO消融成功且未出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥[11]。總之，冷凍消融在肺癌治理中有其獨特的優(yōu)勢。

3 冷凍消融術(shù)免疫效應(yīng)增強策略

在大量的基礎(chǔ)和臨床研究中證實，肺癌和各其他腫瘤已經(jīng)發(fā)展出復(fù)雜的免疫抑制機制來逃避宿主的免疫攻擊[12-14]。經(jīng)皮冷凍消融術(shù)是目前唯一可用于周圍肺腫瘤冷凍免疫治療的技術(shù)。因此，冷凍消融和免疫治療在調(diào)節(jié)和逆轉(zhuǎn)免疫抑制反應(yīng)方面的協(xié)同作用治療癌癥，特別是晚期轉(zhuǎn)移性肺癌及其他癌癥患者提供了一個令人鼓舞的方法。冷凍消融是一種通過凍融過程引起組織損傷的低溫方式。在所有的消融技術(shù)中，冷凍消融在激發(fā)消融后免疫原性方面表現(xiàn)出最高的潛力。冷凍消融術(shù)與其他各種消融方式治療肺癌的方法相比，有獨一無二的特點，其具有最佳免疫反應(yīng)，而且還可以發(fā)生“遠(yuǎn)位效應(yīng)”，使腫瘤病灶消退。然而，這種“遠(yuǎn)位效應(yīng)”幾乎不怎么發(fā)生，很少有肺癌患者在局部應(yīng)用冷凍消融術(shù)后表現(xiàn)出未經(jīng)治療的轉(zhuǎn)移瘤在免疫調(diào)節(jié)下完全消失。為了增加這種治療效果的可能性，冷凍消融需要與免疫療法相結(jié)合。目前研究證明冷凍消融與免疫調(diào)節(jié)療法有機結(jié)合可明顯增強免疫效應(yīng)[15]。因此，如何增強冷凍消融術(shù)在肺癌腫瘤免疫療法的作用，是激活人體自身的免疫保護(hù)系統(tǒng)關(guān)鍵所在。實現(xiàn)彼此的有機結(jié)合，發(fā)揮最大潛能優(yōu)勢，這必將是肺癌現(xiàn)代化治療的重大突破。

3.1 細(xì)胞的過激療法

過激療法（Adoptive Cell Therapies，ACTs）的原理是從腫瘤中分離相關(guān)的免疫細(xì)胞，進(jìn)行體外擴增，重新輸注回體內(nèi)，從而達(dá)到消除腫瘤的目的。實驗研究表明[16]聯(lián)合治療小鼠細(xì)胞瘤基礎(chǔ)實驗中，其聯(lián)合IL-12治療，腫瘤出現(xiàn)了消退， IFN-γ因子表達(dá)也明顯增加。當(dāng)前ACT主要用于T細(xì)胞、NK細(xì)胞和單核細(xì)胞來源的DC[17]。還有一些研究發(fā)現(xiàn)，CAR-T細(xì)胞的成功需要靶向抗原在整個腫瘤中的均勻表達(dá)，CAR-NK細(xì)胞可以通過CARS和天然NK細(xì)胞受體識別腫瘤，拓寬了腫瘤細(xì)胞識別和細(xì)胞毒作用的范圍，因而具有更大的優(yōu)勢。此外，NK細(xì)胞可以從同種異體來源移植，這使得它們可以很容易地作為“現(xiàn)成產(chǎn)品”使用，而沒有引起移植物抗宿主病的風(fēng)險。用CARS改造的NK細(xì)胞在卵巢癌的臨床前模型中顯示出了良好的前景。然而，冷凍消融術(shù)聯(lián)合免疫治療的確切效果及相對安全性的基礎(chǔ)和臨床證據(jù)還不是相當(dāng)充分，現(xiàn)在只有少數(shù)的基礎(chǔ)和臨床得到與動物實驗比較相類似的結(jié)果。目前正在進(jìn)行各種臨床試驗，以測試CARNK細(xì)胞的潛力，臨床結(jié)果的改善是人們高度期待的。正在進(jìn)行的研究結(jié)果也將決定這種聯(lián)合療法在未來治療肺癌的發(fā)展軌跡。

3.2 免疫檢查點抑制劑

檢查點抑制劑代表了癌癥治療的一個重大性突破。肺癌細(xì)胞逃避宿主免疫系統(tǒng)的能力可能與CTLA-4和PD-1通路有關(guān)，使它們成為免疫調(diào)節(jié)的主要靶點。由于免疫檢查點抑制劑已經(jīng)證明了肺癌可以是一種免疫治療應(yīng)答性疾病，人們對肺癌冷凍消融的免疫方面重新產(chǎn)生了興趣。免疫療法的出現(xiàn)極大地改變了晚期非小細(xì)胞肺癌的治療格局。精準(zhǔn)調(diào)控PD-1/PD-L1通路的免疫檢查點抑制劑目前已成為Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌的一線治療藥物，多數(shù)肺癌臨床試驗中，只有20%左右的患者對ICI有反應(yīng)[18]，腫瘤特異性T細(xì)胞浸潤不足的NSCLC可能對治療有難治性，將腫瘤微環(huán)境中能夠刺激特異性T細(xì)胞浸潤策略的方式相結(jié)合，在臨床治療晚期肺癌可能發(fā)揮巨大作用[19]。CTLA-4阻斷劑及其在黑色素瘤治療中的臨床成功開創(chuàng)了檢查點抑制領(lǐng)域，進(jìn)而導(dǎo)致了其他靶點的開發(fā)，如PD-1/PD-L1軸靶點。在實體瘤動物模型上的聯(lián)合治療研究已經(jīng)證明了療效。Benzon等[20]研究表明冷消融和抗CTLA-4抗體一起抗腫瘤治療時能夠明顯抑制前列腺癌小鼠腫瘤的生長，聯(lián)合治療的死亡率相比單純冷凍消融治療的死亡率下降約1/3，有效顯示抗CTLA-4抗體能夠明顯增強冷凍消融術(shù)引起的免疫反應(yīng)。在肺癌治療中，冷凍消融肺癌可能被證明是一種啟動腫瘤對ICI反應(yīng)的有效輔助機制。

3.3 粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子

人體正常生理狀態(tài)下，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子在血漿中含量特別微量（10 pmol），而人體的感染、炎癥等機體病理狀態(tài)可以引起人體血漿中粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Granulocyte Macrophage Colony Stimulating factor，GM-CSF）含量有效升高。在機體發(fā)生感染和損傷的病理狀態(tài)時，GM-CSF不但能夠刺激人體骨髓的有效造血，它有利于人體微環(huán)境中粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的存活和功能存在，而且可通過有效延長粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的生命存活期來有效增大抗炎效應(yīng)[21]。一項小鼠皮下膠質(zhì)瘤模型研究表明，聯(lián)合治療可協(xié)同提高特異性抗腫瘤免疫，包括增加樹突狀細(xì)胞的活化和數(shù)量[22]。GM-CSF因為它比較強的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)和相當(dāng)?shù)偷亩拘宰兂筛鞣N類型腫瘤疫苗的特別重要的免疫佐劑，同樣在肺癌治療中發(fā)揮著巨大作用。

3.4 增加冷凍消融的壞死面積，減小凋亡面積

失控的壞死和受控的生理凋亡過程被認(rèn)為是細(xì)胞死亡的不同形式。壞死細(xì)胞與危險信號的釋放、專業(yè)抗原提呈細(xì)胞（樹突狀細(xì)胞）的成熟和免疫反應(yīng)的啟動有關(guān)，而凋亡細(xì)胞與誘導(dǎo)耐受有關(guān)，肺癌腫瘤細(xì)胞的壞死、凋亡之間的平衡是調(diào)節(jié)免疫效應(yīng)的關(guān)鍵點所在[23]。有研究認(rèn)為，細(xì)胞壞死后，壞死細(xì)胞裂解物碎片能釋放DNA、熱休克蛋白（Heat Shock Protein，HSP）等危險信號，這些危險信號具有免疫刺激作用，能夠有效刺激樹突狀細(xì)胞（DC）來有效激活T細(xì)胞，從而產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)[24]；然而有研究表明，細(xì)胞凋亡后，巨噬細(xì)胞或者樹突狀細(xì)胞吞噬其裂解物碎片，也不會釋放DNA、熱休克蛋白等危險信號，因此不能激活樹突狀細(xì)胞。沒成熟的樹突狀細(xì)胞或許能觸發(fā)免疫抑制反應(yīng)，從而使T細(xì)胞失去活性[25]。由于冷凍消融術(shù)所使用的冰球各部分溫度下降速率有差異，肺癌組織細(xì)胞中心位置發(fā)生壞死，周圍部分則發(fā)生凋亡。所以在冷凍消融治療腫瘤途中，如何有效增加壞死面積、最大可能減少凋亡面積比率是促使機體產(chǎn)生免疫最大化的2個主要因素。

3.5 抑制Tregs（抑制性細(xì)胞）

抑制性細(xì)胞（Tregs）是有效的抗腫瘤免疫抑制因子。在實驗?zāi)Ｐ脱芯恐邪l(fā)現(xiàn)，如果Treg數(shù)量減少或功能減弱時，抗腫瘤免疫反應(yīng)明顯增強[26]。所以，Treg耗竭有可能增強由另一種特殊方式產(chǎn)生的比較顯著的抗腫瘤免疫反應(yīng)。將冷凍消融術(shù)聯(lián)合使用抗CD25抗體去除抑制性細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)，小鼠肺癌模型中明顯顯示出增強的抗腫瘤免疫反應(yīng)現(xiàn)象。環(huán)磷酰胺目前已經(jīng)被證明通過對Treg的作用來減輕抗腫瘤免疫的抑制作用。環(huán)磷酰胺聯(lián)合治療能夠促進(jìn)這些細(xì)胞更高效的凋亡，從而有效降低了細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)增殖分化[27]。所以，冷凍消融聯(lián)合環(huán)磷酰胺進(jìn)行的癌癥免疫治療有可能潛在地增加抗腫瘤免疫反應(yīng)作用?；A(chǔ)實驗研究證實冷凍消融聯(lián)合環(huán)磷酰胺治療小鼠轉(zhuǎn)移癌的模型中效果比較明顯，對已建立的轉(zhuǎn)移疾病產(chǎn)生了50%的治愈率[28]。這種“冷凍免疫療法”策略有可能對控制多發(fā)性轉(zhuǎn)移性癌癥產(chǎn)生顯著影響。這是一個有巨大潛力的研究方向，對各種腫瘤的治療有顯著作用，在肺癌治療中也發(fā)揮著巨大作用，從而能明顯提高患者生活質(zhì)量和延長生存率。

3.6 Toll樣受體激動劑

TLR信號觸發(fā)巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（DCs）的代謝轉(zhuǎn)變，促進(jìn)從耐受性狀態(tài)到免疫原性狀態(tài)的轉(zhuǎn)換。這導(dǎo)致1型干擾素（IFNs）和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，實現(xiàn)T細(xì)胞免疫應(yīng)答[29]。與TLR類型的激動劑一起使用，可以明顯增強冷凍消融抗腫瘤的免疫反應(yīng)，從而增加抗腫瘤的作用。TLR激動劑和抗CD40、抗OX40和CD137這些類型的受體激動劑聯(lián)合運用能夠增加TLR的協(xié)同治療作[30]。另有研究發(fā)現(xiàn)，TLR1/2配體和全身性抗CTLA-4通過ADCC清除Tregs介導(dǎo)[31]可延緩腫瘤生長，提高生存期。現(xiàn)有的數(shù)據(jù)明確指出，通過聯(lián)合應(yīng)用TLR激動劑和檢查點封鎖，免疫的先天和獲得性手臂之間存在協(xié)同作用[32]。TLRs激動劑在肺癌治療領(lǐng)域也是一個具有美好前景的研究方向。

4 小結(jié)與展望

冷凍消融技術(shù)在肺癌治療過程中，不管是單獨使用，還是聯(lián)合其他方法使用，都對機體免疫產(chǎn)生巨大的影響。初步研究證實，冷凍消融與免疫調(diào)節(jié)療法結(jié)合時，肺癌疫苗樣效應(yīng)能明顯增強。冷凍消融可以作為一種體內(nèi)疫苗接種工具，冷凍消融是一種不需要肺癌腫瘤抗原表征的體內(nèi)疫苗接種工具，由于其能有效地誘導(dǎo)針對腫瘤抗原的全身免疫反應(yīng)，冷凍消融與新的治療選擇（粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、Toll樣受體激動劑、細(xì)胞過繼療法、免疫檢查點抑制劑等）將提供更廣泛的免疫增強療法，有望應(yīng)用于臨床。因此，探究最佳冷凍免疫參數(shù)和免疫調(diào)節(jié)療法的有機結(jié)合，是冷凍消融抗肺癌作用的巨大研究領(lǐng)域，更是腫瘤治療研究的延伸。

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