胞外囊泡在急性髓系白血病發(fā)生發(fā)展及診治中作用的研究進(jìn)展

周雙雄，趙紅麗，洪珞珈

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院，哈爾濱150000

胞外囊泡(EVs)是體內(nèi)不同種類細(xì)胞膜來(lái)源的囊泡，包括從細(xì)胞膜表面釋放的微粒(MPs，直徑<1 000 nm)和來(lái)自細(xì)胞腔內(nèi)的外泌體(直徑30～100 nm)。最初，EVs被認(rèn)為是沒(méi)有真正生物學(xué)意義的細(xì)胞膜碎片；隨著研究的深入，EVs在細(xì)胞間通過(guò)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸的轉(zhuǎn)移進(jìn)行通信的重要性在許多研究中得到證實(shí)，參與包括腫瘤在內(nèi)的各種疾病的發(fā)生。在急性髓系白血病(AML)中，越來(lái)越多研究表明EVs在其凝血異常、疾病進(jìn)展、生物標(biāo)志物及化療耐藥等多方面發(fā)揮作用?，F(xiàn)綜述如下。

1 EVs在AML發(fā)生發(fā)展中的作用

1.1 參與凝血異常 凝血異常是AML的重要并發(fā)癥，出血主要與獲得性血小板功能異常、循環(huán)抗凝血?jiǎng)?、?nèi)皮損傷和肝功能障礙有關(guān)，血栓主要與感染、組織因子(TF)、蛋白質(zhì)C、MPs、炎性細(xì)胞因子等因素有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，MPs上暴露的磷脂酰絲氨酸(PS)及TF，在機(jī)體凝血反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。PS為凝血復(fù)合物提供了催化表面，有助于凝血過(guò)程的起始和維持；TF通過(guò)與FⅦ/FⅦA的相互作用，啟動(dòng)外源性凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，是體內(nèi)凝血的主要生理引發(fā)因子。另外，MPs還能通過(guò)FⅫ/FⅪ依賴的方式激活內(nèi)源性凝血途徑啟動(dòng)凝血反應(yīng)。MPs在AML的凝血活化中同樣發(fā)揮重要作用。AML中MPs的促凝活性(PCA)較正常增高，主要是由于TF在MPs表面大量表達(dá)，從而觸發(fā)了凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，在急性早幼粒細(xì)胞白血病中，MPs的PCA明確與PS相關(guān)[2]，且部分化療藥物可能增加MPs的PCA[3]。此外，有研究表明EVs能降低TF通路抑制劑的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)凝血激活。

1.2 促進(jìn)血管形成 MPs參與腫瘤血管生成的各個(gè)階段，其表面存在促血管生成因子，并能刺激內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)促血管生成因子[4]。在AML中，血管生成是白血病發(fā)生發(fā)展和化療敏感性的重要因素。新診斷的AML患者骨髓血管增多與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)高表達(dá)相關(guān)[5]。Huan等[6]研究表明，將AML細(xì)胞Molm來(lái)源外泌體與OP9細(xì)胞共培養(yǎng)后，VEGF轉(zhuǎn)錄水平升高。這提示在AML中細(xì)胞外泌體能通過(guò)刺激細(xì)胞表達(dá)VEGF，進(jìn)而調(diào)節(jié)血管生成。近期研究發(fā)現(xiàn)，AML細(xì)胞來(lái)源的外泌體含有VEGF和VEGF受體(VEGFR)信使RNA，該信使RNA能在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)中誘導(dǎo)VEGFR表達(dá),促進(jìn)HUVECs的成管活性，促進(jìn)AML血管形成[7]。

1.3 抑制骨髓造血 骨髓造血功能異常導(dǎo)致血細(xì)胞減少是AML的常見(jiàn)表現(xiàn)，也是影響患者生存及治療的一大難題。AML來(lái)源的外泌體可通過(guò)RNA來(lái)改變?cè)煅h(huán)境內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而對(duì)殘余骨髓造血產(chǎn)生影響[6]。Hornick等[8]研究表明，外泌體可通過(guò)miRNA的傳遞下調(diào)包括c-MYB在內(nèi)的關(guān)鍵造血調(diào)節(jié)因子，減少造血祖細(xì)胞的集落形成來(lái)抑制造血。此外，外泌體還可能通過(guò)使骨髓基質(zhì)細(xì)胞支持因子和趨化因子失調(diào)，間接地調(diào)節(jié)造血干/祖細(xì)胞功能[9]。研究發(fā)現(xiàn)，AML來(lái)源的EVs相較于正常CD34+細(xì)胞miR-7977表達(dá)增高，轉(zhuǎn)染miR-7977到間充質(zhì)干細(xì)胞后，使多聚C結(jié)合蛋白1(PCBP1)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子的表達(dá)降低，造血生長(zhǎng)因子減少，導(dǎo)致骨髓CD34+細(xì)胞的造血支持能力下降。這提示EVs的miR-7977可抑制PCBP1，是導(dǎo)致正常造血減少的一個(gè)重要因素[10]。

1.4 改變骨髓造血微環(huán)境 骨髓造血微環(huán)境最早被認(rèn)為是一種惰性結(jié)構(gòu)，僅為骨髓造血干/祖細(xì)胞提供造血場(chǎng)所；后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，骨髓造血微環(huán)境的逐步重建是白血病發(fā)生的一個(gè)重要方面。AML克隆增殖不僅改變骨髓基質(zhì)成分，而且抑制正常造血，這是患者發(fā)病和死亡的一個(gè)重要原因[11]。其中，AML外泌體對(duì)骨髓造血微環(huán)境的改變發(fā)揮重要作用。Peinado等[12]發(fā)現(xiàn)，將小鼠轉(zhuǎn)移性黑色素瘤腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體轉(zhuǎn)移到骨髓，可抑制正常造血，使骨髓造血微環(huán)境有利于腫瘤細(xì)胞生存。在AML中分泌的外泌體，能通過(guò)增加體內(nèi)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞(MSC)的數(shù)量及促進(jìn)其產(chǎn)生IL-8來(lái)改變骨髓造血微環(huán)境，促進(jìn)疾病的發(fā)展及化療耐藥[13]。近期研究發(fā)現(xiàn)，AML中白血病細(xì)胞來(lái)源的外泌體處理的骨髓基質(zhì)細(xì)胞使支持正常造血的基因(CXCL12、KITL、IL-7和IGF1)和成骨基因(OCN、Col1A1和IGF1)的表達(dá)降低，而支持AML生長(zhǎng)的基因(DKK1、IL-6和CCL3)表達(dá)增高[14]。而且，白血病細(xì)胞外泌體可誘導(dǎo)從氧化磷酸化到無(wú)氧糖酵解的代謝轉(zhuǎn)變。這種代謝改變和缺氧在白血病骨髓造血微環(huán)境中作用顯著，進(jìn)一步促進(jìn)外泌體從母細(xì)胞和(或)間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞釋放，上調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)表達(dá)，激活A(yù)ML細(xì)胞；并且，由此激活的CXCR4/SDF-1通路能抑制免疫細(xì)胞活性，同時(shí)增加E-選擇素表達(dá)水平，其能調(diào)控細(xì)胞黏及其從骨髓向外遷移[15]。

1.5 影響免疫系統(tǒng) 正常情況下機(jī)體能免疫識(shí)別腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)對(duì)自身腫瘤細(xì)胞進(jìn)行清除。有研究表明，腫瘤來(lái)源的外泌體富含免疫抑制分子，包括FasL、PD-L1和TRAIL等死亡受體配體以及IL-10和TGF-β1等抑制因子[16]。體外實(shí)驗(yàn)表明，AML血漿中的外泌體通過(guò)下調(diào)NKG2D在正常人NK細(xì)胞中的表達(dá)水平，降低NK細(xì)胞毒性；用TGF-β1抗體中和AML外泌體源性的TGF-β1后，NK細(xì)胞功能部分恢復(fù)，提示外泌體源性的TGF-β1是AML中NK細(xì)胞功能障礙的可能原因[17]。Hong等[18]通過(guò)研究AML外泌體對(duì)過(guò)繼免疫治療的影響，進(jìn)一步證實(shí)AML外泌體的TGF-β1可能通過(guò)與NK-92細(xì)胞上的TGF-β1受體結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)其細(xì)胞毒性；其研究還表明，外泌體所攜帶白血病相關(guān)抗原和介導(dǎo)免疫抑制的蛋白質(zhì)，能抑制用于過(guò)繼免疫治療的NK-92細(xì)胞的細(xì)胞毒性、分化、增殖和向白血病細(xì)胞定向遷移，多方面影響NK細(xì)胞的功能。關(guān)于腫瘤中外泌體的許多研究表明，它們具有抑制NK細(xì)胞免疫活性的作用，也有研究表明它們能改變T細(xì)胞活性。Shen等[19]體外研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)HSP70陽(yáng)性外泌體處理的樹(shù)突細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞比未經(jīng)過(guò)該外泌體處理者對(duì)白血病NB4細(xì)胞的殺傷作用更強(qiáng)。未來(lái)，白血病細(xì)胞源性外泌體可能作為一種體內(nèi)免疫激活劑，在白血病的免疫治療中發(fā)揮重要作用[20]。此外有研究表明，TGF-β1在AML的EVs上表達(dá)增多，可能有助于促進(jìn)T細(xì)胞功能，因?yàn)門(mén)GF-β1在促進(jìn)T細(xì)胞的分化和增殖中發(fā)揮作用[21]。AML的EVs能促進(jìn)骨髓源性抑制細(xì)胞(MDSCs)的增殖，MDSCs是一組具有較強(qiáng)免疫抑制活性的未成熟骨髓細(xì)胞。MDSCs能通過(guò)精氨酸酶1和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá)以及活性氧的產(chǎn)生下調(diào)T細(xì)胞受體，直接抑制效應(yīng)CD8+T細(xì)胞功能[22]。因此，EVs具有多種免疫調(diào)節(jié)機(jī)制影響AML病情進(jìn)展。

1.6 減少AML細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡是影響AML細(xì)胞存活的重要機(jī)制之一，細(xì)胞凋亡失調(diào)可能導(dǎo)致化療耐藥并最終復(fù)發(fā)。研究表明，Bcl-2和Bcl-2/Bax是AML細(xì)胞抗凋亡的決定因素，并且與AML患者的存活相關(guān)?？赏ㄟ^(guò)流式檢測(cè)Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1和Bax這4個(gè)定量參數(shù)構(gòu)成抗凋亡指數(shù)(AAI)，反映細(xì)胞的凋亡活性。Wojtuszkiewicz等[23]研究表明，高AAI的AML細(xì)胞分泌含有細(xì)胞因子的EVs可能被低AAI的細(xì)胞吸收，進(jìn)而使低AAI的AML細(xì)胞AAI上調(diào)，抑制細(xì)胞凋亡，提示EVs介導(dǎo)的調(diào)控蛋白釋放可能是AML細(xì)胞抗凋亡的機(jī)制之一。此外有研究表明，AML源性的EVs能通過(guò)參與細(xì)胞間信號(hào)傳遞，參與骨髓基質(zhì)中MSC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)來(lái)抑制細(xì)胞凋亡[24]。

2 EVs在AML診治中的作用

2.1 EVs與AML診斷、治療及預(yù)后 目前，AML診斷、微小殘留(MRD)及預(yù)后監(jiān)測(cè)，主通過(guò)骨髓穿刺術(shù)取骨髓組織來(lái)完成，侵入性大，且部分檢查結(jié)果尚缺乏統(tǒng)一判定標(biāo)準(zhǔn)。EVs攜帶有親代細(xì)胞特異性的蛋白、脂質(zhì)、miRNA、mRNA或DNA等物質(zhì)，其雙層膜結(jié)構(gòu)可使其負(fù)載的親代細(xì)胞等物質(zhì)能夠在體液中相對(duì)穩(wěn)定存在。因此，通過(guò)EVs及其攜帶物的檢測(cè)，可能反映AML的疾病動(dòng)態(tài)，使之有可能成為AML診斷、MRD及預(yù)后監(jiān)測(cè)的潛在標(biāo)志物；且相較于以往的檢查手段，該方法可能更敏感、創(chuàng)傷更小，但也存在如檢測(cè)方法不夠準(zhǔn)確等問(wèn)題待解決。Kunz等[25]通過(guò)檢測(cè)AML患者及AML細(xì)胞EVs來(lái)源的RNA，發(fā)現(xiàn)其數(shù)量變化與NPM1和FLT3-ITD突變相關(guān)，而NPM1和FLT3-ITD突變明確與AML發(fā)病及預(yù)后相關(guān)，可影響患者治療方案選擇，故AML細(xì)胞EVs來(lái)源RNA可能在AML診斷、治療及預(yù)后評(píng)估中發(fā)揮作用。Hornick等[26]通過(guò)檢測(cè)AML細(xì)胞與AML環(huán)境下基質(zhì)細(xì)胞外泌體攜帶的特異miRNA，發(fā)現(xiàn)外泌體負(fù)載的miR155和其他miRNA與AML細(xì)胞數(shù)相關(guān)，這些miRNA可用于檢測(cè)AML小鼠模型中的MRD；與傳統(tǒng)細(xì)胞免疫分型監(jiān)測(cè)MRD相比，外周血中的外泌體所含特異miRNA作為檢測(cè)MRD的標(biāo)志物具有更高靈敏度。隨著研究結(jié)果的不斷更新，白血病EVs作為AML疾病潛在標(biāo)志物在不久的將來(lái)有望應(yīng)用于臨床，為發(fā)展AML新的診療技術(shù)作貢獻(xiàn)。

2.2 EVs與AML化療耐藥 AML一線治療的完全緩解率在年輕人中為60%～80%，在老年人中為40%～60%；但近60%的老年患者因復(fù)發(fā)導(dǎo)致誘導(dǎo)化療失敗，其中>85%的患者治療失敗，而耐藥是治療失敗的關(guān)鍵因素。AML細(xì)胞本身釋放的EVs，能通過(guò)誘導(dǎo)凋亡抵抗引起化療耐藥[23]；Viola等[27]研究表明，AML骨髓基質(zhì)細(xì)胞EVs含量的變化與酪氨酸激酶抑制劑耐藥性的增加相一致，而進(jìn)一步研究表明骨髓基質(zhì)細(xì)胞能夠通過(guò)EVs分泌FGF2來(lái)調(diào)節(jié)AML細(xì)胞對(duì)酪氨酸激酶抑制劑的化療抵抗[28]；而且，AML源性外泌體的VEGF/VEGFR能夠誘導(dǎo)HUVECs糖酵解，導(dǎo)致血管重構(gòu)和獲得化療耐藥性[7]。此外，Bouvy等[29]研究表明，耐藥的AML細(xì)胞能夠通過(guò)EVs核酸和攜帶的多藥耐藥蛋白1轉(zhuǎn)移其耐藥性。

綜上所述，EVs是現(xiàn)代研究中新興領(lǐng)域之一，其參與機(jī)體細(xì)胞間信息傳遞，與疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。大量研究數(shù)據(jù)表明，白血病細(xì)胞來(lái)源的EVs在AML凝血異常、疾病進(jìn)展、疾病潛在標(biāo)志物及化療耐藥等方面均發(fā)揮重要作用。未來(lái)的研究必定會(huì)加深我們對(duì)AML中EVs與疾病相互作用的理解，可能發(fā)現(xiàn)白血病潛的新靶點(diǎn)，從而為AML的診斷、治療、預(yù)后評(píng)估及疾病監(jiān)測(cè)開(kāi)辟新的方法。