谷子MAPK家族成員的鑒定及其對生物脅迫的響應(yīng)分析

劉 佳 鄒曉悅 馬繼芳 王永芳 董志平 李志勇,* 白 輝,*

谷子MAPK家族成員的鑒定及其對生物脅迫的響應(yīng)分析

劉 佳1,**鄒曉悅1,2,**馬繼芳1王永芳1董志平1李志勇1,*白 輝1,*

1河北省農(nóng)林科學(xué)院谷子研究所 / 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部特色雜糧遺傳改良與利用重點實驗室(省部共建) / 河北省雜糧研究實驗室, 河北石家莊 050035;2河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 河北石家莊 050024

MAPK在植物的生長發(fā)育調(diào)節(jié)、生物和非生物脅迫反應(yīng)、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用。系統(tǒng)分析谷子基因家族成員全基因組分布、結(jié)構(gòu)、進化及其響應(yīng)不同脅迫的表達特性, 對于闡明其生物學(xué)功能具有重要意義。本研究利用谷子和水稻MAPK蛋白保守結(jié)構(gòu)域及特異TXY基序的氨基酸序列在全基因組水平鑒定了谷子家族成員, 分析其蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、系統(tǒng)進化、染色體定位、基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)保守基序、啟動子順式作用元件及共線性等。利用熒光定量PCR技術(shù), 分析了谷子在不同組織部位和谷銹菌、玉米螟病蟲害生物脅迫以及不同激素處理下的表達模式。結(jié)果顯示, 共鑒定到15個谷子成員, 其編碼的蛋白質(zhì)含有220～611個氨基酸, 相對分子量范圍25.77～69.63 kD, 等電點范圍5.46～9.34。系統(tǒng)進化分析表明,基因分為4組, A、B、C組包含TEY基序, D組包含TDY基序?；蚍植荚?號、3號、4號、5號、8號和9號染色體上, 含有3～11個外顯子, 所有SiMPK蛋白均含有motif 1與motif 2。上游2000 bp啟動子區(qū)域預(yù)測到多個與脅迫、激素和植物生長發(fā)育等相關(guān)的順式作用元件。qRT-PCR結(jié)果表明, 大部分基因具有明顯的組織表達特異性; 除和外, 其余成員對谷銹菌侵染、玉米螟取食、SA和MeJA激素處理等1～3種脅迫具有明顯響應(yīng)。以上結(jié)果為進一步研究基因在谷子應(yīng)對病蟲害生物脅迫中的功能奠定了理論基礎(chǔ)。

谷子; MAPK家族; 谷銹菌; 玉米螟; 表達分析

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK或MPKs)級聯(lián)途徑是真核生物中高度保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模塊, 通過逐級磷酸化反應(yīng)將不同的細胞外刺激與廣泛的細胞內(nèi)反應(yīng)聯(lián)系起來, 在多種生物過程中發(fā)揮著重要作用[1-3]。

植物中, MAPK級聯(lián)反應(yīng)主要由MAPK激酶激酶(MAPKKKK或MEKK)、MAPK激酶(MKK或MEK)和MAPK 3種順序磷酸化激活的蛋白激酶組成[4]。MAPK位于MAPK級聯(lián)途徑末端, 是連接上游MAPKK和下游底物的樞紐, 表現(xiàn)出更多的復(fù)雜性和序列多樣性[5]。MAPK在激酶結(jié)構(gòu)域VII和VIII之間的激活環(huán)中具有TEY或TDY磷酸化基序, 它們?yōu)镸APK的激活提供蛋白質(zhì)結(jié)合位點[6-7]。植物MAPK可分為A、B、C和D 4個組, 其中A、B和C組成員在其磷酸化位點具有TEY基序, 而D組成員具有TDY基序[4,6]。目前已經(jīng)在多種植物中對MAPK基因家族進行了系統(tǒng)鑒定與特征分析, 在模式植物擬南芥()[8]、水稻()[9]和二穗短柄草()[10]、玉米()[11]、大麥()[12]和小麥()[13]等禾本科作物中分別鑒定出20、17、16、19、20和54個MAPK基因。

MAPK在植物的生長發(fā)育、生物和非生物脅迫反應(yīng)、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中都發(fā)揮著重要作用[1,3-4,14-16]。在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育方面,激酶參與調(diào)節(jié)了擬南芥花藥、花序和胚胎的發(fā)育[17]。缺失的水稻植株具有矮化、小籽粒、直立和深綠色葉片等多效性的突變表型[18]。在植物應(yīng)對生物脅迫方面, 3個基因參與了水稻對稻瘟病的抗性反應(yīng), 其中[19]是正調(diào)控因子, 沉默該基因造成轉(zhuǎn)基因植株對稻瘟病的感病程度增強;與是負調(diào)控因子,的抑制表達導(dǎo)致和基因在dsRNAi轉(zhuǎn)基因水稻中組成性表達, 并顯著增強了對稻瘟病的抗性[20],基因敲除突變體不僅導(dǎo)致基因的組成性表達, 還導(dǎo)致活性氧積累增加、水楊酸(salicylic acid, SA)和茉莉酸(jasmonic acid, JA)通路相關(guān)基因顯著上調(diào)表達造成SA和JA等激素積累, 顯著增強了對稻瘟病的抗性, 說明通過SA和JA信號途徑負調(diào)控稻瘟病抗性[21]。此外, 也有研究表明參與了水稻對二化螟()的抗性。通過調(diào)節(jié)JA信號通路和促進胰蛋白酶抑制劑的積累來觸發(fā)水稻對二化螟的抗性[22],通過調(diào)節(jié)JA、乙烯(ethylene, ET)和SA信號通路來參與水稻對二化螟的抗性[23]。

谷子()是我國傳統(tǒng)的糧飼兼用作物, 具有抗旱耐瘠、營養(yǎng)豐富均衡、保健功能突出等特點, 是民眾膳食結(jié)構(gòu)改善和種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整的主體作物[24-25], 近年來, 在綠色可持續(xù)生態(tài)發(fā)展、質(zhì)量發(fā)展和營養(yǎng)導(dǎo)向型農(nóng)業(yè)發(fā)展需求下谷子產(chǎn)業(yè)發(fā)展進入了快車道[26]。但是谷子病蟲害仍然是谷子產(chǎn)業(yè)規(guī)模發(fā)展的限制因素之一。由粟單孢銹菌(Yoshino)侵染引起的谷子銹病屬于暴發(fā)流行性病害, 一旦發(fā)生會給谷子生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟損失[27]。亞洲玉米螟()以幼蟲咬食心葉, 并鉆蛀谷子莖稈和穗柄造成枯心或白穗, 嚴重發(fā)生時可引起植株倒折, 造成減產(chǎn)[28]。因此,揭示生物脅迫的抗性機制和識別抗性相關(guān)的基因家族至關(guān)重要。基于此, 本研究對谷子中MAPK基因家族進行了全面的研究, 包括系統(tǒng)發(fā)育、染色體定位、基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)保守基序、順式作用元件、物種內(nèi)和物種間的進化等生物信息學(xué)分析, 以及利用qRT PCR技術(shù)研究了谷子在不同組織部位、谷銹菌、玉米螟等病蟲害生物脅迫下以及不同激素處理下的表達模式, 旨在為研究谷子的功能和表達調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

谷子銹菌為強毒性小種A57的單孢菌系93-5, 菌種的擴繁與保存參照梁克恭等[29]方法。供試谷子材料為‘十里香’和‘豫谷1號’, 其中十里香對谷銹菌單孢菌系93-5表現(xiàn)抗病反應(yīng), 豫谷1號對93-5表現(xiàn)感病反應(yīng)。谷子在光照培養(yǎng)箱中進行盆栽試驗(塑料盆直徑12 cm), 培養(yǎng)箱溫度22℃, 光周期12 h/12 h。亞洲玉米螟原始種群采自石家莊欒城郄馬試驗站, 在光照培養(yǎng)箱中人工繼代培養(yǎng), 培養(yǎng)箱溫度27℃、相對濕度70%～80%、光周期16 h/8 h。

1.2 不同條件下的取材

(1) 谷子發(fā)育過程中的不同組織部位取材: 選取豫谷1號幼苗期地上部分、地下部分, 孕穗期的根、莖、葉、穗6個部位進行樣品采集; (2) 谷銹菌接種處理和激素處理均按照白輝等[30]方法, 谷銹菌處理的葉片取材時間是接種后0、8、12、16和24 h, 激素處理的葉片取材時間是0、8、12、16、24和48 h; (3) 玉米螟為害誘導(dǎo)處理與取材: 選取五葉期的健康幼苗, 用小毛筆輕輕地在谷子葉片上接種20頭預(yù)先饑餓處理的2齡幼蟲, 待幼蟲取食0、8、12、24和48 h后收集葉片。上述收集的樣品均為3個生物學(xué)重復(fù), 液氮速凍后,-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 谷子MAPK家族成員的鑒定

從水稻數(shù)據(jù)庫TIGR (http://rice.uga.edu/)下載已報道的17條水稻MAPK蛋白序列[9], 利用Muscle及HMM3.0建立MAPK的hmm模型。通過該模型及HMM3.0軟件對谷子蛋白質(zhì)組序列(https://phy-tozome-next.jgi.doe.gov/info/Sitalica_v2_2)進行搜索, 閾值<0.01, 獲取可能的MAPK候選基因。對候選基因進行TEY或TDY基序篩選以確保所有成員具有該結(jié)構(gòu), 之后通過NCBI保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)核實所有候選基因都具有蛋白激酶結(jié)構(gòu)域, 最后對候選基因進行冗余檢查和命名。利用ExPASy (https://web.expasy.org/ protparam/)、CELLO v.2.5 (http://cello.life.nctu.edu.tw/)和SignalP (https://services.healthtech.dtu.dk/service. php?SignalP-4.1)分別進行谷子MAPK基因家族理化性質(zhì)、亞細胞定位和信號肽預(yù)測。

1.4 谷子MAPK家族成員的系統(tǒng)進化分析

利用MEGA 7.0軟件采用鄰接法(Neighbor- Joining, NJ)對鑒定出的15條谷子MAPK蛋白序列和已報道的20條擬南芥MAPK蛋白序列[8]、17條水稻MAPK蛋白序列[9]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。設(shè)置參數(shù)為: Bootstrap method、1000 bootstrap replications、Partial deletion以及50% Site coverage cutoff。

1.5 谷子MAPK家族成員的染色體位置、基因結(jié)構(gòu)、保守基序分析

從Phytozome下載谷子基因組結(jié)構(gòu)注釋文件, 使用TBtools[31]Gene Location Visualize from GTF/ GFF功能繪制谷子MAPK基因的染色體物理分布圖;將谷子15條MAPK蛋白序列提交到MEME (https:// meme-suite.org/meme/tools/meme)進行Motif預(yù)測, 參數(shù)設(shè)置: 基序數(shù)目15個, 其余參數(shù)默認, 通過TBtools Gene Structure View (Advanced)功能對基因結(jié)構(gòu)和保守基序繪圖展示。

1.6 谷子MAPK基因家族共線性分析

從Phytozome下載谷子基因組序列文件和基因結(jié)構(gòu)注釋文件, 運用TBtools進行谷子全基因組序列自身比對和谷子MAPK基因家族復(fù)制分析并展示。從擬南芥數(shù)據(jù)庫TAIR (http://www.arabidopsis. org/)和水稻數(shù)據(jù)庫TIGR分別獲取擬南芥和水稻的全基因組序列文件和基因結(jié)構(gòu)注釋信息文件, 將谷子全基因組序列通過TBtools分別與擬南芥、水稻全基因組序列比對, 進行谷子與擬南芥、谷子與水稻的基因共線性關(guān)系分析與展示。

1.7 啟動子順式作用元件分析

通過TBtools提取谷子MAPK家族基因起始密碼子上游2000 bp的序列, 在PlantCARE網(wǎng)站(http:// bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進行啟動子順式作用元件預(yù)測分析, 利用TBtools Basic BioSequence Viewer功能進行可視化展示。

1.8 谷子總RNA提取、實時熒光定量PCR檢測與分析

采用RNA Easy Fast植物組織RNA快速提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司, DP452)提取不同處理谷子樣品的總RNA, 通過FastKing cDNA第1鏈合成試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司, KR112)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA, 作為qRT-PCR的模板。選用谷子肌動蛋白基因()作為內(nèi)參基因。qRT-PCR反應(yīng)體系為20 μL: 10 μL TB Green Premix ExII (TaKaRa, RR820A)、0.8 μL上/下游引物、2 μL cDNA模板和6.4 μL滅菌雙蒸水。反應(yīng)程序為95℃預(yù)變性30 s; 95℃變性5 s, 60℃退火加延伸30 s, 共40個循環(huán)收集熒光信號[30]。每個反應(yīng)3次重復(fù), 采用2-ΔΔCt法計算谷子MAPK基因在不同樣品中的相對表達量, 與對照相比, 將差異倍數(shù)≥1.5作為差異表達的篩選標準, 使用SPSS26.0進行顯著性分析。用于qRT-PCR的引物信息見表1。

表1 引物序列表

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子MAPK家族成員的鑒定與分析

在谷子基因組中共鑒定到15個MAPK基因, 基于谷子中MAPK蛋白序列與水稻MAPK蛋白序列的同源關(guān)系, 將谷子中MAPK基因依次命名為、、、、、、、、、、、、、和。所有的谷子MAPK都包含TEY或TDY磷酸化位點。15個編碼蛋白質(zhì)長度在220～611 aa之間, 分子量在25.77～69.63 kD之間, 等電點介于5.46～9.34之間。亞細胞定位預(yù)測顯示7個SiMPK蛋白質(zhì)位于細胞質(zhì), 其余8個蛋白質(zhì)位于細胞核中。所有SiMPK蛋白質(zhì)都不具有信號肽(表2)。

2.2 谷子MAPK家族成員的系統(tǒng)進化分析

為研究MAPK蛋白之間的進化關(guān)系, 利用谷子15個、擬南芥20個、水稻17個的氨基酸序列構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹(圖1)。結(jié)果表明, 15個被分為A、B、C和D組。其中A、B和C組的具有TEY基序, D組的具有TDY基序。A組包括和, B組僅有, C組包括和, 而剩余10個全部分配到D組(圖1), 可見, D組數(shù)量最多, B組數(shù)量最少。而且其他2個物種在D組中的MAPK成員數(shù)量也最多, 因此D組基因的擴展為谷子的基因組進化分析提供了參考。

2.3 谷子MAPK家族成員的染色體位置分析

對谷子染色體上MAPK基因位置分析(圖2)發(fā)現(xiàn), 15個基因不均勻的分布于6條染色體上, 3號染色體分布4個基因, 4號和5號染色體均分布3個基因, 1號和9號染色體均分布2個基因, 8號染色體僅分布1個基因。此外, 沒有出現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)的基因, 物理距離最小的和基因之間距離為349 kb。而且, 屬于系統(tǒng)進化樹中同一組的基因分布在不同的染色體上, 或者是部分基因分散在同一條染色體上的不同位置。如D組的10個分布在1號、3號、4號和5號染色體上, 其中、、和分散在3號染色體的不同位置。

表2 谷子SiMPK家族成員特征

圖1 谷子、水稻和擬南芥中MAPK基因家族系統(tǒng)發(fā)育進化樹

Si: 谷子; Os: 水稻; At: 擬南芥。

Si:: Os:: At:.

圖2 SiMPK基因在谷子染色體上的分布

2.4 谷子MAPK家族成員基因結(jié)構(gòu)、保守基序及結(jié)構(gòu)域分析

對15個基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)進行了分析, 如圖3所示, 結(jié)合進化分析發(fā)現(xiàn), A組中和分別由6個和5個外顯子組成, B組包含7個外顯子, 而C組的和只有3到4個外顯子, D組的10個成員中, 除了含有4個外顯子外, 其余9個基因存在9到11個外顯子, 說明不同組中的基因具有顯著不同的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu), 但同一組的基因結(jié)構(gòu)相似, 且外顯子區(qū)段的大小和分布相近。

利用NCBI和MEME在線網(wǎng)站對谷子MAPK蛋白序列進行結(jié)構(gòu)域和保守基序分析(圖3和圖4)發(fā)現(xiàn),其中motif 1與motif 2存在于所有SiMPK蛋白中, motif 7包含TDY特征基序, 存在于D組成員中; motif 8包含TEY特征基序, 存在于A、B、C組成員中。在MAPK蛋白N端, A、B、C組成員包含motif 15, D組成員包含motif 8; 在C端, A、B組成員均具有一個CD結(jié)構(gòu)域, 位于motif 13, C組和D組沒有該結(jié)構(gòu)域, C組成員包含motif 14, D組成員(除外)包含motif 10, 并且D組有一個相對較長的C末端區(qū)域, 說明同一組成員具有相似的保守基序。

2.5 谷子MAPK家族成員啟動子順式作用元件分析

起始密碼子上游2000 bp的序列進行順式作用元件分析(圖5)表明, 15個啟動子區(qū)域除具有CAAT框、TATA框保守元件外, 還具有15種419個與脅迫、激素和植物生長發(fā)育等相關(guān)的重要順式作用元件。啟動子序列中的1742 bp是N, 因此該基因啟動子只鑒定到1個與分生組織表達相關(guān)的順式調(diào)節(jié)元件, 而其他14個的啟動子區(qū)域均鑒定到了6～11種順式作用元件。所有14個的啟動子都包含光響應(yīng)元件。大多數(shù)啟動子中的順式作用元件參與了脅迫反應(yīng), 其中3個(、和)啟動子含有防御和脅迫響應(yīng)順式作用元件, 3個(、和)啟動子含有低溫脅迫響應(yīng)順式作用元件, 10個(、、、、、、、、和)啟動子包含厭氧誘導(dǎo)所必需的順式調(diào)節(jié)元件, 10個(、、、、、、、、和)啟動子含有與缺氧特異性誘導(dǎo)有關(guān)的增強子樣元件, 8個(、、、、、、和)啟動子含有參與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點。每個啟動子都含有3～5個激素(茉莉酸甲酯、脫落酸、水楊酸、赤霉素、生長素)響應(yīng)元件。此外還有3個的啟動子包含參與玉米醇溶蛋白代謝調(diào)節(jié)的O2位點, 9個的啟動子具有參與分生組織表達的CAT框, 2個的啟動子具有參與胚乳表達所需的GCN4基序。這些結(jié)果說明了谷子基因家族在植物生長發(fā)育、脅迫應(yīng)答和激素信號通路中可能具有重要作用。

Motif: 保守基序; UTR: 非翻譯區(qū); CDS: 編碼區(qū)序列。

Motif: conserved base sequence; UTR: untranslated region; CDS: coding region sequence.

圖4 谷子MAPK保守基序的序列Logo

圖5 谷子15個SiMPK基因啟動子中順式作用元件

2.6 谷子MAPK家族成員共線性分析

通過TBtools分析谷子基因間可能的關(guān)系和潛在的基因重復(fù)(圖6)發(fā)現(xiàn), 谷子的染色體上存在4對片段重復(fù), 2個配對的基因(、)位于1號和4號染色體上,配對基因位于5號染色體上,配對基因存在于1號和3號染色體上。

對谷子與擬南芥及水稻之間的MAPK分別進行共線性分析(圖7)發(fā)現(xiàn), 谷子與擬南芥之間的基因不存在共線性的基因組區(qū)域(未附圖), 21個匹配的同源基因?qū)ξ挥诠茸优c水稻基因組之間具有共線性的基因組區(qū)域。除與外, 谷子其余基因都能在水稻中匹配到同源基因, 其中8個基因(、、、、、、和)分別與2個基因存在同源對, 5個基因(、、、、)分別與1個基因存在同源對, 表明基因和基因之間的相關(guān)性相似, 這對分析物種間的進化關(guān)系和預(yù)測基因功能具有重要意義。

2.7 谷子MAPK基因不同發(fā)育時期組織部位表達模式分析

qRT-PCR表達模式分析如圖8所示, 在谷子苗期,在地上部分表達水平高于地下部分;、與地下部分表達水平高于地上部分, 其他基因在地上和地下部分的表達水平差異不顯著。在孕穗期, 較其他3個組織,、、和在根中表達水平最高,、、、、和在根中表達水平最低;、在莖中表達水平最高; 每個基因在莖中的表達水平都高于葉片, 其中、、、、、和的表達量差異顯著;、和在穗中的表達量顯著高于其他組織。

圖6 谷子MAPK基因家族共線性分析

圖7 谷子與水稻MAPK基因的共線性分析

圖8 SiMPK家族基因在谷子不同組織部位中的表達分析

SD: 苗期; BT: 孕穗期; shoot: 苗期地上部; root: 苗期地下部或孕穗期根。不同字母表示差異水平顯著(< 0.05)。

SD: seedling stage; BT: booting stage; shoot: the aboveground part at seedling stage; root: the underground part at seedling stage or root at booting stage. The different letters mean significant difference at the 0.05 probability level.

2.8 谷子MAPK基因在谷銹菌侵染下的表達模式分析

在谷銹菌侵染谷子后轉(zhuǎn)錄水平表達分析結(jié)果(圖9)表明, 除未檢測到明顯信號外, 其余14個均有表達。、和在抗病(R: 十里香-93-5)、感病(S: 豫谷1號-93-5)反應(yīng)中沒有發(fā)生明顯的表達變化。、、、和在R、S反應(yīng)中表達趨勢一致, 其中前4個基因均表達上調(diào),下調(diào)表達, 推測5個基因在谷子基礎(chǔ)免疫反應(yīng)中起作用。、和在R反應(yīng)12 h顯著上調(diào)表達,與在S反應(yīng)全程下調(diào)表達,在S反應(yīng)中表達不變;在R反應(yīng)12、16 h下調(diào)表達, S反應(yīng)8 h上調(diào)表達, 推測這4個基因與抗病相關(guān)。此外,的表達在S反應(yīng)中下調(diào), R反應(yīng)中不變;的上調(diào)表達S反應(yīng)早于R反應(yīng)。

圖9 谷子SiMPK基因在谷銹菌侵染的谷子葉片中的表達分析

* 代表基因在同一時間點的抗病反應(yīng)與感病反應(yīng)中的相對表達量在0.05概率水平差異顯著。

* represents that the relative expression levels of genes in disease-resistant and disease-sensitive reactions at the same time point are significantly different at the probability level of 0.05.

2.9 谷子MAPK基因在玉米螟取食下的表達模式分析

在谷子被玉米螟取食后的qRT-PCR表達模式分析如圖10所示, 除未檢測到表達信號外, 其余14個SiMPK基因均有不同程度的表達。在玉米螟取食12 h內(nèi)上調(diào)表達,在48 h上調(diào)表達。、、、、、、、和在48 h內(nèi)下調(diào)表達, 其中和在0 h至48 h持續(xù)下調(diào)。在48 h內(nèi)的表達先上調(diào)再下調(diào), 12 h達到峰值, 是0 h表達量的1.87倍。和在48 h內(nèi)的表達均無明顯變化, 推測這2個基因可能不參與對蟲害脅迫的響應(yīng)。

2.10 谷子MAPK基因在外接SA和MeJA后的表達模式分析

qRT-PCR表達模式分析如圖11所示, 除同樣無信號外, 其余14個SiMPK基因在SA與MeJA處理中的表達模式較一致。、、和四個基因在SA與MeJA處理后的48 h內(nèi)誘導(dǎo)表達, 其中的表達在MeJA處理的48 h達到峰值, 是0 h的4.34倍,在SA與MeJA處理后的8 h和12 h均明顯上調(diào)表達。、和在2種激素處理后的48 h內(nèi)下調(diào)表達。、的表達在SA與MeJA處理后的48 h內(nèi)先下調(diào)再上調(diào), 其中在SA處理的16 h達到峰值, 是0 h表達量的5.8倍。的表達在SA處理的16～48 h先上調(diào)再下調(diào), 而在JA處理后期持續(xù)下調(diào);的表達與之相反。、和在SA與JA處理后的48 h內(nèi)表達均無明顯變化, 推測這3個基因可能不參與谷子對SA與MeJA的響應(yīng)。

圖10 谷子SiMPK基因在玉米螟取食的谷子葉片中的表達分析

* 代表基因在玉米螟取食后不同時間點的葉片中的相對表達量與0 h相比在0.05概率水平差異顯著。** 代表在0.01概率水平差異顯著, *** 代表在0.001概率水平差異顯著。

* represents that the relative expression levels of genes in the leaves at different time points after being fed byare significantly different at the probability level of 0.05 compared with 0 h. **:< 0.01; ***:< 0.001.

* 代表基因在SA/JA處理谷子葉片后不同時間點的相對表達量與0 h相比在0.05概率水平差異顯著, ** 代表在0.01概率水平差異顯著, *** 代表在0.001概率水平差異顯著。

* represents that the relative expression levels of genes in the leaves at different time points after SA/JA treatment are significantly different at the probability level of 0.05 compared with 0 h; **:< 0.01; ***:< 0.001.

3 討論

3.1 谷子MAPK基因家族的生物學(xué)特征

MAPK是信號級聯(lián)途徑的重要組成部分, 與植物的生長發(fā)育和環(huán)境脅迫響應(yīng)有關(guān)。2015年Mohanta等[32]在全基因組范圍內(nèi)對40個物種的基因進行了鑒定, 在谷子豫谷1號參考基因組2.1版本基礎(chǔ)上鑒定到16個SiMPK基因。本研究在谷子基因組2.2版本基礎(chǔ)上鑒定到15個SiMPK基因, 并根據(jù)與水稻的同源序列相似性進行了命名。與之前版本相比, 本次鑒定到的基因糾正了3個基因的命名(修改為、修改為、修改為), 去掉了與重復(fù)的原和無TXY結(jié)構(gòu)的原, 增加了一個與水稻同源的基因, 命名為, 該基因編碼的氨基酸長度只有220 aa, 是所有基因編碼蛋白質(zhì)中最短的, 并且啟動子序列中1742 bp的長度全部是N, 可能與谷子基因組測序質(zhì)量和注釋有關(guān)。

MAPK的特征是激活環(huán)區(qū)域存在保守的TEY/TDY基序。根據(jù)系統(tǒng)進化樹、基因結(jié)構(gòu)與保守基序的分析, 15個分為了A、B、C和D四組, 其中A、B和C組成員具有TEY基序, 位于motif 8; D組成員具有TDY基序, 位于motif 7, 這與其他植物如擬南芥、大麥、高粱、二穗短柄草、鷹嘴豆等分析結(jié)果一致[10,12,14,33-34]。有趣的是, motif 8不僅存在于A、B、C組的MAPK激活環(huán)區(qū)域, 還存在于D組成員的N端, 保守基序是TEY、TDY和SEY, 這與文獻報道也是一致的[32]。此外, A、B組的3個基因的C端區(qū)域包含一個CD結(jié)構(gòu)域, 位于motif 13, 保守基序為DIXD/EEPXC, 與二穗短柄草、鷹嘴豆等文獻報道的DxxDE(P)xC基序略有不同, 該結(jié)構(gòu)域作為MAPK級聯(lián)途徑中MAPKK的結(jié)合位點發(fā)揮作用[14,33]。對外顯子-內(nèi)含子的數(shù)量和順序的分析表明, 同一組的外顯子和內(nèi)含子的數(shù)量和排列順序相同或相似, D組的外顯子和內(nèi)含子的數(shù)量多于A、B、C組, 這與其他物種中相關(guān)分析結(jié)果一致, 進一步說明了MAPK基因家族的保守性, 而不同的基因結(jié)構(gòu)可能是由于進化過程中的基因突變造成[35]。

在植物基因組進化過程中, 單個基因、染色體片段甚至整個基因組的復(fù)制是基因組形成和進化的主要力量[36]。谷子的染色體上共存在4對片段重復(fù),配對基因位于染色體5上, 是同一染色體內(nèi)的非串聯(lián)重復(fù)的復(fù)制傳播, 其他配對基因都位于不同染色體上, 這表明在谷子基因組進化過程中, 復(fù)制事件和染色體片段的易位可能在這些基因家族的擴展中發(fā)揮重要作用[36-37]。通過對谷子與水稻和擬南芥之間的同源性分析發(fā)現(xiàn),谷子中87%的基因與水稻基因組的同源基因具有共線性, 而與擬南芥的同源基因不具有共線性, 并且谷子中連鎖的基因在水稻上的同源基因也以相同的方向連鎖排列, 如//和//。這種情況被解釋為隨機易位和插入事件造成, 或者認為谷子或水稻在進化過程中接受了祖先物種提供的基因組區(qū)域[10]。

3.2 谷子MAPK基因家族成員的時空表達特征比較

在本研究中,呈現(xiàn)出發(fā)育時期特異性的表達模式, 如和的根部在孕穗期表達量較苗期顯著下降;和的葉片在孕穗期表達量較苗期顯著下降, 而、、和的葉片在孕穗期表達量較苗期顯著增加;的表達量在苗期地下部高于地上部, 而孕穗期相反, 說明上述基因參與了谷子器官發(fā)育過程的調(diào)控。在谷子“小米”組織部位的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果[38]中,、和的葉片表達量在生長3周的苗期顯著高于孕穗期, 與我們的試驗結(jié)果一致。此外, 在普通小麥中,和分別只在根和花中表達[39]?？嗍w中,在葉和花中特異性表達,和在莖中高表達[35]。也呈現(xiàn)出組織特異性表達模式, 如孕穗期的、、和在根中表達水平最高,和在莖中表達水平最高,、和在穗中的表達量最高, 與谷子“小米”[38]中和在抽穗期和授粉期的穗部高表達結(jié)果是一致的,基因在不同組織中的高度表達表明它們可能在谷子器官發(fā)育中起重要作用。

3.3 谷子MAPK基因家族成員在生物脅迫與激素處理下的表達特征比較

激素SA和JA作為重要的信號分子參與植物的生物脅迫反應(yīng), 它們之間既有拮抗, 也存在協(xié)作。JA處理的水稻可誘導(dǎo)的表達, 過表達增強了水稻對二化螟的抗性[23]。本研究中,在谷子中的同源基因的表達在R、SA和MeJA反應(yīng)中均表現(xiàn)上調(diào)(JA誘導(dǎo)程度明顯高于SA), 而S反應(yīng)中不變, 而在玉米螟取食24～48 h表現(xiàn)下調(diào);的啟動子同時具有防御和JA 2種響應(yīng)元件, 因此推測與相似, 通過JA信號途徑正調(diào)控谷子對谷銹菌的抗性, 可能在谷子響應(yīng)玉米螟取食脅迫中起負調(diào)控作用。通過介導(dǎo)JA信號通路觸發(fā)水稻對二化螟的抗性[22],可被SA、JA和細菌病原菌誘導(dǎo), 過表達增強了水稻對白葉枯病菌及條斑病菌的抗病性[40]。本研究中,的同源基因和的同源基因在R反應(yīng)中上調(diào)表達, 在S、SA、MeJA反應(yīng)及玉米螟取食后下調(diào)表達,的啟動子具有SA和JA響應(yīng)元件,的啟動子具有JA和防御響應(yīng)元件, 推測這2個基因正調(diào)控谷子對谷銹病的抗性, 通過SA或JA信號途徑負調(diào)控谷子對玉米螟取食脅迫的響應(yīng)。抑制表達能夠增加棉花對尖孢鐮刀菌的耐受性[41], 其在谷子中的同源基因具有相似的表達模式在R反應(yīng)中下調(diào)表達, S、SA與JA反應(yīng)中上調(diào)表達且在玉米螟取食的前12 h表達量逐漸升高, 推測負調(diào)控谷子對銹病的抗性, 通過調(diào)控SA、JA信號途徑正調(diào)控谷子對玉米螟取食脅迫的響應(yīng)。由此可見,與SA、JA信號分子在谷子中的相互作用機制以及在谷子應(yīng)對生物脅迫反應(yīng)中的作用仍需進一步研究。

4 結(jié)論

本研究鑒定出15個谷子MAPK家族成員, 分屬4個組, A、B、C組具有TEY基序, D組具有TDY基序?；虮磉_分析表明大部分家族成員具有明顯的組織特異性; 除和外, 其余13個成員在谷銹菌侵染、玉米螟取食和SA、MeJA激素處理等1～3種脅迫中具有不同的應(yīng)答模式。

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Genome-wide identification and characterization of MAPK genes and their response to biotic stresses in foxtail millet

LIU Jia1.**, ZOU Xiao-Yue1,2,**, MA Ji-Fang1, WANG Yong-Fang1, DONG Zhi-Ping1, LI Zhi-Yong1,*, and BAI Hui1,*

1Institute of Millet Crops, Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences / Key Laboratory of Genetic Improvement and Utilization for Featured Coarse Cereals (Co-construction by Ministry and Province), Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Key Laboratory of Minor Cereal Crops of Hebei Province, Shijiazhuang 050035, Hebei, China;2College of Life Sciences, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050024, Hebei, China

MAPK plays an important role in plant growth and development regulation, biotic and abiotic stress responses, and hormone signal transduction. In order to elucidate the biological function of thegenes in foxtail millet, we identified thefamily members in the genome and analyzed the distribution, structure, evolution, and its expression characteristics in response to different stresses. In this study, thegene family members were identified in the genome-wide level using the amino acid sequences of conserved domains and specific TXY motifs of MAPK proteins between foxtail millet and rice. The protein physicochemical property, phylogenetic evolution, chromosome distribution, gene structure, protein conserved motif, promoter-acting regulatory elements, and collinearity were analyzed. The relative expression patterns ofgenes in the different tissue, under the biotic stresses ofYoshino andand with different hormone treatments were analyzed by qRT-PCR. The results showed that a total of 15genes were identified, and the encoded proteins contained 220–611 amino acids, the relative molecular weight ranged from 25.77 kD to 69.63 kD, and the isoelectric point ranged from 5.46 to 9.34. Phylogenetic analysis showed thatgenes were divided into four groups. Group A, B, and C contained TEY motifs, and group D contained TDY motifs.genes were distributed on chromosomes 1, 3, 4, 5, 8, and 9, and contained 3–11 exons. All SiMPK proteins contained motif 1 and motif 2. A number of cis-acting elements related to stress, hormones and plant growth and development were predicted in the promoter regions of thegenes. Most genes had obvious tissue expression specificity. Except forand, the other members had obvious responses to 1 to 3 kinds of stresses, such asYoshino infection,feeding, and SA and MeJA treatments. The results laid a theoretical foundation for further research on the function ofgenes in the biotic stresses of disease and pest in foxtail millet.

foxtail millet (); MAPK gene family;Yoshino;; relative expression analysis

10.3724/SP.J.1006.2023.24113

本研究由國家重點研發(fā)計劃項目(2018YFD1000703, 2018YFD1000700), 國家自然科學(xué)基金項目(31872880), 河北省農(nóng)林科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費包干制項目(HBNKY-BGZ-02), 財政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-06-14.5-A25)和河北省重點研發(fā)計劃項目(21326338D)資助。

This study was supported by the National Key Research & Development Program of China (2018YFD1000703, 2018YFD1000700), the Natural Science Foundation of China (31872880), HAAFS Basic Science and Technology Contract Project (HBNKY-BGZ-02), the China Agriculture Research System of MOF and MARA (CARS-06-14.5-A25), and the Hebei Key Research & Development Program (21326338D).

李志勇, E-mail: lizhiyongds@126.com; 白輝, E-mail: baihui_mbb@126.com

**同等貢獻(Contributed equally to this work)

劉佳, E-mail: 15031210252@126.com; 鄒曉悅, E-mail: z_xiaoyue@126.com

2022-05-05;

2022-07-21;

2022-08-09.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220809.1006.003.html

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