玫瑰石斛壯苗生長培養(yǎng)基成分優(yōu)化

楊丹丹，劉春穎，李得萍，易元慧，薛 緣，劉艷軍

（天津農(nóng)學院 園藝園林學院，天津 300392）

玫瑰石斛(Dendrobium crepidatum Lindl.ex Paxt.)，蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium Sw.）多年生草本植物，分布于中國、印度、泰國等多國?，F(xiàn)代研究表明，玫瑰石斛含有生物堿、多糖、甾醇類，以及肉桂酸酯等多種化學成分，化學成分類型類同于藥典收載石斛[1]，具有較高的保健和藥用價值，有滋陰養(yǎng)胃、抗炎、抗氧化及抗癌活性的作用[2]。除此之外，玫瑰石斛莖美花香，株叢緊湊美觀，平均整株高度15 cm，非常適合家庭中小型盆栽觀賞，具有較高的觀賞價值。但玫瑰石斛野生資源匱乏，種源成為制約玫瑰石斛人工大規(guī)模生產(chǎn)的重要因素。而近年來，對玫瑰石斛的研究較少，主要集中在組培快繁體系的建立[3]、化學成分研究[2]、葉片培養(yǎng)與原球莖誘導(dǎo)[4]、功能成分與生物堿研究[5]，以及HPLC 特征圖譜研究[1]等，以上大多局限于某一階段或者其成分研究，關(guān)于玫瑰石斛快繁體系的研究較少，而通過4 個因素3 個水平正交試驗設(shè)計對玫瑰石斛生長指標進行研究尚未見報道。

本研究是以玫瑰石斛無菌幼苗為試驗材料，對活性炭（AC）、生長素NAA、水解乳蛋白（LH）、MS 培養(yǎng)基有機成分4 個因素3 個水平設(shè)置正交試驗，從而研究4 個因素對玫瑰石斛壯苗生長的影響，找出適宜的壯苗生長培養(yǎng)基配方，為完善玫瑰石斛快速繁殖提供理論依據(jù)和實踐參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為初代或繼代培養(yǎng)后的無菌苗，種源是云南野生玫瑰石斛。由玫瑰石斛種子無菌萌發(fā)形成原球莖，培養(yǎng)后形成無菌幼苗，挑選健壯、生長整齊、長度為0.8 cm 的無菌苗進行試驗。

1.2 方法

1.2.1 正交試驗設(shè)計 對影響玫瑰石斛壯苗生長的4 個因素活性炭（AC）、NAA、水解乳蛋白（LH）以及MS 培養(yǎng)基有機成分設(shè)置3 個水平進行正交試驗設(shè)計，采用L9（34）正交表（表1）。再按照表1 設(shè)計玫瑰石斛壯苗生長正交試驗，每個處理均添加蔗糖30 g·L-1、瓊脂7 g·L-1，pH 調(diào)至5.8～6.0。

表1 因素水平表

1.2.2 接種與培養(yǎng) 將玫瑰石斛無菌幼苗接種到各處理的壯苗生長培養(yǎng)基中，每個處理接種15 瓶，每瓶接種4 個外植體，放置在培養(yǎng)室中培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照強度為2 000～2 500 lx，連續(xù)照明培養(yǎng)。培養(yǎng)90 d 后，觀察無菌幼苗生長情況，對試驗結(jié)果用Excel 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，SPSS 20.0 對數(shù)據(jù)進行極差分析、多因素方差分析、多重比較及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 無菌幼苗生長情況

由表2 可知，植株總體長勢良好，在不同的壯苗生長培養(yǎng)基中，玫瑰石斛組培苗長勢、葉片數(shù)量、葉片顏色、根顏色及數(shù)量都有所差異。其中，處理1 組培苗生長羸弱、長勢差、生長不良、根數(shù)量少，甚至有2 株死亡（圖1）；處理4 組培苗生長健壯，長勢最好，葉稍黃，根數(shù)量多，根粗且長（圖2）?？傮w而言，處理4 更適合玫瑰石斛組培苗生長，即0.05 g·L-1AC+0.25 mg·L-1NAA+0.1 g·L-1LH+2 倍有機成分是玫瑰石斛壯苗生長較適宜的培養(yǎng)基，培養(yǎng)90 d 后，植株平均株高2.27 cm，平均莖粗1.40 mm,葉片平均數(shù)3.25 片，平均生根數(shù)5.33 條，平均分蘗數(shù)2.50 個。

圖1 處理組合1 玫瑰石斛無菌苗生長情況

圖2 處理組合4 玫瑰石斛無菌苗生長情況

表2 正交試驗結(jié)果

2.2 正交試驗直觀分析

由表3 可知，株高指標方面極差RA=0.31＞RD=0.29＞RB=0.09＞RC=0.04，即4 個因素中對玫瑰石斛無菌幼苗株高影響的主次順序為A:AC＞D:有機成分倍數(shù)＞B:NAA＞C:LH；同理，影響玫瑰石斛無菌幼苗莖粗的主次順序為A:AC＞B:NAA＞D:有機成分倍數(shù)＞C:LH；影響組培苗葉片數(shù)的主次順序為B:NAA＞D:有機成分倍數(shù)＞C:LH＞A:AC；影響組培苗生根量的主次順序為A:AC＞C:LH＞D: 有機成分倍數(shù)＞B:NAA；影響組培苗分蘗數(shù)的主次順序為C:LH＞A:AC=D:有機成分倍數(shù)＞B:NAA，綜合分析得出，4 個因素中因素A 活性炭濃度對玫瑰石斛無菌幼苗株高、莖粗、葉片數(shù)、生根量和分蘗數(shù)影響最大。

表3 玫瑰石斛壯苗生長極差分析表

由均值K 大小可以看出，各因素3 個水平對玫瑰石斛無菌幼苗株高影響的大小順序為A2＞A3＞A1，B3＞B2＞B1，C2＞C3＞C1，D2＞D3＞D1，即A 因素的最優(yōu)水平為0.05 g·L-1活性炭，B 因素最優(yōu)水平為1 mg·L-1NAA，C 因素的最優(yōu)水平為0.1 g·L-1水解乳蛋白，D 因素的最優(yōu)水平為2 倍有機成分，即影響玫瑰石斛無菌幼苗株高的最佳組合為A2B3C2D2；同理，影響組培苗莖粗的最佳組合為A1B2C1D1；影響組培苗葉片數(shù)的最佳組合為A1B2C2D2；影響組培苗生根量的最佳組合為A3B2C3D2；影響組培苗分蘗數(shù)的最佳組合為A2B2C3D2。總體而言，A1或者A2水平下、B2水平下、C2或者C3個水平下，以及D2水平下的培養(yǎng)基組合形式對玫瑰石斛無菌幼苗株高、莖粗、葉片數(shù)、生根量、分蘗數(shù)效果相對較好，而培養(yǎng)基最佳組合還需要結(jié)合方差分析和多重比較進行確定。

2.3 正交試驗方差分析

對試驗結(jié)果進行方差分析（表4），可以看出，因素A 活性炭濃度對玫瑰石斛無菌幼苗的株高、生根量的P 值均小于0.001，說明因素A 活性炭濃度對玫瑰石斛無菌幼苗的株高、生根量有極顯著影響，而對其他3 個生長指標無顯著影響；同理，因素B 即NAA 濃度對玫瑰石斛無菌幼苗的株高、莖粗、生根量、分蘗數(shù)均無顯著差異，而對組培苗葉片數(shù)有顯著影響；因素C 水解乳蛋白濃度對玫瑰石斛無菌幼苗的株高、莖粗、葉片數(shù)、分蘗數(shù)均無顯著影響，對組培苗生根量有顯著影響；因素D 有機成分倍數(shù)對玫瑰石斛無菌幼苗的莖粗、葉片數(shù)、生根量、分蘗數(shù)均無顯著差異，對組培苗株高有極顯著影響。因此，筆者進行下一步分析，即多重比較（表5）。因B 因素3 個水平對玫瑰石斛無菌幼苗株高、莖粗、生根量、分蘗數(shù)，C 因素3 個水平對幼苗株高、莖粗、葉片數(shù)、分蘗數(shù)，以及D 因素3 個水平對幼苗莖粗、葉片數(shù)、生根量、分蘗數(shù)均無顯著差異，顯著性測驗與因素A 對幼苗莖粗、葉片數(shù)、分蘗數(shù)相同，因此在表5 中未完全列出。

表4 玫瑰石斛壯苗生長方差分析表

表5 不同因素水平對玫瑰石斛生長指標差異的顯著性測驗

對試驗結(jié)果進行下一步分析即多重比較（如表5）結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A2、A3個水平下對玫瑰石斛無菌幼苗的株高、生根量有極顯著的影響，與A1水平下存在極顯著的差異，而A1、A2、A33 個水平對組培苗莖粗、葉片數(shù)、分蘗數(shù)均無顯著影響；同理可以得出，B2水平下對玫瑰石斛無菌幼苗的葉片數(shù)有極顯著的影響，與B1水平下存在極顯著的差異，與B3個水平下無顯著差異，而B1、B2、B33 個水平對組培苗的株高、莖粗、生根量、分蘗數(shù)都無顯著差異；C3個水平下對玫瑰石斛無菌幼苗的生根量有極顯著的影響，與C2水平下存在極顯著的差異，與C1水平下無顯著差異，而C1、C2、C33 個水平對組培苗的株高、莖粗、葉片數(shù)、分蘗數(shù)均無顯著差異；D2水平下對玫瑰石斛無菌幼苗的株高有極顯著的影響，與D1、D3個水平下存在極顯著的差異，而D1、D2、D33 個水平對組培苗的莖粗、葉片數(shù)、生根量、分蘗數(shù)均無顯著差異。

2.4 玫瑰石斛無菌苗成分指標與生長狀況指標的相關(guān)性

由表6 可知，利用相關(guān)分析去研究A 活性炭、BNAA、C 水解乳蛋白、D 有機成分分別和株高、莖粗、葉片、生根、分蘗之間的相關(guān)關(guān)系，使用Spearman 相關(guān)系數(shù)去表示相關(guān)關(guān)系的強弱情況。具體分析可知：A 與株高、生根之間全部均呈現(xiàn)出顯著性，相關(guān)系數(shù)值分別是0.270、0.462，全部均大于0。這說明A 與株高、生根之間有著正相關(guān)關(guān)系。同時，A 與莖粗、葉片、分蘗3 項之間不呈現(xiàn)顯著性，相關(guān)系數(shù)值接近于0。這說明A 與莖粗、葉片、分蘗3 項之間并沒有相關(guān)關(guān)系。同理可知，B、C、D 3 個因素與株高、莖粗、葉片、生根、分蘗共5 項之間均沒有呈現(xiàn)出顯著性，相關(guān)系數(shù)值全部均接近于0，說明B、C、D與株高、莖粗、葉片、生根、分蘗5 項之間均沒有相關(guān)關(guān)系。

表6 玫瑰石斛無菌苗成分指標與生長狀況指標的相關(guān)性

根據(jù)試驗結(jié)果進行直觀分析、方差分析、多重比較以及相關(guān)性分析，直觀分析得出A1或者A2水平下、B2水平下、C2或者C3個水平下以及D2水平下的培養(yǎng)基組合形式對玫瑰石斛無菌幼苗株高、莖粗、葉片數(shù)、生根量、分蘗數(shù)效果相對較好，而據(jù)方差分析及多重比較可以得出，A2、A3個水平下對玫瑰石斛無菌幼苗的株高、生根量有極顯著的影響，與A1水平下存在極顯著的差異，C3個水平下對玫瑰石斛無菌幼苗的生根量有極顯著的影響，與C2水平下存在極顯著的差異，與C1水平下無顯著差異，而相關(guān)性分析可知，A 與株高、生根之間全部均呈現(xiàn)出極顯著正相關(guān)，其他3 因素對玫瑰石斛無菌苗生長影響不大，與株高、莖粗、葉片、生根、分蘗之間沒有相關(guān)關(guān)系。植株生長情況的好壞不是看單一生長指標，而是各個生長指標綜合得出。綜合分析得出，玫瑰石斛組培苗生長的最佳培養(yǎng)基組合為A2B2C3D2，即0.05 g·L-1活性炭+0.5 mg·L-1NAA+0.2 g·L-1水解乳蛋白+2 倍有機成分的培養(yǎng)基組合形式對組培苗各生長指標影響效果最好。由于本試驗采用的正交設(shè)計，進行的是不完全試驗設(shè)計，因此最佳組合A2B2C3D2在試驗中沒有顯現(xiàn)出來。

3 討論與結(jié)論

活性炭除了能吸附植株生長發(fā)育過程中產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物外，還對植株的生長有一定的促進作用，特別是對植株生根有明顯的促進作用[6]。在正交試驗研究中筆者發(fā)現(xiàn)，活性炭對玫瑰石斛組培苗生長影響較大，在較低濃度0.025～0.05 g·L-1濃度范圍內(nèi)均適合。通過極差和方差分析均得出，活性炭對玫瑰石斛組培苗的株高和生根量影響最大，達到極顯著，且與株高、生根之間均呈現(xiàn)出極顯著正相關(guān)，這一結(jié)論與其他石斛品種結(jié)論相對一致[7]。生長素NAA是組培苗生長過程中重要的生長激素，對石斛屬植物的快速生長有促進作用[8]。但本試驗中結(jié)果顯示，NAA 只對玫瑰石斛組培苗的葉片數(shù)產(chǎn)生顯著影響，對其他生長指標沒有顯著性差異，在稍高濃度0.5 mg·L-1NAA 處理下生長效果較好，且與株高、莖粗、葉片、生根、分蘗沒有相關(guān)性。這說明玫瑰石斛對生長素NAA 的作用不敏感。MS 培養(yǎng)基中的有機成分主要含有VB6、VB1以及甘氨酸等營養(yǎng)物質(zhì)，這些營養(yǎng)元素是石斛類植物生長的有益成分[9]。本試驗中研究發(fā)現(xiàn)，MS 培養(yǎng)基中有機成分對組培苗的株高產(chǎn)生了極顯著影響，但對其他生長指標沒有顯著性差異。水解乳蛋白是一種人工蛋白質(zhì)常用于植物的組織培養(yǎng)中，對植株的快速生長有較好的促進作用[10]。而本試驗中結(jié)果顯示，水解乳蛋白對玫瑰石斛組培苗的生長量有顯著影響，但其他生長指標影響效果低于其他3 個因素的影響，使用效果不佳，且與試驗所記錄生長指標沒有相關(guān)性，因此水解乳蛋白對玫瑰石斛組培苗的生長影響效果不好。植株生長情況的好壞不是看單一生長指標，而是各個生長指標綜合得出，石斛屬植物是多年生叢生植物，具有較強的分蘗能力，但分蘗過多也會影響植株的整體發(fā)展。因此，應(yīng)適當找到其最適的分蘗能力，本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這4 個因素均對玫瑰石斛的分蘗數(shù)沒有顯著性差異，也不存在明顯的相關(guān)關(guān)系。這說明玫瑰石斛自身的分蘗能力固定，在額外添加作用也無法改變其分蘗能力。

綜上，活性炭濃度對玫瑰石斛無菌幼苗的株高、生根量有極顯著影響，與株高、生根之間全部均呈現(xiàn)出極顯著正相關(guān)；NAA 濃度對玫瑰石斛無菌幼苗葉片數(shù)有顯著影響；水解乳蛋白濃度對玫瑰石斛無菌幼苗生根量有顯著影響；因素D 有機成分倍數(shù)對玫瑰石斛無菌幼苗株高有極顯著影響，而因素B、C、D 與玫瑰石斛無菌苗株高、莖粗、葉片、生根、分蘗之間沒有相關(guān)關(guān)系。綜合分析，試驗最終確定4 個因素3 個水平下，玫瑰石斛組培苗壯苗生長最佳培養(yǎng)基組合為0.05 g·L-1活性炭+0.5 mg·L-1NAA+0.2 g·L-1水解乳蛋白+2 倍有機成分。該研究以期為完善玫瑰石斛快速繁殖提供理論依據(jù)和實踐參考。