水稻PDL2的突變導(dǎo)致小穗外稃退化

趙梓鈞，吳如會，王碩，張君，游靜，段倩楠，唐俊，張新芳，韋秘，劉金艷，李云峰，何光華，張婷

水稻的突變導(dǎo)致小穗外稃退化

趙梓鈞，吳如會，王碩，張君，游靜，段倩楠，唐俊，張新芳，韋秘，劉金艷，李云峰，何光華，張婷

西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院/南方山地農(nóng)業(yè)教育部工程中心，重慶 400715

【】小穗是禾本科植物特有的花器官。在水稻中，小穗作為花序的基本單位和獨有結(jié)構(gòu)，對水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要影響。因此，研究水稻小穗和花器官的發(fā)育，為水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的形成提供依據(jù)。【】使用甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate，EMS）誘變秈稻保持系西農(nóng)1B，獲得2個具有相似突變表型的水稻等位突變體和（和）。由于二者表型相似，選?。麨椋椴牧?，通過顯微觀察和石蠟切片技術(shù)分析其小穗突變表型；通過農(nóng)藝性狀考察分析小穗外稃突變對水稻產(chǎn)量的影響；通過圖位克隆技術(shù)驗證的功能；運用原位雜交技術(shù)及實時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)分析的表達(dá)模式?！尽勘硇头治鼋Y(jié)果表明，與野生型相比，突變體外稃明顯變窄，不能與內(nèi)稃緊密鉤合，導(dǎo)致小穗開裂，內(nèi)輪花器官部分裸露在外，但其雄蕊、雌蕊和漿片的形態(tài)和數(shù)量均表現(xiàn)正常。進(jìn)一步的石蠟切片結(jié)果表明，突變體外稃硅化細(xì)胞和泡狀細(xì)胞體積、數(shù)量的降低，以及維管束間距的減小，是導(dǎo)致外稃的寬度明顯變窄的原因。農(nóng)藝性狀考察表明，外稃的變化最終引起籽粒呈水滴狀，并使得突變體的結(jié)實率和千粒重等產(chǎn)量性狀明顯下降。遺傳分析和圖位克隆結(jié)果表明，是一個單隱性核基因，是位于水稻第4染色體的。該基因編碼一個Dicer-like蛋白，在水稻ta-siRNA的合成途徑中發(fā)揮重要作用，并且突變體是的一個新的弱等位突變。利用原位雜交技術(shù)及RT-qPCR技術(shù)進(jìn)行的表達(dá)模式分析和基因功能分析結(jié)果表明，在水稻各輪花器官中組成型表達(dá)，該基因的突變不會影響水稻花器官特征的形成，但會干擾水稻ta-siRNA合成，影響水稻近-遠(yuǎn)軸極性建立相關(guān)基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致突變體外稃近-遠(yuǎn)軸極性建立紊亂。【】水稻外稃退化基因的突變使得外稃近-遠(yuǎn)軸極性建立紊亂，影響小穗外稃的發(fā)育和產(chǎn)量性狀的形成。

水稻（L.）；小穗；外稃；圖位克?。还δ芊治?/p>

0 引言

【研究意義】水稻（L.）是世界上最重要的糧食作物之一，其小穗的發(fā)育對水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)至關(guān)重要[1]。在水稻中，小穗包含1個由四輪花器組成的可育頂生小花（1個外稃和1個內(nèi)稃，2個漿片，6枚雄蕊和1枚雌蕊），1對護(hù)穎和1對副護(hù)穎[2-3]。其中，外稃和內(nèi)稃構(gòu)成水稻的穎殼，是禾本科植物獨特的外輪花器官。穎殼的大小是種子大小的決定因素之一，其發(fā)育對水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的形成具有重要意義[4-5]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】花器官特征基因的表達(dá)調(diào)控花器官的生長和發(fā)育，進(jìn)而影響小花的形成。以往研究發(fā)現(xiàn)，在水稻花器官的發(fā)育過程中，有ABCDE五類基因參與，其功能與雙子葉植物相似。其中，A類和E類基因與外稃和內(nèi)稃的發(fā)育有關(guān)[6]。到目前為止，已經(jīng)克隆了3個A類基因。和被證明是內(nèi)稃特性所必需的，二者的雙突變體表現(xiàn)為小穗缺失[7]。在所有組織中廣泛表達(dá)，在水稻中過量表達(dá)會導(dǎo)致提前開花[8]。水稻中有至少5個E類基因，其中突變體具有葉狀的外稃和內(nèi)稃，漿片伸長，呈稃片狀[9]。與之相似，突變也會使小穗轉(zhuǎn)化為葉狀結(jié)構(gòu)[10]。和功能冗余，二者的雙突變體漿片、雄蕊和心皮轉(zhuǎn)化為稃片狀器官[11]。突變體分枝和小穗的排列混亂，護(hù)穎和副護(hù)穎伸長，表明其對小穗發(fā)育具有重要調(diào)控作用[12]。此外，ta-siRNA的合成途徑也調(diào)控穎殼的發(fā)育。在擬南芥中，ta-siRNA的產(chǎn)生是由特定的miRNA- AGO復(fù)合物對TAS轉(zhuǎn)錄本上miRNA靶位點的切割引起的。斷裂的單鏈在RDR6和SGS3蛋白的作用下合成雙鏈RNA，再在DCL4蛋白的切割下生成21 nt的ta-siRNA[13-14]。在水稻的ta-siRNA合成途徑中，發(fā)揮了重要作用。該基因編碼一個Dicer-like酶，可以對雙鏈RNA進(jìn)行切割，是ta-siRNA產(chǎn)生的直接作用蛋白[15]。突變將導(dǎo)致ta-siRNA途徑受阻，進(jìn)而影響miR166、等近-遠(yuǎn)軸極性發(fā)育相關(guān)調(diào)控因子的積累，最終導(dǎo)致水稻器官極性發(fā)育缺陷。例如，水稻編碼擬南芥DCL4的同源蛋白，外稃的發(fā)育因近軸面發(fā)育缺陷而受到阻礙，從而變成棒狀[16-17]。此外，水稻ta-siRNA合成途徑中其他基因的突變也會造成水稻外稃發(fā)育異常。在水稻中編碼擬南芥RDR6的同源蛋白，介導(dǎo)雙鏈RNA的產(chǎn)生。在突變體中，由于雄蕊和外稃的近-遠(yuǎn)軸極性發(fā)育的缺陷，外稃退化為芒狀或桿狀甚至消失[18-19]。編碼擬南芥AGO7的同源蛋白，它能特異性地與miRNA結(jié)合并參與ta-siRNA的合成。發(fā)芽后葉片異常，莖頂端分生組織變扁平，外稃呈芒狀，內(nèi)稃退化[20]。由此可見，水稻ta-siRNA合成途徑可以通過調(diào)控穎殼和葉片的極性來影響其形態(tài)發(fā)育?！颈狙芯壳腥朦c】盡管已有較多水稻小穗發(fā)育相關(guān)基因已被克隆，但這些基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及與水稻產(chǎn)量的關(guān)系仍需進(jìn)一步完善。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究利用EMS誘變水稻秈稻保持系西農(nóng)1B，得到2個水稻外稃退化等位突變體和，二者外稃明顯變窄，不能與內(nèi)稃緊密鉤合，導(dǎo)致小穗開裂，內(nèi)輪花器官部分裸露在外。由于二者表型相似，選取（命名為）進(jìn)行深入研究，并通過表型分析、農(nóng)藝性狀考察、圖位克隆、表達(dá)模式分析等方法對進(jìn)行克隆和功能分析，探究在調(diào)控水稻外稃發(fā)育和產(chǎn)量形成中的作用，為水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的形成提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2018年7月至2022年6月在西南大學(xué)水稻研究所開展。水稻小穗突變體是利用化學(xué)誘變劑甲基磺酸乙酯（EMS）誘變水稻秈稻保持系西農(nóng)1B獲得，其經(jīng)過多代自交至性狀能夠穩(wěn)定遺傳。所用試驗材料均來自于西南大學(xué)水稻研究所和海南試驗田。

1.2 形態(tài)學(xué)與組織學(xué)分析

取開花期野生型和突變體幼穗。在體視顯微鏡下進(jìn)行解剖，觀察小穗、花器官的形態(tài)。用掃描電子顯微鏡（Hitachi SU3500）在-40℃冷凍條件下觀察小穗及花器官形態(tài)。

石蠟切片被用于組織學(xué)分析。分別取不同時期的野生型和突變體小穗并快速放進(jìn)FAA固定液中，抽真空后置于4℃保存24 h。經(jīng)乙醇逐級脫水及二甲苯進(jìn)行透明處理后，再進(jìn)行浸蠟和包埋。將樣品切成8 μm的切片，用番紅-固綠對染法進(jìn)行染色后封片。42℃烘箱烘片2 d，利用光學(xué)顯微鏡（Nikon E600）進(jìn)行觀察并拍照。

1.3 圖位克隆

1.3.1 遺傳分析 在試驗田配制突變體與秈稻56S的雜交組合，統(tǒng)計F1和F2性狀，利用χ2檢驗分析正常表型和突變表型的分離比。

1.3.2 連鎖分析 在開花期，從×56S的F2分離群體中隨機挑選10株正常表型單株與10株突變表型單株構(gòu)建正常池和突變池，用CTAB法提取2個基因池和親本DNA。利用研究所長期保存的均勻分布在水稻12條染色體的SSR及InDel引物、Vector NTI Advance 11.5軟件和Gramene數(shù)據(jù)庫（http://www. gramene.org/microsat）篩選親本間的多態(tài)性。

1.3.3 基因定位和連鎖圖譜構(gòu)建 從試驗田中挑選出F2中的突變表型單株，每個單株取幼嫩葉，采用堿煮法快速提取DNA。用1.3.2中已經(jīng)篩選出的連鎖引物對定位群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增。隨后利用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，進(jìn)行目的基因的初步定位。在已確定的初步定位區(qū)間內(nèi)進(jìn)一步開發(fā)InDel標(biāo)記，從而精細(xì)定位目的基因。

1.4 轉(zhuǎn)基因互補驗證

構(gòu)建并轉(zhuǎn)化候選基因互補載體，將經(jīng)過GUS染色鑒定的陽性植株種植于歇馬西南大學(xué)水稻研究所基地，在成熟期分析轉(zhuǎn)基因植株的表型。從gramene數(shù)據(jù)庫下載候選基因序列。使用Vector NYI Advance 10設(shè)計正向引物PDL2com-F和反向引物PDL2com-R，以野生型DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠提取試劑盒（天根生化技術(shù)公司）進(jìn)行純化。用互補載體pCAMBIA1301原菌液進(jìn)行搖動復(fù)制，提取質(zhì)粒，用Ⅰ和Ⅰ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，用重組酶進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，選擇陽性菌株送至重慶清科公司進(jìn)行測序。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)入2突變體。轉(zhuǎn)化和分化過程由武漢博源公司完成。引物序列見電子附表1。

1.5 RT-qPCR分析

利用RNAprep Pure Plant Kit（天根生化技術(shù)公司）提取總RNA。用帶有g(shù)DNA Eraser（TaKaRa）的PrimeScript試劑盒將純化后的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以此為模板，加入引物混合物、SYBR Green熒光染料和無RNase水，每個組合設(shè)置3個重復(fù)，以為內(nèi)參基因，使用Bio-Rad熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。RT-qPCR分析所用引物序列見電子附表1。

1.6 原位雜交

設(shè)計引物，制備探針模板，使用羅氏DIG RNA Labelling Kit，體外合成帶地高辛標(biāo)記的RNA探針（引物序列見電子附表1）。切片的預(yù)處理、雜交和免疫學(xué)檢測均按照Sang等[21]方法進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 開花期pdl2突變體的表型分析

與野生型相比，突變體的外稃退化，整體變窄，輕微彎折，無法與內(nèi)稃鉤連，形成開裂狀小花，使得部分內(nèi)輪花器官裸露在外（圖1-A、圖1-B、圖1-J和圖1-K）。剝?nèi)シf殼后，可以觀察到花器官內(nèi)部的雄蕊、雌蕊和漿片的形態(tài)和數(shù)量均表現(xiàn)正常（圖1-C和圖1-L）。掃描電鏡結(jié)果顯示，突變體內(nèi)外稃表層細(xì)胞及毛狀結(jié)構(gòu)與野生型無異（圖1-D—F和圖1-M—O）。石蠟切片分析結(jié)果顯示，雖然突變體小花的外稃與野生型一樣都具有4層細(xì)胞，但突變體外稃的硅化細(xì)胞數(shù)量減少，泡狀細(xì)胞的體積、數(shù)量均顯著降低，維管束間距減小，從而導(dǎo)致外稃的寬度明顯變窄，使之不能與內(nèi)稃緊緊鉤連，最終造成穎殼開裂，內(nèi)輪花器官暴露在外（圖1-G—I和圖1-P—R）。綜上所述，突變體的外稃退化，表明對水稻外稃發(fā)育具有重要影響。

A—C：野生型小穗（A）、剝?nèi)?nèi)稃（B）、剝?nèi)ネ怙蛢?nèi)稃（C）體視鏡照片；D—F：野生型小穗（D）、外稃（E）、內(nèi)稃（F）掃描電鏡照片；G—I：野生型小穗橫切面（G）及外稃（H）、內(nèi)稃（I）局部放大；J—L：pdl2小穗（J）、剝?nèi)?nèi)稃（K）、剝?nèi)ネ怙蛢?nèi)稃（L）體視鏡照片；M—O：pdl2小穗（M）、外稃（N）、內(nèi)稃（O）掃描電鏡照片；P—R：pdl2小穗橫切面（P）及外稃（Q）、內(nèi)稃（R）局部放大。紅色方框表示放大范圍；紅色星號表示維管束。le：外稃；pa：內(nèi)稃；rg：副護(hù)穎；sl：護(hù)穎；st：雄蕊；pi：雌蕊；lo：漿片；mrp：內(nèi)稃邊緣；bop：內(nèi)稃主體。下同。A—D、J—M的標(biāo)尺=2 mm；E—F、N—O的標(biāo)尺=400 μm；G—I、P—R的標(biāo)尺=200 μm

2.2 pdl2突變體植株的農(nóng)藝性狀分析

在成熟期，與野生型相比，株型整體緊湊，葉片直立（圖2-A）；穗型較直立，且絕大部分一次分支靠近基部約1/3的長度無小穗著生（圖2-A—B）；成熟籽粒的穎殼開裂，糙米上窄下寬，呈水滴狀（圖2-C—D）。對野生型及突變體進(jìn)行考種統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)相較于野生型，株高減少了0.03 cm，穗長增加了0.09 cm，均無顯著差異（圖2-E—F）；一次分枝數(shù)量減少了10.7%，達(dá)到顯著水平，二次分枝數(shù)量減少了12.5%，結(jié)實率降低了53.9%，均達(dá)到極顯著水平（圖2-G—I）。籽粒長度與野生型相差不大甚至略微增加，但其糙米粒長比野生型縮小了21.6%（圖2-J—K）；籽粒寬度增加了19.0%，糙米粒寬減少了22.2%（圖2-L—M）。剝殼前千粒重和糙米千粒重分別減少了72.8%和78.3%（圖2-N—O），均達(dá)到極顯著水平。因此，在水稻小穗發(fā)育中起著重要作用，進(jìn)而直接影響籽粒形成，改變水稻產(chǎn)量。

2.3 小穗發(fā)育早期的形態(tài)學(xué)觀察

利用掃描電子顯微鏡對野生型和突變體小穗的發(fā)育早期進(jìn)行觀察。Sp4時期，野生型小穗的外稃和內(nèi)稃原基先后開始發(fā)育，突變體也發(fā)育正常（圖3-A和圖3-E）。Sp5—Sp6時期，野生型小穗的外稃和內(nèi)稃鉤連在一起，此時期同時形成5個球形雄蕊原基；而突變體小穗的花器官發(fā)育正常，但外稃明顯變窄（圖3-B和圖3-F）。Sp7時期，野生型小穗的外稃進(jìn)一步發(fā)育，雌蕊原基開始發(fā)育，而突變體小穗的外稃相較于野生型和上一時期則變得更窄（圖3-C和圖3-G）。Sp8時期，野生型小穗的內(nèi)外稃徹底鉤合在一起，將內(nèi)輪花器官緊緊包裹在內(nèi)，而突變體小穗外稃明顯變窄，內(nèi)外稃無法緊密鉤連，不能包裹內(nèi)輪花器官（圖3-D和圖3-H）。整個發(fā)育階段內(nèi)，突變體小穗的內(nèi)輪花器官均發(fā)育正常。綜上，突變體外稃的退化缺陷在小穗發(fā)育早期就已顯現(xiàn)出來。

A—D：野生型和pdl2株型（A）、穗型（B）、籽粒（C）、糙米（D）；E—O：野生型和pdl2相關(guān)農(nóng)藝性狀統(tǒng)計。P值通過學(xué)生氏t檢驗確定。*：P≤0.05；**：P≤0.01；ns：無顯著性差異。下同

2.4 PDL2的圖位克隆

用56S與突變體進(jìn)行雜交，F(xiàn)1表現(xiàn)正常，F(xiàn)2群體出現(xiàn)突變表型分離。在2 011株F2植株中，共有正常表型1 493株，突變表型518株，經(jīng)卡方檢驗，分離比符合3﹕1（χ2=0.58＜χ20.05, 1=3.84），表明突變體的表型由一個單隱性核基因控制。以F2群體中的518個隱性單株作為定位群體，利用SSR標(biāo)記進(jìn)行基因初步定位，發(fā)現(xiàn)候選基因與第4染色體的SSR標(biāo)記RM3524和RM5320連鎖（圖4-A）。進(jìn)一步開發(fā)InDel引物（引物序列見電子附表2）對進(jìn)行精細(xì)定位，最終將定位在第4染色體ln1-25.30和ln1-25.56之間約186 kb的區(qū)間內(nèi)（圖4-B—C）。根據(jù)Gramene網(wǎng)站提供的基因注釋信息，在該區(qū)間內(nèi)共有30個注釋基因（圖4-D）。通過對這30個基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中包含（），而已有研究表明，該基因編碼Dicer like蛋白，參與水稻ta-siRNA的合成，進(jìn)而調(diào)控水稻穎殼極性發(fā)育。因此，通過對序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)突變體在第14個外顯子上發(fā)生單堿基替換，使得亮氨酸突變?yōu)楦彼幔煌蛔凅w第16與第17個外顯子之間的內(nèi)含子的邊緣區(qū)域發(fā)生了單堿基替換（圖4-E—F）。進(jìn)一步構(gòu)建包含全長序列的互補載體，并轉(zhuǎn)入突變體。結(jié)果表明，陽性轉(zhuǎn)基因植株小穗恢復(fù)正常，與野生型相似（圖4-G）。綜上，是的一個新的等位基因。

2.5 PDL2的表達(dá)模式分析

通過RT-qPCR分析，在根、莖、葉、鞘、穗等多種組織中均組成型表達(dá)，且在小穗中表達(dá)量最高（圖5-A）。進(jìn)一步分析在小穗各輪花器官中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其在外稃、內(nèi)稃、雌蕊、雄蕊和漿片中均表達(dá)（圖5-B）。為了更詳細(xì)地分析的表達(dá)模式，進(jìn)行原位雜交試驗，發(fā)現(xiàn)其在水稻小穗分生組織中存在強烈信號（圖5-C—F）。Sp4時期，內(nèi)稃開始發(fā)育，在護(hù)穎、外稃、內(nèi)稃中高度表達(dá)（圖5-C）。在Sp5時期，在護(hù)穎、副護(hù)穎、內(nèi)外稃及分生組織中均有所表達(dá)。Sp5時期后，漿片、雄蕊、雌蕊依次開始形成，在這些部位均檢測到強烈的信號（圖5-D—F）。結(jié)果表明，在各輪器官中組成型表達(dá)。

2.6 花器官發(fā)育特征基因的表達(dá)分析

為了研究突變體的花器官特性，采用RT- qPCR檢測花器官發(fā)育特征基因在野生型和突變體中的表達(dá)情況。是一種外稃特征基因，主要在野生型和突變體的外稃和內(nèi)稃中表達(dá)（圖6-A）。和是外稃和內(nèi)稃特征基因，在野生型和突變體的外稃、內(nèi)稃中均能檢測到這兩個基因的信號（圖6-B—C）。以上結(jié)果表明，突變體外稃的形態(tài)和大小雖發(fā)生改變，但特征仍然存在。是內(nèi)稃邊緣區(qū)特征基因，其在野生型和突變體的內(nèi)稃中均有表達(dá)，表明突變體的內(nèi)稃特征正常（圖6-D）。和在雄蕊、雌蕊及漿片的發(fā)育中發(fā)揮重要作用，這兩個特征基因在野生型和突變體的雌蕊中均有顯著表達(dá)，表明突變體的雄蕊和雌蕊發(fā)育正常（圖6-E—F）。因此，的突變對花器官的特征發(fā)育無明顯影響。

A—E：PDL2的圖位克??；F：突變位點預(yù)測；G：PDL2互補驗證。標(biāo)尺=500 μm

2.7 近-遠(yuǎn)軸極性建立特征基因的表達(dá)分析

圖位克隆結(jié)果顯示，是的一個新的等位基因。前人研究表明，是ta-siRNA合成途徑的重要基因，而ta-siRNA能對ARF（）基因進(jìn)行負(fù)向調(diào)控，從而影響植物器官近-遠(yuǎn)軸極性建立。因此，對一些決定近-遠(yuǎn)軸極性建立的基因在野生型和突變體外稃中的表達(dá)量進(jìn)行了qPCR分析。ARF基因決定遠(yuǎn)軸面特征，對該類基因的檢測結(jié)果顯示，///在突變體中的表達(dá)量均上調(diào)，其中，和上調(diào)明顯，達(dá)到極顯著水平（圖7-A—D）。這表明突變后，可能阻礙了ta-siRNA合成途徑，從而減少了對ARF基因的抑制，進(jìn)而增強了遠(yuǎn)軸面特性。KANADI家族基因是遠(yuǎn)軸面發(fā)育所必需的，qPCR結(jié)果顯示，在突變體中，-表達(dá)量上調(diào)，均達(dá)到極顯著水平（圖7-E—I）。因此，突變后可能導(dǎo)致突變體外稃近-遠(yuǎn)軸極性建立紊亂，從而引起外稃形態(tài)發(fā)育缺陷。

A—B：PDL2的相關(guān)表達(dá)水平；C—F：PDL2在野生型小穗中的原位雜交。標(biāo)尺=50 μm

A：外稃特征基因DL的相對表達(dá)水平；B—C：外稃和內(nèi)稃特征基因OsMADS1（B）和OsMADS15（C）的相對表達(dá)水平；D：內(nèi)稃邊緣區(qū)特征基因OsMADS6的相對表達(dá)水平；E—F：雄蕊和漿片特征基因OsMADS3（E）和OsMADS4（F）的相對表達(dá)水平

A—D：ARF家族基因的相對表達(dá)水平；E—I：KANADI家族基因的相對表達(dá)水平

3 討論

3.1 pdl2穎殼發(fā)育缺陷影響籽粒產(chǎn)量

由外稃和內(nèi)稃共同組成的穎殼是禾本科植物所特有的外輪花器官，其形狀和大小決定籽粒的形狀和大小，直接影響了水稻產(chǎn)量。當(dāng)穎殼發(fā)育缺陷時，內(nèi)外稃無法緊密鉤合在一起，產(chǎn)生的籽粒大多比正常籽粒要小，種子生活力和發(fā)芽率也都降低。到目前為止，已經(jīng)克隆了一些穎殼發(fā)育缺陷的突變體，如編碼類EMF1蛋白，突變體的小穗表現(xiàn)為內(nèi)稃萎縮和糙米畸形[22]。編碼單C2H2鋅指蛋白，突變體產(chǎn)生不同數(shù)量的、具有不同性狀的心皮或心皮樣組織，外稃和內(nèi)稃的橫向生長均受到限制，穎殼開裂而不封閉[23]。編碼一個核定位的AT鉤DNA結(jié)合蛋白，突變體內(nèi)稃的主要結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致內(nèi)稃退化為葉狀器官[24]。編碼一個DUF640蛋白，突變體的外稃彎曲，穎殼變長，不能完全關(guān)閉[25]。而本研究所討論的突變體外稃硅化細(xì)胞體積減小，泡狀細(xì)胞的體積、數(shù)量均有所降低，從而導(dǎo)致外稃明顯變窄，使之不能緊緊鉤連住內(nèi)稃，最終造成穎殼開裂，內(nèi)輪花器官暴露在外。這一突變也對籽粒產(chǎn)量產(chǎn)生了極大影響，導(dǎo)致糙米畸形，呈彎曲狀，粒長、粒寬及千粒重均極顯著降低。

3.2 pdl2是OsDCL4一個新的弱等位突變

本研究圖位克隆結(jié)果表明，定位于編碼Dicer like（DCL）蛋白的，該基因包含1個Helicase結(jié)構(gòu)域、1個DUF283結(jié)構(gòu)域、1個PAZ結(jié)構(gòu)域、2個RNaseⅢ結(jié)構(gòu)域和1-2個dsRBD結(jié)構(gòu)域，分別參與雙鏈RNA的解旋、siRNA/miRNA鏈的選擇、RNA鏈的識別和結(jié)合、RNA鏈的切割和與其他蛋白的結(jié)合[26-27]。目前，已鑒定出數(shù)個關(guān)于該基因的等位突變體。NAGASAKI等[28]鑒定出8個水稻突變體，其中，3個突變位點位于編碼Helicase結(jié)構(gòu)域的序列中，1個突變位點位于編碼PAZ結(jié)構(gòu)域的序列中，1個突變位點位于編碼RNaseⅢ結(jié)構(gòu)域的序列中，1個突變位點位于編碼dsRBD結(jié)構(gòu)域的序列中，剩余2個突變位點位于非編碼序列中。這些突變體莖頂端分生組織不完整，發(fā)芽后葉片異常。2008年，Liu等[16]鑒定了一個突變體，該突變體在的啟動子區(qū)，5’非編碼區(qū)和第一個外顯子的前72 bp存在1 428 bp的缺失，導(dǎo)致其植株矮小，幼年期葉片發(fā)育異常，小穗外稃退化為棒狀，并且產(chǎn)生遠(yuǎn)軸化特征。而本研究鑒定了2個全新的等位突變體和，其突變位點分別位于第14個外顯子上以及第16與第17個外顯子之間的內(nèi)含子的邊緣區(qū)域，其中，前者的突變位點位于編碼DUF283結(jié)構(gòu)域的序列中，后者的突變位點雖然不在外顯子區(qū)域，但其位于內(nèi)含子區(qū)域的邊界處，可能影響mRNA的轉(zhuǎn)錄后修飾過程，從而產(chǎn)生突變表型。此外，與之前報道的突變體不同，表型分析結(jié)果顯示，為一個全新的弱等位突變，該突變體外稃部分退化，整體變窄，但并未完全退化為棒狀，仍在一定程度上保留了外稃的形態(tài)特征。因此，該突變體仍然是可育的，可以產(chǎn)生種子。

3.3 pdl2突變體中ta-siRNA合成途徑缺陷，導(dǎo)致外稃近-遠(yuǎn)軸極性建立紊亂

編碼的Dicer-like蛋白是植物ta-siRNA途徑中必不可少的一類酶。已有研究表明，水稻ta-siRNA合成途徑相關(guān)基因的突變會引起內(nèi)稃和外稃發(fā)育異常。-突變體外稃退化，轉(zhuǎn)變?yōu)榘魻頪16]；突變體外稃轉(zhuǎn)變?yōu)獒槧罱Y(jié)構(gòu)，芒顯著伸長，該突變體在中存在突變，而這一基因編碼水稻RdRP蛋白[18]；-突變體對溫度敏感，其外稃在外界氣溫高于32℃后退化為芒狀，且隨著溫度升高表型會越發(fā)嚴(yán)重。在上述突變體中，的表達(dá)量均有不同程度上升或在近軸面異位表達(dá)，外稃均呈現(xiàn)出遠(yuǎn)軸化特性，表明在水稻中ta-siRNA合成途徑相關(guān)基因突變會導(dǎo)致其對的抑制效果減弱，進(jìn)而產(chǎn)生遠(yuǎn)軸化特征。本研究所討論的突變體中不同表達(dá)量也都上調(diào)，表明突變體外稃呈現(xiàn)出遠(yuǎn)軸化特性。前人研究表明，ta-siRNA途徑缺陷影響miRNA166的積累，進(jìn)而影響HD-ZIPⅢ家族基因的表達(dá)[29]。而在擬南芥中，HD-ZIPⅢ家族KANADI基因家族存在拮抗作用[30]，但二者關(guān)系在水稻中似乎未被討論。最近的一項研究表明，OsKANADI1可以促進(jìn)的表達(dá)，其與tasiR-ARFs（靶基因為和的ta-siRNA）共同作用，確保表達(dá)恰當(dāng)[31]。而在本研究中，表達(dá)上調(diào)，且（即）在所有中上調(diào)表達(dá)最為顯著，也為這一結(jié)論提供了新的證據(jù)。

4 結(jié)論

水稻突變體外稃退化，硅化細(xì)胞數(shù)量減少，泡狀細(xì)胞的體積、數(shù)量降低，導(dǎo)致其整體變窄，輕微彎曲，兩側(cè)鉤狀結(jié)構(gòu)發(fā)生退化，無法與內(nèi)稃緊密鉤合，形成開裂狀小花，使得部分內(nèi)輪花器官裸露在外。突變體籽粒畸形，糙米千粒重極顯著降低。是的一個新的等位基因。突變體花器官特征仍然存在，而對近-遠(yuǎn)軸極性建立特征基因的表達(dá)水平分析顯示突變影響外稃近-遠(yuǎn)軸極性建立。

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Mutation ofgene causes degeneration of lemma in the spikelet of rice

ZHAO ZiJun, WU RuHui, WANG Shuo, ZHANG Jun, YOU Jing, DUAN QianNan, TANG Jun, ZHANG XinFang, WEI Mi, LIU JinYan, LI YunFeng, HE GuangHua, ZHANG Ting

College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University/Engineering Research Center of South Upland Agriculture, Ministry of Education, Chongqing 400715

【】Spikelet is a unique floral organ of the grass family. In rice, the spikelet, as the basic unit and unique structure of inflorescence, has an important impact on the yield and quality. Therefore, studying the development of rice spikelets and floral organs can provide the foundation for the formation of rice yield and quality. 【】Two rice allelic mutants,and(and) with similar mutant phenotypes were obtained using Ethyl Methane Sulfonate (EMS) mutagenesis in therice maintenance line Xinong 1B. Because of their phenotypic similarity,(named) was selected as the material for further analysis. Microscopic observation and paraffin sectioning techniques were used to analyze their spikelet mutant phenotypes; agronomic trait examination was used to analyze the effect of lemma on rice yield; map-based cloning were used to verify the function of;hybridization and real-time fluorescence quantitative PCR (RT-qPCR) were used to analyze the expression pattern of. 【】The results of the phenotypic analysis showed that the lemma ofmutant was significantly narrower and could not be closely hooked to the palea compared with that of wild type, resulting in spikelet dehiscence and partially exposed inner whorl floral organs. However, the morphology and number of stamens, pistils, and lodicules were normal. Further paraffin section results showed that the reduced volume and number of silicified and vesicular cells in the mutant lemma, as well as the reduced spacing of vascular bundles, were responsible for the significant narrowing of the width of the lemma in. Agronomic traits examined showed that the mutation in thelemma eventually caused the seeds to be teardrop-shaped and resulted in a significant decrease in yield traits such as seed setting rate and 1000-grain weight in themutant. Genetic analysis and map-based cloning showed thatis a single recessive nuclear gene, which isgene localized on chromosome 4.encodes a Dicer-like protein that plays an essential role in the rice ta-siRNA synthesis pathway, and themutant is a novel weak allelic mutation ofgene. The expression pattern analysis showed that thegene was constitutively expressed in all whorls of floral organs. Mutation ofaffected the ta-siRNA synthesis and the expression of genes related to the establishment of adaxial-abaxial polarity, thus leading to the disorder of adaxial-abaxial polarity establishment in the lemma of. And the characteristics of floral organs were normal. 【】Mutation of lemma degeneration genedisrupts the establishment of lemma adaxial-abaxial polarity and affects the development of lemma and the formation of yield traits.

rice (L.); spikelet; lemma; map-based cloning; functional analysis

2022-09-24；

2022-11-02

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（31900612）、高校基本科研業(yè)務(wù)費項目（SWU-KT22041）、國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃（202210635082）

趙梓鈞，E-mail：iszhaozijun@163.com。吳如會，E-mail：996367938@qq.com。趙梓鈞和吳如會為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者張婷，E-mail：tingwz@163.com

（責(zé)任編輯 李莉）