谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶對(duì)高水分豌豆蛋白擠出物結(jié)構(gòu)及消化特性的影響

劉 瀟，秦鑒新，李江華，周景文，陳 堅(jiān)*

（江南大學(xué)未來(lái)食品科學(xué)中心，江蘇 無(wú)錫 214122）

根據(jù)聯(lián)合國(guó)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，到2050年，世界人口將達(dá)到97億。人口的持續(xù)增長(zhǎng)導(dǎo)致居民飲食結(jié)構(gòu)與營(yíng)養(yǎng)來(lái)源發(fā)生變化，同時(shí)糧食安全的保障以及持續(xù)惡化的環(huán)境導(dǎo)致資源緊缺都是目前亟需解決的問(wèn)題[1-3]。因此，尋求傳統(tǒng)食用動(dòng)物蛋白以外的新型蛋白來(lái)源成為新的發(fā)展方向。植物基肉制品是指以植物蛋白為原料，經(jīng)一定加工工藝制成的具有與動(dòng)物蛋白類似的質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味、形態(tài)等品質(zhì)特征的食品。植物基肉制品的出現(xiàn)不僅緩解了資源環(huán)境壓力，同時(shí)也降低了飽和脂肪酸攝入，滿足了人們對(duì)營(yíng)養(yǎng)及口味的追求[4-5]。

豌豆蛋白是一種氨基酸含量相對(duì)均衡的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。由于豌豆蛋白沒(méi)有致敏性并且能夠在更溫和的氣候條件下生長(zhǎng)，因此豌豆蛋白正逐漸替代大豆蛋白作為植物基肉制品的原料[6]。目前，植物基肉制品的質(zhì)構(gòu)品質(zhì)與動(dòng)物肉制品的相似程度是影響其市場(chǎng)接受度的關(guān)鍵因素之一。因此如何改善植物基肉制品的質(zhì)構(gòu)口感成為當(dāng)前面臨的主要問(wèn)題之一[7]。在食品加工過(guò)程中，通過(guò)添加不同的成分，如蛋白質(zhì)、多糖和交聯(lián)劑，可以部分改善食品的質(zhì)地。作為交聯(lián)酶，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（transglutaminase，TG）通過(guò)催化蛋白質(zhì)中谷氨酰胺殘基的γ-羥胺基團(tuán)與伯胺化合物（?；荏w）之間發(fā)生?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，使蛋白質(zhì)發(fā)生共價(jià)交聯(lián)，通過(guò)胺的導(dǎo)入、交聯(lián)及脫胺3 種途徑改性蛋白質(zhì)，從而引起蛋白質(zhì)的多種功能特性（如凝膠性、熱穩(wěn)定性、乳化性、保水性、流變性等）發(fā)生變化，有助于改善食品的質(zhì)地口感[8]。

高水分?jǐn)D壓技術(shù)具有優(yōu)良的混合和喂料能力、較強(qiáng)的可控性和自潔性，是目前植物蛋白肉最常見(jiàn)的生產(chǎn)加工方式[9]。在擠出過(guò)程中，植物蛋白粉料在擠壓機(jī)中與水混合成均勻狀態(tài)，之后經(jīng)過(guò)蒸煮區(qū)，在高溫、高剪切的條件下形成熔融體?；旌衔镌跍囟冉档椭僚R界溫度以下時(shí)會(huì)發(fā)生相分離，緊接著在經(jīng)過(guò)細(xì)長(zhǎng)的冷卻套筒過(guò)程中使蛋白質(zhì)分子發(fā)生重排、互相交聯(lián)，最終形成高彈性、高韌性的纖維狀組織結(jié)構(gòu)，從而使其質(zhì)地更接近動(dòng)物肉組織結(jié)構(gòu)。目前已有研究報(bào)道TG改性可以改善植物蛋白肉制品產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)屬性[10]。

植物基肉制品中纖維和蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)受其加工技術(shù)的影響。近年來(lái)，大量研究證明食物的消化特性受其結(jié)構(gòu)的影響。因此，為了評(píng)估TG修飾以及擠壓對(duì)植物基肉制品質(zhì)構(gòu)特性的影響，有必要研究其蛋白質(zhì)消化率[11-12]。目前對(duì)于植物基肉制品蛋白質(zhì)消化率的研究很少。因此，本研究以豌豆蛋白為原料，探究高水分?jǐn)D出過(guò)程中不同比例TG對(duì)豌豆蛋白擠出物品質(zhì)的影響，并通過(guò)體外模擬消化，探究TG對(duì)豌豆蛋白擠出物的胃腸道消化率及氨基酸釋放的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豌豆分離蛋白（pea protein isolate，PPI）粉（蛋白質(zhì)干基相對(duì)含量為84.2%）由煙臺(tái)雙塔食品有限公司提供。

TG（120 U/g） 江蘇東圣生物科技有限公司；α-淀粉酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；膽汁鹽、氯化鈉、氯化鉀、碳酸氫鈉、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、硫酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、尿素、巰基乙醇、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、無(wú)水乙醇、三氯乙酸國(guó)藥控股化學(xué)試劑有限公司；除單獨(dú)說(shuō)明外，所有其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BCTM-30雙螺桿擠出機(jī) 瑞士布勒機(jī)械有限公司；K9860全自動(dòng)凱氏定氮儀 山東海能科學(xué)儀器有限公司；SU1510日立掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 日本Hitachi公司；TA.XT plus質(zhì)構(gòu)分析儀 英國(guó)SMS公司；Mastersizer 3000E激光粒度儀英國(guó)馬爾文帕納科有限公司；1100高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司；Synergy H1/Synergy2酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PPI粉-TG擠出物的制備

將PPI粉與TG混合均勻，TG添加量分別為0%、0.25%、0.50%、1.00%、1.50%和2.00%（以最終料水混合物的質(zhì)量計(jì)），之后以9 kg/h的恒定速率將混合物送入擠出機(jī)（干基）。在第二區(qū)以9 kg/h的速率輸送水，保持最終進(jìn)料水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%。擠壓機(jī)參數(shù)如下：螺桿轉(zhuǎn)速為230 r/min，機(jī)筒溫度從第一區(qū)到第八區(qū)分別為25、40、60、80、100、120、130、120 ℃。冷卻套筒溫度保持在90 ℃。待擠出穩(wěn)定后，收集樣品，待樣品冷卻至室溫后分裝，保存在-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 擠出物宏觀與微觀結(jié)構(gòu)觀察

將新鮮的擠出物進(jìn)行拍照觀察，分析擠出物宏觀結(jié)構(gòu)差異。將擠出物切片后冷凍干燥，最后將表面用金濺射涂層。用SEM在300 倍下觀察其表觀形態(tài)。

1.3.3 質(zhì)構(gòu)及組織化分析

將擠出物裁成10 mm×10 mm×10 mm的形狀，使用P/36R探頭測(cè)定組織化豌豆蛋白的硬度、彈性、內(nèi)聚性和咀嚼性。具體參數(shù)設(shè)置為測(cè)試前速率為1 mm/s、測(cè)試速率為1 mm/s、測(cè)試后速率為2 mm/s、下壓程度為50%，往復(fù)2 次，每組樣品重復(fù)測(cè)試10 次，去掉兩個(gè)最大值和兩個(gè)最小值取平均值。

取長(zhǎng)方體樣品（20 mm×20 mm×10 mm），使用A/CKB探頭對(duì)其進(jìn)行剪切測(cè)試，具體參數(shù)設(shè)置為測(cè)試前速率為1 mm/s、測(cè)試速率為1 mm/s、測(cè)試后速率為2 mm/s、剪切程度為75%，每組樣品重復(fù)測(cè)試10 次，去掉兩個(gè)最大值和兩個(gè)最小值取平均值。垂直剪切力與平行剪切力的比值被定義為組織化度。

1.3.4 蛋白質(zhì)溶解度測(cè)定

為了揭示擠出物結(jié)構(gòu)形成和維持過(guò)程中蛋白質(zhì)之間的相互作用，制備如表1所示的8 種蛋白提取溶劑，測(cè)定樣品的蛋白質(zhì)溶解度并計(jì)算化學(xué)鍵的變化。將樣品冷凍干燥后粉碎過(guò)60 目篩網(wǎng)。稱取0.25 g樣品于50 mL離心管中，分別加入如表1所示的8 種蛋白提取溶劑，攪拌浸提1 h后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，保留上清液。再分別加入上述8 種蛋白提取溶劑將沉淀重懸，重復(fù)浸提一次。用去離子水將獲得的上清液稀釋20 倍，混勻后向96 孔酶標(biāo)板中加入20 μL稀釋后的上清液。采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品在562 nm波長(zhǎng)處的吸光度，計(jì)算上清液中的可溶性蛋白質(zhì)量濃度，用凱氏定氮法測(cè)定樣品的總蛋白質(zhì)量濃度，計(jì)算如公式（1）所示，然后根據(jù)公式（2）計(jì)算蛋白質(zhì)溶解度。根據(jù)樣品在不同溶液中的溶解度進(jìn)行加減計(jì)算得到不同的化學(xué)鍵。

表1 蛋白浸提液及化學(xué)鍵計(jì)算方式Table 1 Protein extraction buffer solutions and calculation of corresponding chemical bonds

1.3.5 體外消化實(shí)驗(yàn)

對(duì)豌豆蛋白擠出物進(jìn)行體外消化實(shí)驗(yàn)。消化實(shí)驗(yàn)分3 個(gè)階段進(jìn)行。

口腔階段：將擠出物使用研磨機(jī)研磨15 s，取1.5 g樣品加6 mL去離子水放入25 mL燒杯中，使每組樣品中的蛋白質(zhì)含量保持不變。將7.5 mL含有α-淀粉酶的模擬唾液（simulated salivary fluid，SSF）添加到樣品中。最終口服混合物中淀粉酶的活力為75 U/mL。將燒杯密封并在37 ℃的水浴磁力攪拌鍋中以500 r/min攪拌2 min。

體外胃消化階段：將15 g經(jīng)上述口服階段的樣品與300 mL蒸餾水混合，并用6 mol/L HCl溶液將pH值調(diào)節(jié)至2.0。加入15 mL模擬胃液（5 g胃蛋白酶溶解于250 mL 0.1 mol/L HCl溶液中），將混合物在37 ℃水浴攪拌，分別在30、60、120 min時(shí)取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采樣后將樣品pH值調(diào)至7.0滅酶以終止胃消化。隨后在4 ℃、4 000 r/min離心15 min。將上清液與沉淀物分別在-80 ℃保存。

體外腸消化階段：取165 mL上述胃消化后的混合物，用1 mol/L NaHCO3將pH值調(diào)節(jié)至7.2，隨后加入37.5 mL的膽汁鹽和胰酶混合溶液（1.2 g膽汁鹽和0.2 g胰酶溶解于100 mL NaHCO3（0.1 mol/L））及37.5 mL NaCl/KCl混合溶液（質(zhì)量濃度7.02 g/L NaCl、質(zhì)量濃度0.37 g/L KCl），在37 ℃水浴攪拌，分別在15、30、60、120 min時(shí)取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采樣后將樣品沸水浴5 min滅酶以終止腸消化。隨后在4 ℃、4 000 r/min離心15 min。將上清液與沉淀物分別在-80 ℃保存。

1.3.6 消化物的粒度測(cè)定

使用Mastersizer 3000E激光粒度分析儀測(cè)定消化物的粒度，結(jié)果以D4,3表示。

1.3.7 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定

在還原條件下，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）測(cè)定初始和消化后的擠出物蛋白質(zhì)組成。對(duì)于未消化的樣品，將2.0 mg磨碎的樣品與0.5 mL樣品緩沖液（0.5 mol/L Tris、2.0% SDS、0.03% DTT、pH 6.8）混合。對(duì)于消化過(guò)的樣品，在沸水中煮5 min以使酶失活。使用1 mol/L NaOH溶液將胃食糜的pH值調(diào)節(jié)至7.0。然后，將樣品緩沖液和食糜以體積比1∶1混合，攪拌3 min。

1.3.8 蛋白質(zhì)消化率測(cè)定

將胃和腸反應(yīng)得到的消化液分別與3 倍體積的無(wú)水乙醇混合，并在4 ℃下反應(yīng)12 h，以去除未消化的蛋白質(zhì)和高分子質(zhì)量肽。然后將樣品在4 ℃下以10 000 r/min離心20 min，將沉淀物懸浮在5 mL蛋白質(zhì)提取緩沖液中以測(cè)定未消化的蛋白質(zhì)含量，將混合物在4 ℃下以4 000 r/min離心5 min，收集上清液，通過(guò)BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒對(duì)上清液中的可溶性蛋白含量進(jìn)行測(cè)定。蛋白質(zhì)消化率計(jì)算如公式（3）所示。

式中：m1為未消化蛋白質(zhì)量/g；m0為消化前樣品中蛋白質(zhì)量/g。

1.3.9 游離氨基酸質(zhì)量濃度分析

使用HPLC儀測(cè)定游離氨基酸質(zhì)量濃度。在分析之前，用質(zhì)量濃度0.1 g/mL三氯乙酸等體積稀釋樣品，靜置1 h。取1 mL樣液10 000 r/min離心30 min，然后將上清液通過(guò)0.22 μm過(guò)濾膜過(guò)濾用于HPLC分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用Origin 2018與SPSS 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和方差分析，用Duncan法進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 宏觀和微觀結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

對(duì)擠出物而言，其質(zhì)構(gòu)品質(zhì)與動(dòng)物肉制品的相似程度是評(píng)價(jià)其品質(zhì)的一個(gè)關(guān)鍵因素。而宏觀和微觀觀察是評(píng)價(jià)擠出物質(zhì)構(gòu)特性的直接手段[13-15]。選取新鮮的豌豆蛋白擠出物樣品，拍照觀察不同TG誘導(dǎo)對(duì)豌豆蛋白組織結(jié)構(gòu)的影響。由圖1可知，所有的豌豆蛋白擠出物都呈現(xiàn)出各向異性結(jié)構(gòu)。相較于添加TG的擠出物，未添加TG的擠出物纖維層次感較差，且形成的纖維較粗糙、易斷裂。而TG添加量為0.25%～1.00%的擠出物樣品組織纖維層次感強(qiáng)烈，且纖維較細(xì)密，并且TG添加量越大，擠出物的纖維結(jié)構(gòu)越好，呈現(xiàn)出正相關(guān)趨勢(shì)。這是由于TG的加入促進(jìn)了蛋白分子間交聯(lián)，使蛋白分子間形成了致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。當(dāng)TG添加量達(dá)到1.5%之后，樣品的各向異性減弱，組織纖維感變差，只能看到“V”型的組織化纖維趨勢(shì)，且纖維易斷裂，沒(méi)有形成細(xì)小的纖維結(jié)構(gòu)，原因可能是過(guò)量酶的加入對(duì)纖維的形成起到了抑制作用[10]。

圖1 不同添加量TG誘導(dǎo)豌豆蛋白擠出物樣品Fig.1 Pea protein extrudates with different TG concentrations

通過(guò)SEM觀察豌豆蛋白擠出物的形態(tài)。由圖2可知，擠出物的微觀結(jié)構(gòu)與樣品宏觀形態(tài)基本保持一致。添加TG的擠出樣品與未添加TG樣品（圖2A）的形態(tài)差別較大?？梢悦黠@看出未添加TG樣品的微觀結(jié)構(gòu)纖維感差，蛋白為塊狀聚集體，略有分層。而添加TG的擠出樣品則分層明顯，且有強(qiáng)烈的纖維感。當(dāng)擠出物的TG添加量為1.00%時(shí)（圖2D），其纖維結(jié)構(gòu)細(xì)密且纖維感最強(qiáng)烈，具有類似肉類纖維的層次感和形態(tài)。而隨著TG添加量的增加，擠出物的微觀形態(tài)又發(fā)生了變化，如圖2F所示，雖然有層狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，但纖維感較差，且蛋白多為塊狀聚集體，缺乏動(dòng)物肉類的纖維感。結(jié)合宏觀、微觀分析結(jié)果可知，TG的加入有利于豌豆蛋白擠出物纖維結(jié)構(gòu)的形成，但過(guò)量的TG會(huì)起到抑制作用。

圖2 不同添加量TG誘導(dǎo)豌豆蛋白擠出物的SEM觀察結(jié)果Fig.2 Microstructures of pea protein extrudates with different TG concentrations observed by SEM

2.2 擠出物質(zhì)構(gòu)分析

擠出物的質(zhì)構(gòu)特性是評(píng)價(jià)擠出物品質(zhì)優(yōu)劣的重要標(biāo)準(zhǔn)[16-18]。TG添加量對(duì)豌豆蛋白擠出物質(zhì)構(gòu)的影響如表2所示。交聯(lián)酶的添加在一定程度上會(huì)有利于擠出物各向異性結(jié)構(gòu)的形成[10,19]。在一定范圍內(nèi)（0～1%），增加TG添加量，豌豆蛋白擠出物的硬度和咀嚼度均顯著增大。當(dāng)TG添加量在0.25%以上時(shí)，樣品的硬度和咀嚼度顯著大于未添加TG的豌豆蛋白擠出物。當(dāng)TG添加量為1.00%時(shí)，硬度和咀嚼度最大，而彈性最小，約為0.79。但是隨著TG添加量的進(jìn)一步增加，擠出物的硬度和咀嚼度開始減小，原因可能是過(guò)量TG的加入由于其高濃度導(dǎo)致表面蛋白分子間快速且高度的交聯(lián)，形成了致密的蛋白交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而阻礙了TG與蛋白分子的進(jìn)一步交聯(lián)。總而言之，TG誘導(dǎo)豌豆蛋白交聯(lián)，增加了其硬度與咀嚼感，同時(shí)使彈性下降，進(jìn)一步改善了其凝膠特性。

表2 TG添加量對(duì)豌豆蛋白擠出物質(zhì)構(gòu)特性的影響Table 2 Effects of TG concentration on the texture of pea protein extrudates

豌豆蛋白擠出物的組織化度隨TG添加量的變化如表3所示。隨著TG添加量（0%～1.00%）的逐漸增大，樣品的平行切力、垂直切力以及組織化度與0% TG相比都有所提高，這是TG的交聯(lián)作用造成的[20-21]。當(dāng)TG添加量為1.00%時(shí)，樣品的組織化度最高，而TG添加量超過(guò)1.00%，組織化度等指標(biāo)又出現(xiàn)減小的趨勢(shì)。由此說(shuō)明，添加1.00% TG對(duì)豌豆蛋白的交聯(lián)效果最好，此時(shí)豌豆蛋白擠出物的組織化度最高。

表3 TG添加量對(duì)豌豆蛋白擠出物組織化度的影響Table 3 Effects of TG concentration on the texturization degree of pea protein extrudates

2.3 蛋白質(zhì)溶解度及分子間作用力分析結(jié)果

根據(jù)不同TG添加量誘導(dǎo)的豌豆蛋白擠出物在8 種浸提溶劑中的溶解度，計(jì)算得到擠出物化學(xué)鍵的變化，如表4所示。蛋白質(zhì)分子間的相互作用力有很多種，包括共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵及其交互作用[21]。與未添加TG的樣品組相比，添加TG的擠出物樣品氫鍵和二硫鍵數(shù)量有所減少，而氫鍵&二硫鍵交互作用以及疏水&二硫鍵交互作用有所增強(qiáng)?？傮w而言，隨著TG添加量的增大，擠出物樣品氫鍵和疏水相互作用的數(shù)量呈下降趨勢(shì)，而氫鍵&疏水&二硫鍵作用呈上升趨勢(shì)。而當(dāng)TG添加量為0.50%時(shí)，氫鍵&二硫鍵的交互作用以及氫鍵&疏水&二硫鍵作用最強(qiáng)。

表4 TG添加量對(duì)豌豆蛋白擠出物化學(xué)鍵的影響Table 4 Effects of TG concentration on chemical bonds of pea protein extrudates

有研究表明，二硫鍵在確定擠出物結(jié)構(gòu)的完整性和纖維形成方面起著關(guān)鍵作用[22]。而本研究中TG的誘導(dǎo)作用使得擠出物的二硫鍵數(shù)量隨TG的添加量增加先增加后減少，但其仍然是維持豌豆蛋白擠出物結(jié)構(gòu)的主要作用力，這與之前的研究結(jié)果[23]相似。與此同時(shí)，兩種及多種化學(xué)鍵之間的交互作用也增強(qiáng)。

2.4 體外消化過(guò)程擠出物的粒度分析

由于在腸消化階段擠出物的大部分纖維已被破壞，蛋白質(zhì)已水解成肽和氨基酸，導(dǎo)致粒度不能準(zhǔn)確檢測(cè)，這里僅分析在胃消化30、60 min和120 min時(shí)消化物的粒度。從圖3可知，在胃消化過(guò)程中，不同添加量TG誘導(dǎo)的豌豆蛋白擠出物的粒度存在明顯差異。在胃消化30 min時(shí)，未添加TG的樣品粒度最大，約為127 μm，與其他添加TG的擠出物存在顯著差異（P＜0.05）。這表明TG的加入促進(jìn)了擠出物纖維結(jié)構(gòu)的分解。經(jīng)胃消化60 min后，擠出物樣品的粒度呈現(xiàn)出減小的趨勢(shì)，表明大部分纖維結(jié)構(gòu)已被胃蛋白酶水解破壞[23]。當(dāng)胃消化過(guò)程結(jié)束時(shí)，TG添加量為1.00%的擠出物樣品粒度最小，即纖維結(jié)構(gòu)的分解率最高。上述結(jié)果表明，TG的加入對(duì)擠出物在胃消化過(guò)程中的分解速率有很大影響。添加適量TG（1.00%）擠出物的分解率更高。

圖3 在胃消化過(guò)程中不同添加量TG豌豆蛋白擠出物的粒度Fig.3 Particle size of pea protein extrudates with different TG concentrations during gastric digestion

2.5 體外消化過(guò)程擠出物的SDS-PAGE分析結(jié)果

使用SDS-PAGE驗(yàn)證不同TG誘導(dǎo)的豌豆蛋白擠出物和未添加TG的體外蛋白質(zhì)消化情況。如圖4所示，消化前，擠出樣品中在蛋白膠泳道上方條帶的強(qiáng)度高于未添加TG樣品，這可能是由于在擠出過(guò)程中形成了蛋白質(zhì)的聚集和交聯(lián)。在擠壓過(guò)程中，蛋白質(zhì)經(jīng)歷了大約4 種主要的構(gòu)象變化：分子鏈的展開、締合、聚集以及潛在降解或氧化的交聯(lián)[10]。在胃消化30 min后，可以明顯看到所有樣品的蛋白條帶灰度下降，這表明蛋白質(zhì)已被水解成肽和游離氨基酸，只有分子質(zhì)量在44 kDa左右的蛋白條帶仍然存在，研究表明該蛋白為11S球蛋白[24-25]。隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，胃蛋白酶將大分子蛋白質(zhì)（＞180 kDa）分解，導(dǎo)致部分蛋白條帶變清晰[24]。而大部分條帶沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明蛋白水解主要發(fā)生在胃消化早期。

圖4 胃消化過(guò)程中添加不同TG豌豆蛋白擠出物的SDS-PAGE圖譜Fig.4 SDS-PAGE profiles of pea protein extrudates with different TG concentrations during gastric digestion

結(jié)合上述擠出物蛋白質(zhì)分子間作用力的結(jié)果可以得出，擠壓過(guò)程導(dǎo)致擠出物二硫鍵數(shù)量增多，使擠出物樣品的大分子蛋白質(zhì)含量高于PPI樣品，并且TG的加入降低了二硫鍵的數(shù)量，造成了樣品更易被胃蛋白酶分解。以上結(jié)果表明，豌豆蛋白中隱藏的疏水基團(tuán)在TG的作用下暴露出來(lái)并與其他分子相互作用，而疏水基團(tuán)的展開導(dǎo)致更多的胃蛋白酶底物受體位點(diǎn)暴露。這種機(jī)制可能是造成TG誘導(dǎo)的豌豆蛋白擠出物更易分解的原因。

2.6 體外消化過(guò)程擠出物的消化率分析結(jié)果

蛋白質(zhì)的生物利用度通常通過(guò)消化率來(lái)評(píng)估[26-28]。TG對(duì)豌豆蛋白高水分?jǐn)D出物在模擬胃腸消化下消化率的影響如表5所示。在胃消化30 min時(shí)，豌豆蛋白擠出物的消化率已經(jīng)達(dá)到96%左右。這表明豌豆蛋白擠出物在胃中的消化速度更快，但在小腸中的消化速度較慢，這可能是由于絕大多數(shù)蛋白已在胃相中被消化，也有研究表明，豌豆蛋白的蛋白質(zhì)類型、結(jié)構(gòu)組織和膳食纖維更易被胃蛋白酶結(jié)合并分解[29-30]。在胃消化階段，擠出處理后豌豆蛋白的消化率低于未擠出的豌豆蛋白（PPI粉），這說(shuō)明在擠出過(guò)程中，熱機(jī)械作用使豌豆蛋白的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，更難被消化酶所分解。當(dāng)TG添加量為2.00%的豌豆蛋白擠出物消化率遠(yuǎn)低于其他樣品，這可能是過(guò)量的TG誘導(dǎo)導(dǎo)致形成的豌豆蛋白分子網(wǎng)絡(luò)交聯(lián)過(guò)于緊密，難以在短時(shí)間內(nèi)分解完全[10]。在腸消化階段，也有相似的趨勢(shì)。

表5 TG添加量對(duì)豌豆蛋白擠出物消化率的影響Table 5 Effects of TG concentration on the digestibility of pea protein extrudates

2.7 體外消化過(guò)程擠出物的游離氨基酸分析結(jié)果

蛋白質(zhì)只有在水解為單個(gè)氨基酸或短多肽后才會(huì)在腸道中吸收。因此，消化過(guò)程中產(chǎn)生的游離氨基酸量可用于反映蛋白質(zhì)的消化率和生物利用度[24,31]。高水分?jǐn)D壓和使用酶制劑處理會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性或者使蛋白發(fā)生分子間交聯(lián)，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集，影響消化酶的效果和氨基酸的釋放。

TG處理對(duì)豌豆蛋白擠出物在胃腸消化過(guò)程中游離氨基酸釋放的影響如表6、7所示。有研究表明，擠壓過(guò)程可能有利于美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，經(jīng)過(guò)擠壓處理的蛋白，其分子結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生很大的變化，會(huì)出現(xiàn)游離氨基酸含量降低，蛋白亞基發(fā)生聚集等現(xiàn)象[30]。在胃消化120 min時(shí)，擠出后的豌豆蛋白樣品釋放的游離氨基酸總量均小于PPI粉，這表明擠出過(guò)程緩解了豌豆蛋白游離氨基酸的釋放。而隨著TG添加量的增加，豌豆蛋白擠出物的總氨基酸釋放量呈現(xiàn)出先增加后減小的趨勢(shì)，當(dāng)TG添加量為1.00%時(shí)，擠出物樣品的游離氨基酸的總釋放量達(dá)到最大值，為707.62 mg/mL。這表明TG在一定的添加量范圍內(nèi)（0%～1.00%），能夠促進(jìn)游離氨基酸的釋放。樣品的消化率也呈現(xiàn)類似的變化趨勢(shì)。腸消化120 min后，未被擠壓的PPI粉的總游離氨基酸釋放量要高于豌豆蛋白擠出物。而在豌豆蛋白擠出物中，添加0.50% TG的樣品的游離氨基酸總釋放量最高。這與樣品的消化率呈現(xiàn)出相似的變化趨勢(shì)。同時(shí)這也表明擠壓可以增強(qiáng)蛋白樣品的耐消化程度，并且可以通過(guò)改變TG的添加量來(lái)調(diào)節(jié)游離氨基酸的釋放。

表6 體外胃消化120 min后樣品的游離氨基酸的釋放量Table 6 Release of free amino acids from pea protein extrudates after in vitro gastric digestion for 120 min mg/mL

表7 體外腸消化120 min后樣品的游離氨基酸的釋放量Table 7 Release of free amino acids from pea protein extrudates after in vitro intestinal digestion for 120 min mg/mL

3 結(jié) 論

本研究表明，相比于未添加TG樣品，適量添加TG的豌豆蛋白高水分?jǐn)D出物的組織化度有所升高。通過(guò)對(duì)不同添加量TG的豌豆蛋白擠出物進(jìn)行宏觀和微觀觀察，發(fā)現(xiàn)添加1.00% TG的樣品更具有類似肉類的纖維結(jié)構(gòu)，TG通過(guò)其交聯(lián)作用增強(qiáng)了擠出物的纖維特性。同時(shí)體外消化實(shí)驗(yàn)表明擠壓過(guò)程中的熱-機(jī)械處理使蛋白質(zhì)分子變性，從而導(dǎo)致其消化率降低。通過(guò)對(duì)不同添加量TG誘導(dǎo)的豌豆蛋白擠出物胃食糜進(jìn)行SDS-PAGE蛋白凝膠電泳和游離氨基酸分析，發(fā)現(xiàn)添加1.00% TG的樣品更易消化，且游離氨基酸釋放量較多，更易于人體吸收利用。該研究表明TG作為交聯(lián)劑在高水分?jǐn)D壓生產(chǎn)中有廣闊的應(yīng)用潛力，有利于開發(fā)出具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的肉類類似物。