高通量測(cè)序技術(shù)分析鮮食花生貯藏過(guò)程中真菌群落的的組成和變化

楊 慧，路風(fēng)銀，韓俊豪，謝永康，尚朝杰，李星儀

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心，河南 鄭州 450002）

花生又名落花生，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物、食用作物和油料作物，是人們獲得蛋白質(zhì)的重要來(lái)源[1]。鮮食花生目前尚未有明確的定義，在花生產(chǎn)區(qū)一般指在收獲后不經(jīng)晾曬直接食用或煮熟食用的花生[2]。鮮食花生的食用方式可以最大限度地保留其營(yíng)養(yǎng)成分，符合人們對(duì)健康、營(yíng)養(yǎng)的追求，是一種營(yíng)養(yǎng)、健康的綠色食品[3-4]，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。同時(shí)，鮮食花生生育期短，可提高土地復(fù)種指數(shù)、增加農(nóng)民收益[5-6]。因此，鮮食花生需求量和種植面積逐年增加，成為花生產(chǎn)業(yè)中重要的分支之一。

鮮食花生極不耐貯藏，銷售周期短，難以滿足周年市場(chǎng)需求，尋找切實(shí)可行的保鮮技術(shù)是實(shí)現(xiàn)鮮食花生周年供應(yīng)的關(guān)鍵[2]。然而在貯藏保鮮過(guò)程中，鮮食花生因水分含量高、營(yíng)養(yǎng)豐富，極易遭受各種真菌微生物的侵染，進(jìn)而引起發(fā)霉、變質(zhì)，嚴(yán)重影響其食用安全[7-8]。目前，關(guān)于鮮食花生的保鮮研究多集中在低溫保鮮[9-10]、氣調(diào)保鮮[11]、化學(xué)保鮮[12-13]等技術(shù)應(yīng)用方面，而鮮食花生在貯藏過(guò)程中真菌微生物群落的變化規(guī)律鮮有研究。付英[14]研究表明，危害花生貯藏的菌類主要是曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）和鐮孢菌屬（Fusarium）；JOFFE[15]研究發(fā)現(xiàn)，鮮花生莢果中可能存在109種真菌，主要種類為曲霉屬、青霉屬和鐮孢菌屬；王連平等[7]研究發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)新收獲的新昌小京生新鮮花生果的優(yōu)勢(shì)菌為酵母菌、青霉菌、毛霉菌、曲霉菌、鐮孢霉菌和交鏈孢霉菌，且?guī)Ь侩S貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)顯著增加。這些研究對(duì)鮮食花生真菌進(jìn)行了分析鑒定，但鑒定方法傳統(tǒng)、局限性大。

傳統(tǒng)的微生物群落多樣性研究主要通過(guò)生理生化試驗(yàn)及表型進(jìn)行鑒定，存在耗時(shí)長(zhǎng)、鑒定結(jié)果不精準(zhǔn)等問(wèn)題[16]。近幾年，高通量測(cè)序技術(shù)作為新一代測(cè)序技術(shù)，相比于傳統(tǒng)方法，具有操作簡(jiǎn)單、測(cè)定速度快、結(jié)果精準(zhǔn)、用樣量少、安全性和自動(dòng)化程度高、分析全面等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于糧油[17-18]、肉制品[19-22]、水產(chǎn)品[23-24]等儲(chǔ)藏過(guò)程中微生物多樣性分析?；诖耍捎酶咄繙y(cè)序方法分析冷藏、常溫2種貯藏環(huán)境下鮮食花生真菌微生物菌群變化，并分析微生物菌群的菌相構(gòu)成及貯藏過(guò)程中菌群數(shù)量變化特點(diǎn)，旨在為鮮食花生貯藏過(guò)程中靶向抑菌保鮮及延長(zhǎng)貨架期提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

生鮮花生購(gòu)于鄭州市金水區(qū)趙東方蔬菜攤，品種為?；?號(hào)。

E.Z.N.A?Mag-Bind Soil DNA Kit試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA 公司；Qubit 3.0 DNA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Life Technologies 公 司；2×Hieff?C116P1Blood Direct Multiplex PCR Master Mix、Hieff NGS ?DNA Selection Beads 購(gòu)自翌圣生物科技（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Pico-21 臺(tái)式離心機(jī)由美國(guó)Thermo Fisher 公司生產(chǎn)；GL-88B 渦旋混合器由海門市其林貝爾儀器制造有限公司生產(chǎn)；TND03-H-H 混勻型干式恒溫器由深圳拓能達(dá)科技有限公司生產(chǎn)；DYCZ-21電泳槽由北京市六一儀器廠生產(chǎn)；FR-1000 凝膠成像系統(tǒng)由上海復(fù)日科技有限公司生產(chǎn)；Q32866 Qubit 3.0熒光計(jì)由美國(guó)Thermo Fisher 公司生產(chǎn)；ETC 811 PCR 儀由北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司生產(chǎn)；移液器由德國(guó)Eppendorf 公司生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理 生鮮花生經(jīng)無(wú)菌水清洗、瀝干水分后，用厚0.08 mm、120 mm×170 mm 的聚乙烯薄膜袋分裝，每袋裝約150 g，密封后分別置于（4±1）℃、（25±1）℃環(huán)境中進(jìn)行貯藏，每隔4 d 測(cè)定一次指標(biāo)，共測(cè)30 d。編號(hào)設(shè)置：冷藏組（4±1）℃標(biāo)記為A，常溫組（25±1）℃標(biāo)記為B；0 d 標(biāo)記為AB1，5～30 d 分別標(biāo)記為2～7；樣品編號(hào)方式為貯藏溫度標(biāo)記+貯藏時(shí)間標(biāo)記，如A2表示冷藏5 d測(cè)定真菌序列的樣品。

1.3.2 高通量測(cè)序 （1）基因組DNA 提?。夯ㄉ酶邷販缇募舻都羲楹蠡靹?，稱取0.5 g樣品放入無(wú)菌的2 mL樣品管中，加入0.8 mL PBS溶液后渦旋振蕩10 min，混勻后于10 000 r/min 室溫離心3 min，棄置上層液體。然后按照E.Z.N.A?Mag-Bind Soil DNA Kit 試劑盒說(shuō)明書提取樣本的基因組DNA，之后用2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA完整性和Qubit 3.0試劑盒定量檢測(cè)DNA 樣本濃度。（2）PCR 擴(kuò)增及建庫(kù)：PCR 擴(kuò)增及高通量測(cè)序主要委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。擴(kuò)增引物為ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）。第一輪PCR 反應(yīng)體系（30 μL）：2×Hieff?PCR Master Mix 15 μL、Primer F 1 μL、Index-PCR Primer R 1 μL、模板10～20 ng、ddH2O 9～12 μL；反應(yīng)條件：94 ℃3 min→（94 ℃30 s→45℃20 s→65℃30 s）5 個(gè) 循 環(huán)→（94 ℃20 s→55 ℃20 s→72 ℃30 s）20 個(gè) 循 環(huán)→72 ℃5 min→10 ℃保存。第二輪PCR 反應(yīng)體系（30 μL）：2×Hieff?PCR Master Mix 15 μL、Primer F 1 μL、Index-PCR Primer R 1 μL、模 板10～20 ng、ddH2O 9～12 μL；反應(yīng)條件：95 ℃3 min→（94 ℃20 s→45 ℃20 s→72 ℃30 s）5 個(gè)循環(huán)→72 ℃5 min→10 ℃保存。

1.4 生物信息學(xué)分析及數(shù)據(jù)處理

將測(cè)序得到的PE reads 根據(jù)overlap 關(guān)系進(jìn)行拼接，區(qū)分樣本后對(duì)序列進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾，然后進(jìn)行操作分類單元（Operational taxonomic unit，OTU）聚類分析和物種分類學(xué)分析。基于OTU 聚類進(jìn)行物種多樣性分析，基于分類學(xué)進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)統(tǒng)計(jì)分析。用Microsoft Excel 2013 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和分析，用Origin 2021軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鮮食花生貯藏過(guò)程中真菌群落Alpha多樣性分析

為避免在高通量測(cè)序過(guò)程中由于引入錯(cuò)誤或不可靠堿基等不可控因素造成的測(cè)序錯(cuò)誤，減少對(duì)下游生物信息學(xué)分析造成的不良影響，需要對(duì)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化處理。通過(guò)初步質(zhì)控并去除接頭（Barcode）和引物（Primer）的序列，獲得1 048 909條真菌序列，去除嵌合體得到1 047 633條真菌有效序列，每個(gè)樣品的有效序列百分比均達(dá)99%以上，說(shuō)明本次測(cè)序所得的有效序列達(dá)到后續(xù)微生物多樣性分析的要求。稀釋性曲線可以反映不同測(cè)序深度下各樣品中物種的相對(duì)豐度，能在一定程度上衡量每個(gè)樣本的多樣性情況[25]。在貯藏過(guò)程中，鮮食花生發(fā)現(xiàn)真菌物種數(shù)的稀釋曲線如圖1所示，所有樣本稀釋曲線均隨橫坐標(biāo)測(cè)序數(shù)量的增大趨于平坦，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠，能夠充分反映樣品的微生物信息且滿足后續(xù)生物信息學(xué)分析要求。

圖1 鮮食花生貯藏過(guò)程中發(fā)現(xiàn)真菌物種數(shù)的稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of fungal species found in fresh peanut during storage

Alpha 多樣性分析是根據(jù)97%相似度水平下的OTU 信息，通過(guò)Chao 1 指數(shù)、Ace 指數(shù)、Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)等對(duì)樣品微生物物種豐富度和多樣性進(jìn)行評(píng)估[20]。其中Chao1 指數(shù)和Ace 指數(shù)用來(lái)反映樣品的菌群豐度，Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)用來(lái)反映樣品中微生物群落的多樣性[26]。在貯藏過(guò)程中，鮮食花生真菌群落Alpha 多樣性相關(guān)指標(biāo)如表1所示，所有樣品的測(cè)序覆蓋率均大于99%，表明測(cè)序可以反映實(shí)際情況，能夠滿足樣品中真菌多樣性分析的需要。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，冷藏組Chao 1 指數(shù)、Ace 指數(shù)、Shannon 指數(shù)整體呈下降趨勢(shì)，Simpson 指數(shù)整體呈上升趨勢(shì)，表明冷藏組真菌群落多樣性和豐富度隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)；常溫組Chao 1指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon 指數(shù)整體呈先升高后下降趨勢(shì)，表明常溫組真菌群落多樣性和豐富度隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降趨勢(shì)。冷 藏 組Chao 1 指 數(shù)、Ace 指 數(shù)、Simpson 指 數(shù) 和Shannon 指 數(shù) 均 值 分 別 為243.03、247.91、0.26 和1.94，常溫組Chao 1 指數(shù)、Ace 指數(shù)、Simpson 指數(shù)和Shannon 指 數(shù) 均 值 分 別 為273.51、266.37、0.17 和2.57，除Simpson 指數(shù)外，常溫組數(shù)值普遍高于冷藏組，表明常溫組真菌群落多樣性與豐富度高于冷藏組，這可能因?yàn)槌亟M溫度更適宜微生物生長(zhǎng)。

表1 鮮食花生貯藏過(guò)程中真菌微生物多樣性指數(shù)Tab.1 Fungal microbial diversity index of fresh peanut during storage

2.2 鮮食花生貯藏過(guò)程中真菌群落Beta多樣性分析

主 成 分 分 析（Principal component analysis，PCA）可以從原始數(shù)據(jù)中提取出樣本之間最重要的差異[27]。由圖2 可知，第1 主成分的貢獻(xiàn)率為62.76%，第2 主成分的貢獻(xiàn)率為34.84%，兩者的疊加解釋度達(dá)97.60%。冷藏組主要分散在第三和第四象限，常溫組主要分散在第一、二和三象限，B7組與B1～B6組距離較大，而B1～B6組之間距離較小，表明B7組與B1～B6組真菌結(jié)構(gòu)差異較大；冷藏A1～A7組之間均有一定分散，表明冷藏A1～A7組間真菌結(jié)構(gòu)存在一定差異。

圖2 鮮食花生貯藏過(guò)程中真菌群落門水平PCA分析Fig.2 PCA analysis of fungal community at phylum level during storage of fresh peanut

對(duì)距離矩陣進(jìn)行層級(jí)聚類分析，構(gòu)建樹狀結(jié)構(gòu)，可以更直觀觀察不同處理組間真菌群落的相似性及差異性。由圖3可知，B7組單獨(dú)聚為一類，說(shuō)明該組真菌群落組成與其他組真菌群落組成存在較大差異，B1～B6組、A2～A4組、A5～A6組之間在聚類關(guān)系上趨同性較強(qiáng)，表明其真菌群落組成的親緣關(guān)系較近。

圖3 鮮食花生貯藏過(guò)程中真菌群落門水平層次聚類分析Fig.3 Hierarchical cluster analysis of fungal community at phylum leved during storage of fresh peanut

2.3 鮮食花生貯藏過(guò)程中真菌群落結(jié)構(gòu)變化分析

對(duì)貯藏過(guò)程中鮮食花生樣品的真菌群落進(jìn)行分析，共鑒定出8 個(gè)門、28 個(gè)綱、62 個(gè)目、115 個(gè)科、196 個(gè)屬、302 種真菌，此外還有一些無(wú)法鑒定的真菌。選取相對(duì)豐度占比在1%以上的菌為優(yōu)勢(shì)菌、占比小于1%的菌歸為Other進(jìn)行分析。

門水平下鮮食花生優(yōu)勢(shì)菌群落變化如圖4 所示，主要有子囊菌門（Ascomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）和其他未識(shí)別真菌（unclassified_Fungi）。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，子囊菌門相對(duì)豐度整體呈下降趨勢(shì)，且在貯藏前期為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌。常溫組鮮食花生在貯藏30 d，被孢霉門成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌，相對(duì)豐度達(dá)58.69%；而冷藏組鮮食花生在貯藏后期，未識(shí)別真菌成為優(yōu)勢(shì)菌，且隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)整體呈升高趨勢(shì)，表明冷藏組鮮食花生在貯藏后期真菌多樣性增多。

圖4 鮮食花生貯藏過(guò)程中門水平下優(yōu)勢(shì)菌群落變化Fig.4 Changes of dominant fungal community at phylum level during storage of fresh peanut

綱水平下鮮食花生優(yōu)勢(shì)菌群落變化如圖5 所示，糞 殼 菌 綱（Sordariomycetes）、座 囊 菌 綱（Dothideomycetes）、未分類的子囊菌群體（unclassified_Ascomycota）為常溫組鮮食花生在貯藏前25 d 的主要優(yōu)勢(shì)菌，而在貯藏末期（30 d）被孢霉綱（Mortierellomycetes）成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌，相對(duì)豐度高達(dá)58.69%。糞殼菌綱為冷藏組鮮食花生貯藏前15 d 的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌，且隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)整體呈下降趨勢(shì)，而未知真菌則在貯藏后期成為優(yōu)勢(shì)菌，相對(duì)豐度高達(dá)46.00%以上。

圖5 鮮食花生貯藏過(guò)程中綱水平下優(yōu)勢(shì)菌群落變化Fig.5 Changes of dominant fungal community at class level during storage of fresh peanut

目水平下鮮食花生優(yōu)勢(shì)菌群落變化如圖6 所示，冷藏組與常溫組優(yōu)勢(shì)菌不同，常溫組在貯藏前25 d，主要優(yōu)勢(shì)菌有肉座菌目（Hypocreales）、小叢殼目（Glomerellales）、格孢腔菌目（Pleosporales）、座囊菌目（Dothideales）、未知真菌及未分類的子囊菌群體，而在貯藏30 d 時(shí)，被孢霉目（Mortierellales）成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌，相對(duì)豐度高達(dá)58.69%。冷藏組主要優(yōu)勢(shì)菌為肉座菌目和未知真菌，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，肉座菌目相對(duì)豐度整體呈下降趨勢(shì)，而未知真菌整體呈上升趨勢(shì)，表明常溫組鮮食花生真菌多樣性增多。

圖6 鮮食花生貯藏過(guò)程中目水平下優(yōu)勢(shì)菌群落變化Fig.6 Changes of dominant fungal community at order level during storage of fresh peanut

科水平下鮮食花生優(yōu)勢(shì)菌群落變化如圖7 所示，新鮮花生科水平下優(yōu)勢(shì)菌為未分類的子囊菌群體、叢赤殼科（Nectriaceae）、小不整球殼科（Plectosphaerellaceae）及短梗霉科（Aureobasidiaceae），相對(duì)豐度分別達(dá)35.21%、15.55%、15.21%和7.16%。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，常溫組鮮食花生子囊菌群體、叢赤殼科相對(duì)豐度整體呈下降趨勢(shì)，小不整球殼科、格孢菌科（Pleosporaceae）相對(duì)豐度整體呈先上升后降低趨勢(shì)，并于貯藏20 d 和25 d 達(dá)到最高值，分別為40.11%和24.19%，至貯藏末期，被孢霉科（Mortierellaceae）成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌，相對(duì)豐度高達(dá)58.69%。叢赤殼科與未知真菌是冷藏組鮮食花生主要的2種優(yōu)勢(shì)菌科，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，叢赤殼科相對(duì)豐度整體呈下降趨勢(shì)，未知真菌相對(duì)豐度整體呈升高趨勢(shì)。

圖7 鮮食花生貯藏過(guò)程中科水平下優(yōu)勢(shì)菌群落變化Fig.7 Changes of dominant fungal community at family level during storage of fresh peanut

屬水平下鮮食花生優(yōu)勢(shì)菌群落變化如圖8 所示，新鮮花生優(yōu)勢(shì)菌屬分別為未分類的子囊菌屬（unclassified_Ascomycota）、小 不 整 球 殼 屬（Plectosphaerella）、赤霉屬（Gibberella）及短柄霉屬（Aureoba sidium），相對(duì)豐度分別為35.21%、14.81%、10.32%和7.16%。鐮孢菌屬（Fusarium）、未知真菌和赤霉屬是冷藏組鮮食花生主要的優(yōu)勢(shì)菌屬，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，鐮孢菌屬相對(duì)豐度整體呈先上升后下降趨勢(shì)，并于貯藏15 d 時(shí)相對(duì)豐度達(dá)到峰值，為53.41%；未知真菌相對(duì)豐度整體呈上升趨勢(shì)，至貯藏期結(jié)束相對(duì)豐度高達(dá)66.78%。對(duì)常溫組鮮食花生來(lái)說(shuō)，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，未分類的子囊菌屬相對(duì)豐度整體呈下降趨勢(shì)，且一直為貯藏前15 d的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬，小不整球殼屬與鏈格孢屬（Alternaria）相對(duì)豐度整體呈先上升后下降趨勢(shì)，相對(duì)豐度分別在貯藏20 d和25 d達(dá)到峰值，為39.90%和23.92%，為優(yōu)勢(shì)菌屬；被孢霉屬相對(duì)豐度整體呈上升趨勢(shì)，至貯藏結(jié)束相對(duì)豐度高達(dá)58.69%，為優(yōu)勢(shì)菌屬。

圖8 鮮食花生貯藏過(guò)程中屬水平下優(yōu)勢(shì)菌群落變化Fig.8 Changes of dominant fungal community at genus level during storage of fresh peanut

2.4 鮮食花生貯藏過(guò)程中真菌群落差異關(guān)鍵菌群LEfSe分析

冷藏組與常溫組相比，鮮食花生真菌群落差異較大。LEfSe 分析（圖9）表明，2 組樣品在種水平上的66 種真菌具有顯著性差異。冷藏組鮮食花生真菌群落差異關(guān)鍵菌群主要有13個(gè)，隸屬于糞殼菌綱的赤霉屬、鐮孢菌屬及未知真菌。常溫組鮮食花生真菌群落差異關(guān)鍵菌群主要有53 種，隸屬于7 個(gè)綱，分別為座囊菌綱的鏈格孢屬、短柄霉屬，錘舌菌綱（Leotiomycetes）的Acidomelania，糞殼菌綱的輪枝孢屬（Verticillium）、Plectosphaerella屬，未分類的子囊菌屬，傘菌綱（Agaricomycetes）的亡革菌屬（Thanatephorus）、絲核菌屬（Rhizoctonia），銀耳綱（Tremellomycetes）的隱球菌屬（Cryptococcus）、漢納酵母屬（Hannaella）、Tausonia屬、Solicoccozyma屬，被孢霉綱的被孢霉屬。

圖9 鮮食花生貯藏過(guò)程中種水平下的菌群LEfSe 分析Fig.9 LEfSe analysis of fungal community at species level during storage of fresh peanut

3 結(jié)論與討論

實(shí)現(xiàn)周年化供應(yīng)是鮮食花生產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。與花生干果儲(chǔ)藏不同，花生鮮果因營(yíng)養(yǎng)豐富，含水量高，更適宜真菌繁殖?；ㄉ勺缘叵拢r食花生的安全貯藏與收獲時(shí)花生果的帶菌量關(guān)系密切，而帶菌量與土壤中的真菌種類、溫度、水分含量、濕度、病蟲害的侵染等關(guān)系密切[27-32]。本研究采用Illumina MiSeq 高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)鮮食花生貯藏過(guò)程中真菌群落組成和變化進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)新鮮花生的優(yōu)勢(shì)菌屬分別為未分類的子囊菌屬、小不整球殼屬、赤霉屬及短柄霉屬，與JOFFE[15]、王連平等[7]檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)菌存在差異，推測(cè)這可能與花生所種植的地理位置、土壤及空氣環(huán)境條件等相關(guān)。研究表明，冷藏組與常溫組鮮食花生主要優(yōu)勢(shì)菌不同，鐮孢菌屬、未知真菌和赤霉屬是冷藏組鮮食花生主要優(yōu)勢(shì)菌屬。康彥平等[33]對(duì)采自我國(guó)東北、北方和南方花生主產(chǎn)區(qū)8 個(gè)省份的22 個(gè)果腐病樣進(jìn)行病原菌分離鑒定，發(fā)現(xiàn)病原菌主要為鐮孢菌屬、新赤殼屬和絲核菌屬；李術(shù)臣等[34]、張成玲等[35]也認(rèn)為，引起花生果腐的病菌主要為鐮孢菌。果腐病是花生生產(chǎn)上的一種災(zāi)害性病害[36]，造成花生果腐病的原因有多種，尤以鐮孢菌為主，此外，花生品種抗性也會(huì)直接影響微生物特別是黃曲霉的侵染[31，37]。

鮮食花生的安全貯藏除受產(chǎn)前因素影響外，更受后期溫度、濕度等貯藏條件的影響。本研究中，常溫組鮮食花生在貯藏前期優(yōu)勢(shì)菌主要為子囊菌屬，貯藏后期優(yōu)勢(shì)菌為小不整球殼屬、鏈格孢屬、被孢霉屬，真菌微生物群落多樣性與豐富度均高于冷藏組，且隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降趨勢(shì)。其中被孢霉屬被認(rèn)為與有益真菌相關(guān)，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育起促進(jìn)作用[38-39]，這可能由于前期微生物大量生長(zhǎng)繁殖，導(dǎo)致代謝物和毒素積累，在抑制自身生長(zhǎng)的同時(shí)促進(jìn)了其他微生物的生長(zhǎng)，這是微生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)各種因素相互作用、相互影響的綜合結(jié)果。通過(guò)Alpha 多樣性、Beta 多樣性、差異關(guān)鍵菌群LEfSe 等分析，結(jié)果表明，冷藏組與常溫組之間真菌結(jié)構(gòu)存在差異，常溫組真菌群落多樣性與豐富度高于冷藏組，表明常溫促使更多微生物生長(zhǎng)繁殖。而低溫則起到較好的抑制作用，因此，低溫是鮮食花生后期貯藏的必備條件。