FGF在脊髓發(fā)育中的作用機(jī)理研究進(jìn)展

黎 婷，劉寬輝，謝詩(shī)慧，劉少華

(1.蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院/蕪湖市生命健康工程技術(shù)研究中心，安徽蕪湖 241000；2.蕪湖市食源性病原微生物檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，安徽蕪湖 241000)

0 引言

脊髓是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的低端部位，主要與軀體感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)和自主神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)，脊髓發(fā)育過(guò)程還包括神經(jīng)嵴形成感覺(jué)神經(jīng)節(jié)，以及脊髓與靶器官如器官、肌肉之間的神經(jīng)支配，因此脊髓的發(fā)育在時(shí)空上與原始神經(jīng)組織尾部延伸以適應(yīng)全身發(fā)育是協(xié)調(diào)一致的.脊柱動(dòng)物脊髓細(xì)胞特異性起源于具有神經(jīng)和中胚層特征的神經(jīng)中胚層祖細(xì)胞(neuromesoderma progenitors，NMP)，雞和小鼠的脊髓細(xì)胞還起源于與之相鄰的外胚層及胚線，這些區(qū)域的細(xì)胞一部分形成脊髓，一部分形成歷經(jīng)原腸期形成軸旁中胚層[1].脊髓發(fā)育包括神經(jīng)形成開始、腹側(cè)發(fā)育、神經(jīng)嵴遷移都是受到原始神經(jīng)組織尾部延伸限制的，該復(fù)雜協(xié)調(diào)過(guò)程受到多個(gè)信號(hào)通路調(diào)控，尤其是FGF(Fibroblast Growth Factors，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)信號(hào)通路作為決定性調(diào)控因子[2].

FGF信號(hào)通路在胚胎發(fā)育的各個(gè)時(shí)期和組織中都發(fā)揮了調(diào)控作用，研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)增強(qiáng)或抑制NMP階段中FGFs及FGFR實(shí)驗(yàn)，F(xiàn)GF在胚胎發(fā)育早期作用于胚泡植入、原腸胚形成、神經(jīng)誘導(dǎo)等過(guò)程.該綜述主要闡述了FGF信號(hào)通路在脊髓發(fā)育中，包括神經(jīng)形成、腹側(cè)發(fā)育和神經(jīng)嵴遷移等這些具有高度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系的過(guò)程中如何進(jìn)行調(diào)控，以及FGF對(duì)成年動(dòng)物脊髓損傷的促脊髓細(xì)胞再生和脊髓修復(fù)作用，對(duì)體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞促分化和促發(fā)育作用，為再生醫(yī)學(xué)以及FGF的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)[2].

1 FGF信號(hào)通路在脊髓發(fā)育中的表達(dá)

如同大多數(shù)信號(hào)通路，F(xiàn)GF通路包括配體、受體、調(diào)控因子、胞內(nèi)換能器和效應(yīng)器，F(xiàn)GFs家族23種FGF就是配體，受體類型為酪氨酸激酶.FGF信號(hào)通路的抑制因子包括SPRY2(sprouty RTK signaling antagonist 2，快速發(fā)育生長(zhǎng)因子同源蛋白2)、SEF(similar expression to fgf genes)、DUSP6(Recombinant Dual Specificity Phosphatase 6，雙特異性磷酸酶6)和ETV(ets variant)家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在高FGF活性區(qū)域和尾部NMP區(qū)域mRNAs表達(dá)量極高，其表達(dá)量對(duì)自身表達(dá)為負(fù)反饋?zhàn)饔肹3].但是FGF信號(hào)通路中的靶細(xì)胞并不是僅僅被FGF激活，對(duì)FGF功能分析的難點(diǎn)之一在于鑒定FGF信號(hào)通路激活的細(xì)胞，因?yàn)榘麅?nèi)信號(hào)的級(jí)聯(lián)傳遞并不是FGF信號(hào)通路特異性.胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)傳遞調(diào)控FGF信號(hào)通路主要為三個(gè)：RAS-MAPK(膜受體酪氨酸蛋白激酶信號(hào)傳遞途徑)、PI3K-AKT(磷脂酰肌醇3-激酶信號(hào)傳遞途徑)和PLPCγ信號(hào).在NMPs與其周圍被FGF信號(hào)通路激活區(qū)域中MAPK(mitogen-activated protein kinase，絲裂原活化蛋白激酶)磷酸化水平極高，在這些區(qū)域抑制FGFR引起的效應(yīng)，與抑制MEK(Mitogen-activated protein kinase kinase, MAPKK，絲裂原活化白激酶激酶抑制/MAPK激酶抑制劑)引起的效應(yīng)幾乎一致，顯示MAPK是這些區(qū)域FGFR主要的下游通路，這種與FGFR的相關(guān)性在AKT信號(hào)通路并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)[4-5].

脊髓發(fā)育中FGF信號(hào)相關(guān)基因的綜合分析在雞和小鼠已經(jīng)完成.雞脊髓形成階段，F(xiàn)GF3、FGF4、FGF8、FGF13和FGF18在NMP尾部及相關(guān)區(qū)域表達(dá)量提高，后期(脊髓延伸和馬尾形成)階段，F(xiàn)GF3、FGF4、FGF13和FGF18只在胚線表達(dá)，而FGF8在中胚層入口處廣泛表達(dá).FGFR1-3最初在NMP區(qū)域表達(dá)，后期FGFR1在神經(jīng)組織，包括NMP區(qū)域廣泛表達(dá)，而FGFR2僅在神經(jīng)管表達(dá)，F(xiàn)GFR3僅在與神經(jīng)管相鄰的體節(jié)表達(dá).小鼠中FGF3、FGF4、FGF8、FGF17和FGFR1在NMP區(qū)域表達(dá)[6-9].

關(guān)于FGFs和FGFRs表達(dá)調(diào)控的研究比較少，目前研究較多的是FGF8，但是FGF8在脊髓NMP區(qū)域的轉(zhuǎn)錄及漸漸下調(diào)以滿足脊髓發(fā)育與胚胎發(fā)育協(xié)調(diào)是如何進(jìn)行調(diào)控的仍然未知.若干信號(hào)通路通過(guò)上調(diào)或下調(diào)影響FGF8的表達(dá)，在尾側(cè)WNT/β-Catenin信號(hào)通路上調(diào)FGF8的表達(dá)，Wnt3α(wingless-type MMTV integration site family member 3α，無(wú)翅型MMTV整合位點(diǎn)家族成員3α)下調(diào)FGF8的表達(dá)[10-12].

2 FGF與神經(jīng)中胚層尾部神經(jīng)祖細(xì)胞及脊髓發(fā)育一致性的建立

特異性通過(guò)FGF和WNT作用于胚線的上胚層細(xì)胞，尾側(cè)NMP區(qū)域發(fā)育成脊髓，這種特異性作用從原腸胚形成開始，胚線特異性表達(dá)基因NKX1.2、CDX1、CDX2、CDX4和HOXB8增加，MAPK信號(hào)水平上上調(diào)，與FGF調(diào)控基因表達(dá)有關(guān)[13].胚胎實(shí)驗(yàn)顯示，通過(guò)藥理抑制因子抑制FGFR阻斷FGF信號(hào)，雞胚NKX1.2和HOXB8表達(dá)下調(diào)；FGF4&FGF8雜合小鼠胚胎NMP區(qū)域WNT3α、WNT5α、CYP26α1和T-BRα表達(dá)下調(diào)；而FGFR1雜合小鼠胚胎NMP區(qū)域GBX2和CYP26α1表達(dá)下調(diào)，顯示FGF對(duì)NMP細(xì)胞關(guān)鍵基因和中胚層細(xì)胞的誘導(dǎo)因子(T-BRα)的表達(dá)具有重要的調(diào)控作用[11,14].NMP區(qū)域引起脊髓和中胚層細(xì)胞的發(fā)生，F(xiàn)GF水平作用于維持這三種類型細(xì)胞的平衡，如FGF4&FGF8雜合小鼠胚胎NMP區(qū)域中中胚層標(biāo)記基因TBX6極顯著下降；藥理學(xué)抑制FGFR導(dǎo)致神經(jīng)管特意基因SOX1顯著下降；而過(guò)表達(dá)FGF8導(dǎo)致NMP分化的失常[15-16].上述結(jié)果證實(shí)FGF對(duì)中胚層和神經(jīng)胚層發(fā)育的必要性，可通過(guò)增強(qiáng)NMP區(qū)域糖酵解代謝途徑中酶的表達(dá)引起WNT信號(hào)通路的上調(diào)，使NMP向神經(jīng)方向分化.

FGF可促進(jìn)神經(jīng)胚層和中胚層分化，F(xiàn)GF信號(hào)通路結(jié)合WNT信號(hào)通路通過(guò)特異性基因調(diào)控區(qū)域，激活并維持神經(jīng)基因SOX2和SOX3的表達(dá)，這種精確調(diào)控可使細(xì)胞維持在NMP狀態(tài)，或向中胚層分化，或向神經(jīng)分化，上述作用被體外小鼠和人干細(xì)胞FGF2和WNTs處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明[17].NMP中FGF對(duì)脊髓特異性同源轉(zhuǎn)錄因子HOXB8的表達(dá)是必須的，但是當(dāng)脊髓細(xì)胞離開NMP區(qū)域，脊髓發(fā)育中FGF不是必須的，由脊髓祖細(xì)胞分化發(fā)育伴隨脊髓延伸過(guò)程中FGF信號(hào)通路下調(diào)，而HOXB8高表達(dá)可見[18].FGF對(duì)NMP的特異性作用機(jī)制及對(duì)中胚層和神經(jīng)平衡的維持機(jī)制，與其它信號(hào)的協(xié)同作用相關(guān)，從而協(xié)調(diào)胚胎和脊髓發(fā)育的一致性.

3 FGFs與細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和神經(jīng)元分化的控制

FGFs對(duì)于細(xì)胞存活和增殖具有重要的作用，尤其是對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞.脊髓發(fā)育過(guò)程中，對(duì)細(xì)胞周期和有絲分裂標(biāo)記基因NeuroM分析得出兩個(gè)區(qū)域與細(xì)胞增殖有關(guān)，NeuroM+細(xì)胞在體節(jié)處開始表達(dá)，而受到FGF信號(hào)通路調(diào)控，尾側(cè)區(qū)域(前神經(jīng)管)與NMP區(qū)域都沒(méi)有NeuroM+細(xì)胞.神經(jīng)管使用FGF處理后會(huì)減少NeuroM+細(xì)胞的發(fā)生，同時(shí)也會(huì)削弱神經(jīng)發(fā)生的開始[5].

神經(jīng)祖細(xì)胞和干細(xì)胞增殖分化產(chǎn)生神經(jīng)元(N)和神經(jīng)祖細(xì)胞及干細(xì)胞(P)有三種模式：自身增殖(PP，產(chǎn)生2個(gè)祖細(xì)胞或干細(xì)胞)、自身取代(PN，產(chǎn)生1個(gè)祖細(xì)胞和1個(gè)神經(jīng)元)和自身消耗(NN，產(chǎn)生2個(gè)神經(jīng)元)，與不同細(xì)胞周期有關(guān).使用FGFs處理后，神經(jīng)祖細(xì)胞增殖只有一種PP模式，顯示FGF引起典型的PP短細(xì)胞周期，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)表明雞胚神經(jīng)板中細(xì)胞周期調(diào)控因子CYCLIND2激活需要FGF信號(hào)[17].盡管FGF處理會(huì)阻礙神經(jīng)發(fā)生，但是封閉FGF信號(hào)并不能驅(qū)動(dòng)有絲分裂和神經(jīng)發(fā)生標(biāo)記基因NeuroM的表達(dá).

FGF對(duì)于脊髓發(fā)育的控制與調(diào)控神經(jīng)發(fā)生的細(xì)胞增殖和神經(jīng)元分化有關(guān)，如在神經(jīng)發(fā)生起始前，F(xiàn)GF2和FGF8調(diào)控端腦PP分化模式對(duì)稱性增殖為神經(jīng)上皮細(xì)胞；在端腦開始神經(jīng)發(fā)生時(shí)，神經(jīng)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，受FGF10調(diào)控繼而增殖為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、有絲分裂后的神經(jīng)元或神經(jīng)祖細(xì)胞；FGF信號(hào)可以防止雞胚PAX6和IRX3與小鼠PAX6過(guò)早表達(dá)(PAX6和IRX3是促進(jìn)神經(jīng)元分化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子)[18].因此，F(xiàn)GF對(duì)于細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和神經(jīng)元分化是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，使得神經(jīng)發(fā)生前細(xì)胞處于增殖，而不是分化狀態(tài)，但是有許多機(jī)制仍待研究.

4 FGF與成年動(dòng)物脊髓神經(jīng)元干細(xì)胞

在胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中，少量神經(jīng)祖細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)經(jīng)過(guò)迅速擴(kuò)增、特化和分化，產(chǎn)生了幾百種神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的亞型.在成年動(dòng)物生理?xiàng)l件下，神經(jīng)系統(tǒng)保留了一定的潛能性，能產(chǎn)生數(shù)量有限的特化神經(jīng)細(xì)胞亞型[19].成年動(dòng)物脊髓中具有NSCs特性的是室管膜細(xì)胞，但室管膜細(xì)胞極少增殖，增殖的子代細(xì)胞使體內(nèi)的室管膜細(xì)胞維持一定的數(shù)量，而這種增殖機(jī)制尚未明了；端腦中具有NSCs特性的是海馬的部分結(jié)構(gòu)，如海馬齒狀回，特異性敲除成年動(dòng)物齒狀回中前體細(xì)胞表達(dá)的FGF受體(FGFR1、FGFR2和FGFR3)，實(shí)驗(yàn)顯示FGF對(duì)于NSCs的特性維持是必須的，前體細(xì)胞中FGFR受體的激活可以促進(jìn)神經(jīng)元的形成[20-21].

在正常生理?xiàng)l件下，室管膜細(xì)胞增殖數(shù)量極為有限，但是在脊髓損傷后，室管膜細(xì)胞增殖數(shù)量急劇增加，產(chǎn)生大量的星狀細(xì)胞和少量的少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，這種室管膜細(xì)胞增殖產(chǎn)生的星狀細(xì)胞對(duì)于脊髓損傷的修復(fù)極為重要，否則損傷部位變深，損失大量的神經(jīng)束[22].

多項(xiàng)研究證實(shí)了FGF2對(duì)嚙齒類脊髓損傷的促功能恢復(fù)作用，機(jī)制是FGF促進(jìn)脊髓神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，及神經(jīng)祖細(xì)胞表達(dá)PAX6、NESTIN和SOX2，從而促進(jìn)神經(jīng)元存活、血管發(fā)生，減少脊髓損傷的體積；同時(shí)減少星形膠質(zhì)細(xì)胞的形成和增生，增加軸突的再生；FGF2通過(guò)減少巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)(可能由于FGF2可促進(jìn)脊髓損傷后血-脊髓屏障的恢復(fù))和細(xì)胞因子水平，還能降低炎癥反應(yīng).脊髓損傷的臨床治療中，F(xiàn)GF1已經(jīng)用于頸部脊髓損傷的治療，F(xiàn)GF1和FGF2水凝膠支架具有顯著促進(jìn)再生功效[23-24].因此脊髓損傷的臨床治療采用的組合治療方法中，添加使用FGF是一種最有效的促進(jìn)脊髓結(jié)構(gòu)和功能修復(fù)的方式.

5 FGFs促進(jìn)體外神經(jīng)發(fā)生

哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)的自我修復(fù)能力有限，其中一種補(bǔ)充促修復(fù)治療方法是在損傷位點(diǎn)移植外源細(xì)胞.體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，添加FGF2可顯著促進(jìn)NSCs的增殖和自我更新；促使胚胎干細(xì)胞向轉(zhuǎn)化的細(xì)胞具有神經(jīng)元干細(xì)胞的特性，具有分化為神經(jīng)元、星形細(xì)胞和少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的潛能，雖然體內(nèi)并不存在這種具有神經(jīng)元干細(xì)胞特性的細(xì)胞；FGF2還用于神經(jīng)元亞型的特化，胚胎前腦體外培養(yǎng)添加FGF2后，可獲得具有脊椎運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元特性的膽堿能神經(jīng)元[25-26].添加FGF的移植實(shí)驗(yàn)由于促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂，但是不可忽視的是同時(shí)有致癌風(fēng)險(xiǎn)，研究顯示，為神經(jīng)誘導(dǎo)添加FGF2或BMP/TGF-β抑制劑培養(yǎng)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，可分化為多巴胺能神經(jīng)元，移植到偏癱大鼠的損傷部位，F(xiàn)GF2處理的細(xì)胞持續(xù)增殖，導(dǎo)致腫瘤樣生長(zhǎng)，與小鼠脊髓損傷移植后的結(jié)果相似[27-28].FGFs可促進(jìn)神經(jīng)元的產(chǎn)生、增殖和分化，因此在細(xì)胞移植治療中使用FGFs可產(chǎn)生重要作用，但是也有風(fēng)險(xiǎn).

6 結(jié)論

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)在細(xì)胞遷移和增殖中起著關(guān)鍵作用，通過(guò)RNA測(cè)序，qRT-PCR，蛋白質(zhì)印跡和ChIP測(cè)定，顯示出FGF9在所有FGF中表現(xiàn)出最高的表達(dá)，其過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)了小鼠腎細(xì)胞系C57BL/6中的增殖，并增加了JNK和AKT磷酸化水平[29]；此外，RNA-seq分析在FGF9過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中鑒定出365個(gè)上調(diào)基因和276個(gè)下調(diào)基因，這些差異表達(dá)的基因主要分為20個(gè)生物學(xué)途徑，并富集了31個(gè)基因[29]；qRT-PCR顯示，WNT和NF-κB信號(hào)基因的表達(dá)及ANXA4表達(dá)模式與RNA-seq數(shù)據(jù)相關(guān)，F(xiàn)GF9過(guò)表達(dá)的細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞相比，β-連環(huán)蛋白(一種關(guān)鍵的WNT信號(hào)蛋白)積累更多[29].

綜上所述，脊髓的胚胎發(fā)育過(guò)程被FGF信號(hào)通路調(diào)控，今后可通過(guò)建立敲除FGF基因動(dòng)物模型，研究分析FGF缺失對(duì)脊髓發(fā)育的影響，進(jìn)一步闡明FGF在早期神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)嵴發(fā)育和脊髓發(fā)育的明確作用.目前FGF信號(hào)通路作用的分子機(jī)制尚未明了，尤其是對(duì)信號(hào)通路下游的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，如對(duì)MAPK信號(hào)通路及FGFR相關(guān)信號(hào)通路(AKT、PKC等)的詳細(xì)調(diào)控過(guò)程，可能是FGF影響ETV家族轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化和調(diào)控染色質(zhì)修飾基因，如組蛋白脫乙?；?.利用單細(xì)胞測(cè)序解析等方法序解析胚胎脊髓發(fā)育過(guò)程，研究分析FGF對(duì)胚胎脊髓發(fā)育的調(diào)控作用，可能用于成年動(dòng)物脊髓和神經(jīng)損傷的修復(fù)，這對(duì)FGF用于神經(jīng)損傷的臨床治療展現(xiàn)了新的前景.