凝結(jié)芽孢桿菌BC2000聯(lián)合鞣花酸改善高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠胰島素抵抗

黨紅陽，李欣悅，齊 策，王 亮，孫 進,*

（1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046；2.青島大學(xué)營養(yǎng)與健康研究院，山東 青島 266000）

膳食性肥胖癥是全球關(guān)注的健康問題。有研究表明，肥胖癥患者常伴有胰島素抵抗癥，導(dǎo)致機體營養(yǎng)代謝失衡和脂類積聚，并由此增大了高血脂、高血糖等并發(fā)疾病及心血管疾病、非酒精性脂肪肝等慢性病患病風(fēng)險[1]。

目前，緩解胰島素抵抗的主要藥物有曲格列酮、羅格列酮等二酮類化合物，其通過促進胰島素分泌、增強胰島素信號活性來提高胰島素敏感性，改善胰島素抵抗[2]。但是，長期服用上述藥物會對肝臟產(chǎn)生一定程度的毒副作用，所以尋找天然有效的膳食補充劑緩解胰島素抵抗十分關(guān)鍵[3]。益生菌可以改善宿主內(nèi)源性腸道菌群的組成，促進生理穩(wěn)態(tài)。但是，傳統(tǒng)的益生菌（如乳桿菌和雙歧桿菌）對溫度非常敏感[4]，而凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）的芽孢體具有耐胃酸、耐膽鹽、耐熱、耐氧和產(chǎn)品貨架期穩(wěn)定性高等優(yōu)點[5]，在食品中具有更廣的應(yīng)用價值。

凝結(jié)芽孢桿菌能夠進入人體結(jié)腸，具有改善宿主腸道菌群[6]、調(diào)節(jié)免疫、緩解炎癥[7]和調(diào)節(jié)糖脂代謝[8-10]等生理功能。凝結(jié)芽孢桿菌BC2000和BC30被廣泛添加于混合堅果和果干產(chǎn)品中，不僅可以改善混合堅果的風(fēng)味，更能強化這些食物潛在的生理調(diào)節(jié)作用[11]。鞣花酸（ellagic acid，EA）是一種天然多酚類化合物，廣泛存在于水果、堅果中，如石榴、蔓越莓、草莓和核桃等。EA具有調(diào)節(jié)糖脂代謝的作用[12-13]。但是，EA的生物有效性和生物利用度較低，90%～95%的EA在小腸中不能被消化和吸收，需要被特定的結(jié)腸細(xì)菌轉(zhuǎn)換為尿石素A等產(chǎn)物后才可發(fā)揮作用[14]。肥胖個體腸道菌群結(jié)構(gòu)改變，轉(zhuǎn)化EA的效率降低。凝結(jié)芽孢桿菌可能具有轉(zhuǎn)化多酚活性[15]和調(diào)節(jié)腸道菌群構(gòu)成的作用[16]，也可以預(yù)防肥胖等慢性疾病[17]。因此，添加凝結(jié)芽孢桿菌可能促進EA生理調(diào)節(jié)作用，本研究旨在探討凝結(jié)芽孢桿菌BC2000和BC30對EA調(diào)節(jié)血脂及胰島素抵抗作用的影響，為BC2000作為益生菌在富含EA食品配方中的應(yīng)用提供進一步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

50 只6 周齡雄性C57BL/6J小鼠（體質(zhì)量（21.0±0.8）g），購于北京斯貝福實驗動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0010，在青島大學(xué)實驗動物中心飼喂。

凝結(jié)芽孢桿菌BC2000從東北酸菜中分離得到，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC No.21621。

凝結(jié)芽孢桿菌BC30（凝結(jié)芽孢桿菌GBI-30，6086），從美國Schiff公司生產(chǎn)的Digestive Adantage益生菌膠囊分離獲得，并經(jīng)生化和16S rRNA基因測序鑒定確認(rèn)。

EA（純度99.9%） 上海源葉生物科技有限公司；甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒南京建成生物工程研究所；胰島素、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、連蛋白（zonulin）和超敏C反應(yīng)蛋白（highsensitivity C-reactive protein，hs-CRP）酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒江蘇晶美生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

卓越纖巧型血糖儀 德國羅氏診斷有限公司；3k-15離心機 德國Sigma公司；Multiscan Go多功能酶標(biāo)儀 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 動物實驗設(shè)計

本研究的動物實驗方案經(jīng)青島大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)（審批號：QDU-AEC-2022259）。50 只雄性C57BL/6J小鼠在青島大學(xué)實驗動物中心喂養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境條件：12 h光照/12 h黑暗循環(huán)、溫度（22±1）℃、相對濕度（50±5）%。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后隨機分為5 組（n＝10）：低脂飲食（low fat diet，LFD）組、高脂飲食（high fat diet，HFD）、EA干預(yù)組（HFD+EA組）、凝結(jié)芽孢桿菌BC30聯(lián)合EA干預(yù)組（HFD+EA+BC30組）、凝結(jié)芽孢桿菌BC2000聯(lián)合EA干預(yù)組（HFD+EA+BC2000組）。由表1可知，小鼠飼料的脂肪來自于豬油和大豆油。凝結(jié)芽孢桿菌BC2000和凝結(jié)芽孢桿菌BC30以凍干粉形式添加，每克凍干粉含4×1011CFU益生菌，根據(jù)小鼠的采食量（2.3～3.3 g/d），每千克高脂飼料添加0.1 g凍干粉，每只小鼠每天攝入約0.92×108～1.32×108CFU凝結(jié)芽孢桿菌BC2000或BC30。每組3 籠，每籠3～4 只，2～3 d給水給料1 次，持續(xù)喂養(yǎng)10 周，所有小鼠都可以自由飲水和飲食。

表1 小鼠飼料配方Table 1 Formulation of experimental diets for mice

1.3.2 小鼠體質(zhì)量、采食量的測定

每周進行小鼠體質(zhì)量、采食量的測定。

1.3.3 小鼠血糖相關(guān)指標(biāo)的測定

第9周，每組隨機選取6 只小鼠，禁食12 h后進行口服葡萄糖耐量實驗（oral glucose tolerance test，OGTT）。先測定小鼠空腹血糖濃度，然后以400 mg/mL的葡萄糖溶液灌胃，灌胃量為0.1 mL/20 gmb，分別在0、15、30、60 min和90 min采用尾靜脈取血的方式測定小鼠的血糖濃度[18]，繪制曲線并計算曲線下面積（area under the curve，AUC），獲得小鼠葡萄糖耐受量。

第10周，小鼠禁食12 h，將小鼠麻醉收集血樣于抗凝管中，4 ℃、1 500×g離心10 min，得到小鼠血漿樣本，測定血糖濃度。參照試劑盒說明書進行血漿胰島素濃度測定，根據(jù)公式（1）計算胰島素抵抗指數(shù)（insulin resistance index，IRI）。

1.3.4 小鼠血脂相關(guān)生化指標(biāo)的測定

按照試劑盒說明書進行血漿TC、TG、LDL-C、HDL-C濃度的測定。

1.3.5 小鼠炎性細(xì)胞因子指標(biāo)的測定

根據(jù)ELISA試劑盒說明書測定血漿中TNF-α、IL-6、LPS、Zonulin、hs-CRP的質(zhì)量濃度和肝臟中TNF-α的質(zhì)量濃度。

1.3.6 脂肪和肝臟的組織學(xué)分析

用組織固定液固定新鮮的肝臟進行石蠟包埋，再準(zhǔn)備5 μm厚的組織切片進行蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，H&E）以及油紅O染色。用組織固定液固定新鮮的睪周脂肪組織，進行H&E染色。光學(xué)顯微鏡下進行病理組織學(xué)觀察。

1.3.7 16 S rRNA盲腸內(nèi)容物菌群結(jié)構(gòu)分析

快速無菌取0.2 g小鼠盲腸內(nèi)容物，置于干冰中保存，委托北京百邁克生物科技股份有限公司檢測。按照16S rRNA V3～V4可變區(qū)設(shè)計聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增引物序列（正向引物：5＇-ACTCCTACGGGAGG CAGCA-3＇；反向引物：5＇-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3＇），采用Illumina NovaSeq平臺進行測序。用易擴增子（EasyAmplicon）對測序數(shù)據(jù)進行下游分析，用ImageGP和microbiomeanalyst在線工具對分析結(jié)果進行可視化作圖。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析（ANOVA），利用Tukey多重比較檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析，以P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。使用GraphPad Prism 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝結(jié)芽孢桿菌BC30和BC2000對高脂小鼠體質(zhì)量、采食量的影響

如圖1A所示，高脂飼料喂養(yǎng)5 周后，與LFD組相比，HFD組小鼠體質(zhì)量顯著增加（P＜0.05）。實驗結(jié)束時，高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠體質(zhì)量是低脂飲食的1.2 倍。喂養(yǎng)9 周后，與HFD組相比，HFD+EA組體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05）。實驗過程中，HFD+EA+BC30和HFD+EA+BC2000喂養(yǎng)沒有引起小鼠肥胖。喂食期間，與LFD組相比，高脂飲食可以顯著降低小鼠的采食量（P＜0.05）（圖1B）。

圖1 凝結(jié)芽孢桿菌BC30和BC2000對高脂小鼠體質(zhì)量（A）、采食量（B）的影響（n＝10）Fig.1 Effect of Bacillus coagulans BC30 and BC2000 on body mass (A)and food intake (B) in high-fat diet-fed mice (n = 10)

2.2 凝結(jié)芽孢桿菌BC30和BC2000對高脂小鼠血糖相關(guān)指標(biāo)的影響

OGTT可以定量測定胰島β細(xì)胞功能和胰島素敏感性，反映機體對血糖的調(diào)節(jié)能力[19]。如圖2A所示，灌胃葡萄糖后，LFD組小鼠血糖濃度在30 min后升至最高，并在90 min內(nèi)恢復(fù)到正常水平。HFD組小鼠的血糖濃度在30 min后達到最大值，90 min時未恢復(fù)到正常水平，表明HFD組小鼠胰島素分泌紊亂，血糖調(diào)節(jié)能力失衡，葡萄糖耐量受損。與HFD組相比，灌胃30 min時，HFD+EA+BC2000組血糖濃度顯著降低（P＜0.05），90 min時，HFD+EA+BC30組血糖濃度顯著降低（P＜0.05）。

如圖2B所示，與LFD組相比，HFD組AUC顯著升高（P＜0.05）。與HFD組相比，HFD+EA+BC2000組AUC顯著降低（P＜0.05），HFD+EA和HFD+EA+BC30組無顯著性差異。圖2C顯示，與HFD組相比，添加EA能顯著降低胰島素水平（P＜0.05）。與HFD+EA相比，添加凝結(jié)芽孢桿菌BC2000可以顯著降低胰島素水平（P＜0.05），但添加凝結(jié)芽孢桿菌BC30沒有顯著降低胰島素水平。如圖2D所示，添加EA能顯著降低高脂肪飲食導(dǎo)致的IRI升高（P＜0.05）。與HFD+EA組相比，添加凝結(jié)芽孢桿菌BC2000可以顯著降低IRI（P＜0.05），添加凝結(jié)芽孢桿菌BC30無顯著性變化。綜上表明EA和BC2000協(xié)同作用能夠降低葡萄糖的吸收速率，增強胰島β細(xì)胞功能，降低胰島素水平，緩解高脂小鼠葡萄糖耐量受損，進而緩解胰島素抵抗，且作用效果優(yōu)于EA和EA+BC30。

圖2 凝結(jié)芽孢桿菌BC30和BC2000對高脂小鼠血糖相關(guān)指標(biāo)的影響（n＝6）Fig.2 Effect of Bacillus coagulans BC30 and BC2000 on blood glucose-related indicators in high-fat diet-fed mice (n = 6)

2.3 凝結(jié)芽孢桿菌BC30和BC2000對高脂小鼠血脂相關(guān)指標(biāo)的影響

高脂飲食通常伴隨著脂質(zhì)代謝異常。高脂飼料喂養(yǎng)10 周后，與LFD組小鼠相比，HFD組小鼠血漿TG、TC、LDL-C濃度和LDL-C/HDL-C比值顯著升高（P＜0.05）（圖3）。補充EA可顯著減低高脂飲食小鼠血漿TG、TC濃度和LDL-C/HDL-C比值（P＜0.05）。與HFD+EA組相比，補充凝結(jié)芽孢桿菌BC2000可顯著降低血漿TC濃度（P＜0.05）。HFD+EA+BC30組與HFD+EA+BC2000組各血脂相關(guān)指標(biāo)無顯著性差異。5 組小鼠HDL-C濃度無顯著性差異。綜上，補充凝結(jié)芽孢桿菌BC30、BC2000可以有效促進EA改善高脂飲食引起血脂水平紊亂的作用，作用效果優(yōu)于單獨使用EA，并且補充EA+BC2000更有利于預(yù)防高脂飲食導(dǎo)致的TC濃度升高。

圖3 凝結(jié)芽孢桿菌BC30和BC2000對高脂小鼠血脂相關(guān)指標(biāo)的影響（n＝10）Fig.3 Effect of Bacillus coagulans BC30 and BC2000 on blood lipid-related indexes in high-fat diet-fed mice (n = 10)

2.4 凝結(jié)芽孢桿菌BC30和BC2000對高脂小鼠炎性細(xì)胞因子的影響

由圖4可知，與HFD組相比，補充EA可以顯著降低高脂飲食引起的血漿LPS、hs-CRP、Zonulin和IL-6的水平及肝臟TNF-α水平的升高（P＜0.05）；與HFD+EA組相比，補充凝結(jié)芽孢桿菌BC30可以顯著降低血漿hs-CRP和Zonulin水平（P＜0.05），補充凝結(jié)芽孢桿菌BC2000可以顯著降低血漿LPS、hs-CRP和Zonulin水平（P＜0.05）。與HFD+EA+BC30相比，BC2000可以顯著降低血漿Zonulin水平。LPS和Zonulin是表征腸道黏膜通透性的重要標(biāo)識物[20]，血漿LPS、Zonulin水平升高表明腸道黏膜通透性升高，黏膜屏障受損，產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子，如hs-CRP、TNF-α和IL-6進入血液循環(huán)，進而導(dǎo)致全身低水平炎癥。這些結(jié)果表明，EA能夠改善高脂飲食引起的全身低水平炎癥。但EA和BC30、BC2000協(xié)同作用能夠更好地改善黏膜通透性，維護腸道屏障結(jié)構(gòu)與功能，從而減少炎癥細(xì)胞因子的分泌。

圖4 凝結(jié)芽孢桿菌BC30和BC2000對高脂小鼠炎性細(xì)胞因子的影響（n＝9）Fig.4 Effect of Bacillus coagulans BC30 and BC2000 on inflammatory cytokines in high-fat diet-fed mice (n = 9)

2.5 凝結(jié)芽孢桿菌BC30和BC2000對高脂小鼠肝臟和睪周脂肪形態(tài)的影響

由圖5A可知，高脂肪飲食小鼠H&E染色肝臟切片可見炎性細(xì)胞浸潤和脂質(zhì)空泡化。肝臟油紅O染色結(jié)果顯示，HFD組小鼠肝臟脂肪著色明顯，可見大量的脂肪滴，相同視野范圍內(nèi)HFD組肝臟中的脂滴面積百分比顯著高于其他組（圖5B、D）。與HFD組相比，補充EA、EA+BC30和EA+BC2000均可以顯著降低肝臟脂質(zhì)積聚（P＜0.05），但HFD+EA、HFD+EA+BC30及HFDEA+BC2000組之間的肝臟脂滴面積百分比無顯著性差異（圖5D）。與LFD組相比，HFD組睪周脂肪細(xì)胞明顯增大（圖5C），補充EA、EA+BC30及EA+BC2000可以顯著減小高脂小鼠的睪周脂肪細(xì)胞面積（P＜0.05）（圖5E），但HFD+EA、HFD+EA+BC30及HFDEA+BC2000組肝臟和睪周脂肪組織形態(tài)無顯著性差異。這些結(jié)果表明，EA、EA+BC30及EA+BC2000均能夠有效抑制高脂肪飲食導(dǎo)致的脂肪細(xì)胞肥大和肝臟脂肪變性。

圖5 凝結(jié)芽孢桿菌BC30和BC2000對高脂小鼠肝臟和睪周脂肪組織形態(tài)的影響（n＝10）Fig.5 Effect of Bacillus coagulans BC30 and BC2000 on the morphology of liver and epididymal adipose tissues in high-fat-fed mice (n = 10)

2.6 凝結(jié)芽孢桿菌BC30和BC2000對高脂小鼠盲腸內(nèi)容物菌群多樣性的影響

通過Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)評估高脂小鼠盲腸內(nèi)容物菌群的Alpha多樣性。如圖6A～C所示，高脂喂養(yǎng)引起了盲腸內(nèi)容物菌群Alpha多樣性的變化，與HFD組相比，HFD+EA小鼠盲腸菌群的Shannon多樣性指數(shù)和Simpson多樣性指數(shù)極顯著降低（P＜0.01），補充凝結(jié)芽孢桿菌BC2000或BC30對盲腸內(nèi)容物菌群Alpha多樣性有提高作用，但無統(tǒng)計學(xué)差異。Beta多樣性主要反映菌群構(gòu)成的群體間差異?；赨niFrac加權(quán)矩陣主坐標(biāo)分析（principal coordinates analysis，PCoA）顯示，HFD組與其他組之間5 種腸道菌群組成差異顯著（P＜0.05）（圖6D）?；赨niFrac未加權(quán)矩陣PCoA表明，與LFD組相比，高脂喂養(yǎng)顯著改變了腸道菌群的組成（P＜0.015），與HFD組相比，添加EA或EA+BC30可以顯著改變腸道菌群的組成（P＜0.012、P＜0.003），但添加EA+BC2000無顯著性改變（圖6E）。與HFD+EA相比，添加BC2000可以顯著改變腸道菌群的組成（P＜0.003）。

圖6 凝結(jié)芽孢桿菌BC30和BC2000對高脂小鼠盲腸內(nèi)容物細(xì)菌多樣性的影響（n＝6）Fig.6 Effect of Bacillus coagulans BC30 and BC2000 on the bacterial diversity of cecum contents in high-fat diet-fed mice (n = 6)

2.7 凝結(jié)芽孢桿菌BC30和BC2000對高脂小鼠盲腸內(nèi)容物菌群組成的影響

為探究EA和凝結(jié)芽孢桿菌BC2000在腸道菌群中的作用，對盲腸內(nèi)容物的細(xì)菌的構(gòu)成進行分析。如圖7A所示，在門水平上，F(xiàn)irmicutes（厚壁菌門）、Bacteroidetes（擬桿菌門）、Desulfobacterota（脫硫桿菌門）、Actinobacteria（放線菌門）是腸道菌群主要優(yōu)勢菌群。與LFD組相比，HFD喂養(yǎng)降低了Bacteroidetes的相對豐度，提高了Desulfobacterota相對豐度。與HFD組相比，EA處理顯著提高了Firmicutes的相對豐度（P＜0.05），EA復(fù)合BC2000處理降低了Desulfobacterota相對豐度，提高了Actinobacteria的相對豐度，但無顯著性差異。研究表明，F(xiàn)irmicutes與Bacteroidetes豐度比值（F/B）在肥胖小鼠腸道內(nèi)明顯升高[21]，如圖7D所示、LFD、HFD、HFD+EA、HFD+EA+BC30及HFD+EA+BC2000組小鼠F/B比值分別為9.7、19.2、17.1、11.5和10.4，HFD+EA+BC30和HFD+EA+BC2000可以降低高脂肪飲食導(dǎo)致的F/B比值的升高，且優(yōu)于EA單獨作用，但相互之間無顯著性差異。

如圖7B所示，在屬水平上（相對豐度前10 位的菌屬），與LFD組相比，HFD組腸道機會致病菌Desulfovibrio相對豐度高度極顯著提高（P＜0.001），補充EA+BC2000可以得到改善。與HFD組相比，HFD+EA干預(yù)明顯提高了Faecalibaculum相對豐度。與HFD組相比，添加EA和EA+BC2000可以顯著或極顯著提高有益菌Lactobacillus的相對豐度（P＜0.05、P＜0.01）。這表明，HFD+EA、HFD+EA+BC30和HFD+EA+BC2000干預(yù)可以顯著改善屬水平上的腸道菌群的組成，促進有益菌Faecalibaculum和Lactobacillus生長，抑制機會致病菌Desulfovibrio的生長。

采用線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）和LDA差異貢獻分析（LDA effect size，LEfSe）可以檢驗微生物物種豐度的組間差異（錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05、LDA≥2為組間菌屬相對豐度具有顯著性差異的篩選標(biāo)準(zhǔn)）。如圖7C所示，在屬水平上，差異顯著的菌屬共10 個，在LFD組中Akkermansia、Lachnospiraceae_FCS020_group、Sphingopysix、Lachnospiraceae_UCG_010是標(biāo)志性菌屬。HFD組的標(biāo)志性菌屬是Desulfovibrio和Enteractinococccus。HFD+EA+BC2000組的標(biāo)志性菌屬為Lactobacillus、Monoglobus、Bacillus和Psedograilibacillus。

圖7 凝結(jié)芽孢桿菌BC30和BC2000對高脂小鼠盲腸內(nèi)菌群構(gòu)成的影響（n＝6）Fig.7 Effect of Bacillus coagulans BC30 and BC2000 on the bacterial composition of cecum contents in high-fat diet-fed mice (n = 6)

2.8 小鼠腸道菌群與生化指標(biāo)的相關(guān)性分析

將HFD+EA組與HFD+EA+BC2000組相對豐度具有差異顯著的菌屬（FDR＜0.05）與生化指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果如圖8A所示。Bacillus（芽孢桿菌屬）相對豐度與TC、LDL-C、IRI、Zonulin、hs-CRP、血漿TNF-α水平呈顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）負(fù)相關(guān)，Enteractinococcus（腸球菌屬）相對豐度與IRI、Zonulin、hs-CRP水平呈顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）負(fù)相關(guān)，Pseudogracilibacillus（假纖細(xì)芽孢桿菌屬）、Alistipes（另枝菌屬）與IRI呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），Clostridium_sensu_stricto_1（梭狀芽孢桿菌屬）、Turicibacter（蘇黎世桿菌屬）相對豐度與TC濃度呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），Lachnospiraceae_FSC02_group（毛螺菌屬）相對豐度與TC、LDL-C和Zonulin濃度呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），UCG_009相對豐度與Zonulin濃度和IRI分別呈顯著（P＜0.05）和極顯著（P＜0.01）正相關(guān)。如圖8B所示，血漿TC、LDL-C水平與炎性細(xì)胞因子hs-CRP、IL-6、LPS、肝臟TNF-α水平呈極顯著或高度顯著正相關(guān)（P＜0.01、P＜0.001）；IRI與IL-6水平呈高度顯著正相關(guān)（P＜0.001）。表明Bacillus、Enteractinococcus、UCG_009、Pseudogracilibacillus、Alistipes、Clostridium_sensu_stricto_1、Lachnospiraceae_FSC02_group、Turicibacter菌群與高脂小鼠的胰島素抵抗、黏膜屏障能力顯著相關(guān)。腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致黏膜屏障受損，炎性細(xì)胞因子通過受損的屏障進入淋巴系統(tǒng)、血液、浸潤脂肪和肝臟組織，導(dǎo)致肝臟脂肪累積，進一步導(dǎo)致小鼠血脂代謝失衡（TC、LDL-C水平升高），從而產(chǎn)生胰島素抵抗。

圖8 小鼠腸道菌群與生化指標(biāo)的相關(guān)性分析Fig.8 Correlation analysis between intestinal flora and biochemical indexes

3 討 論

糖脂代謝異常導(dǎo)致機體產(chǎn)生胰島素抵抗，胰島素抵抗與肥胖、非酒精性脂肪肝病等代謝類疾病密切相關(guān)[22]。大量研究表明，EA能夠有效緩解高脂飲食引起的糖脂代謝紊亂[23]，還可以增加腸道菌群多樣性、刺激有益菌的生長并延緩致病菌株的生長、抑制炎癥因子的表達[12-13]，但是，在肥胖個體中EA的生物有效性和生物利用度較低，需要結(jié)腸細(xì)菌轉(zhuǎn)化后吸收。凝結(jié)芽孢桿菌能夠在結(jié)腸環(huán)境中存活[14]。因此，本研究利用益生菌緩解高脂引起的腸道菌群紊亂，探究了EA預(yù)防血脂代謝紊亂和胰島素抵抗的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，EA和BC2000聯(lián)合食用不會引起高脂飲食誘導(dǎo)小鼠的肥胖，可減少脂肪細(xì)胞肥大和肝臟脂肪變性，改善腸道菌群組成，顯著降低高脂飼喂小鼠血漿的TC、LDL-C濃度及IRI，顯著降低血漿黏膜屏障生物標(biāo)志LPS和Zonulin質(zhì)量濃度，以及慢性炎癥標(biāo)識TNF-α、hs-CRP和IL-6質(zhì)量濃度，且作用效果優(yōu)于單獨使用EA。

腸道屏障能夠維護腸道和機體健康，由黏液層、腸上皮細(xì)胞、腸道上皮細(xì)胞間緊密連接和黏附連接蛋白、免疫細(xì)胞和腸道菌群組成[24]。大量研究表明，高脂飲食會降低腸道上皮緊密連接蛋白的表達、削弱腸黏液層的完整性、增加致病菌的豐度及提高致炎細(xì)胞因子水平，進而破壞腸道屏障功能的完整性[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食導(dǎo)致黏膜屏障生物標(biāo)志LPS、Zonulin水平顯著升高，黏膜屏障受損，可能有以下原因：1）LPS直接刺激Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）-CD14促炎信號通路促進靶基因TNF-α、IL-6的表達；2）LPS通過TLR4-CD14介導(dǎo)的核因子（nuclear factor，NF）-κB激活直接調(diào)節(jié)緊密連接蛋白的表達[26]；3）LPS誘導(dǎo)小腸上皮細(xì)胞功能障礙[27]。添加BC2000和EA顯著抑制了炎性細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的表達，與增強黏膜屏障有關(guān)。此外IL-6、TNF-α與胰島素抵抗密切相關(guān)，可以通過降低胰島素受體底物（insulin receptor substrate，IRS）的磷酸化或抑制IRS轉(zhuǎn)錄來誘導(dǎo)肝臟和脂肪細(xì)胞的胰島素抵抗[28]。

腸道菌群與糖尿病、結(jié)腸炎及癌癥等疾病密切相關(guān)[29]。高脂飲食會引起腸道菌群紊亂[30]。在本研究中，補充EA和凝結(jié)芽孢桿菌BC2000可以重塑HFD小鼠的腸道菌群，使其接近正常狀態(tài)。在門水平上，補充EA和凝結(jié)芽孢桿菌BC2000提高了Actinobacteria（放線菌門）的相對豐度，降低了F/B比值，從而緩解F/B比值升高導(dǎo)致的能量吸收增加[31]。在屬水平上，HFD+EA+BC2000干預(yù)可以極顯著提高Lactobacillus（乳桿菌屬）的相對豐度，降低Desulfovibrio（脫硫弧菌屬）的相對豐度，HFD+EA+BC30干預(yù)可以降低Desulfovibrio（脫硫弧菌屬）的相對豐度。這與LEfSe分析結(jié)果一致。LEfSe分析結(jié)果表明，凝結(jié)芽孢桿菌BC2000可以促進有益菌的生長，如Lactobacillus（乳桿菌屬）、Bacillus（芽孢桿菌屬）和Pseudogracilibacillus（假纖細(xì)芽孢桿菌），并抑制了有害菌Desulfovibrio（脫硫弧菌）的生長。Bacillus（芽孢桿菌屬）、Pseudogracilibacillus（假纖細(xì)芽孢桿菌屬）相對豐度與IRI呈顯著負(fù)相關(guān)。芽孢桿菌具有調(diào)節(jié)微生態(tài)平衡，促進腸道健康等功能。乳桿菌具有預(yù)防慢性炎癥和胰島素抵抗惡化的潛能[32-33]，可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群來抑制高脂飲食引起的腸道黏膜通透性的增加，從而減少體內(nèi)循環(huán)的LPS和炎癥細(xì)胞因子（IL-6和TNF-α）水平，并最終緩解炎癥和胰島β細(xì)胞功能障礙[34-35]。

酚類化合物與益生菌之間存在互利的相互作用，益生菌和腸道菌群已經(jīng)被證明能夠改善酚類化合物的代謝和生物利用度，而酚類化合物可以通過提高益生菌的黏附性和存活率，抑制腸內(nèi)致病菌和刺激腸內(nèi)有益菌來調(diào)節(jié)腸道菌群[36]。研究表明，EA對肥胖者糖脂代謝的改善作用與其細(xì)菌代謝物尿石素類化合物有關(guān)[37]。EA在胃腸道中吸收較差，未被吸收的EA到達結(jié)腸，被腸道菌群代謝為尿石素[14]，尿石素A和尿石素B，可以降低高脂小鼠血糖濃度并增加葡萄糖耐量和胰島素敏感性，保護細(xì)胞免受炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激[38]。在本研究中，與僅補充EA喂食的高脂小鼠相比，添加凝結(jié)芽孢桿菌BC2000能夠顯著降低高脂飲食導(dǎo)致的IRI和TC濃度升高，而補充凝結(jié)芽孢桿菌BC30雖然也能降低高脂飲食導(dǎo)致的IRI和TC濃度升高，但沒有顯著性影響，這表明凝結(jié)芽孢桿菌BC2000和EA協(xié)同調(diào)節(jié)效果優(yōu)于單獨使用EA和聯(lián)合使用EA+BC30，所以推測凝結(jié)芽孢桿菌BC2000和腸道菌群的相互作用更好地促進了EA在腸道中轉(zhuǎn)化為細(xì)菌代謝產(chǎn)物尿石素，提高了EA的吸收效率和生物利用度，正反饋調(diào)節(jié)腸道菌群，提高凝結(jié)芽孢桿菌的存活率和黏附性，進而緩解機體炎癥。但凝結(jié)芽孢桿菌BC2000對EA代謝途徑的具體影響機制仍有待進一步研究。

綜上所述，凝結(jié)芽孢桿菌BC2000和EA聯(lián)合補充可以顯著降低高脂飲食小鼠的脂肪積累和血脂水平，改善肝組織脂肪性損傷，緩解低水平全身慢性炎癥，增強腸道黏膜屏障，調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂，促進與胰島素抵抗相關(guān)的有益菌生長，抑制有害菌的生長，從而有效緩解高脂飲食誘導(dǎo)所致胰島素抵抗，且效果優(yōu)于單獨補充EA，本實驗可為開發(fā)凝結(jié)芽孢桿菌BC2000和在富含EA食物中的補充應(yīng)用提供進一步的理論依據(jù)。