視網膜損傷：外泌體轉錄組學的研究進展△

張 妍 邵正波

遺傳、年齡、糖尿病、缺氧、高血壓等多種因素可造成視網膜損害，引起患者嚴重的視力下降甚至失明[1-2]。研究發(fā)現，外泌體可通過多種途徑調控視網膜損傷及修復，外泌體是一種大小為40～160 nm的細胞外囊泡，可由間充質干細胞、神經細胞、癌細胞等多種細胞分泌形成，廣泛分布于羊水、膽汁、母乳、唾液、尿液、淚液等體液中[3-4]。作為一種脂質雙分子層結構的囊泡，主要由細胞內多泡體與細胞膜融合后以囊性小泡的形式被釋放到細胞外形成[3]。外泌體是細胞間信息交流的重要載體，其中包含的DNA、RNA、蛋白質、脂類等多種生物活性物質均可被其遞送到靶組織，參與細胞的增殖、凋亡、遷移等生命活動[3，5-12]。作為納米級的生物膜結構，外泌體能較好地保護微小RNA(miRNA)、環(huán)狀RNA(circRNA)等轉錄產物的完整性和生物活性，該特征極大地提升了外泌體RNA作為疾病相關生物標志物的可行性[6]。隨著對外泌體研究的深入，外泌體中的轉錄產物，如miRNA、circRNA等在視網膜損傷相關疾病中具有生物學特性和靶向特異性，與疾病發(fā)生發(fā)展及轉歸機制密切相關[6]。

轉錄組學分析是一種應用廣泛的研究方法，通過分析特定生理和病理狀態(tài)下細胞或組織中所有RNA的表達情況，包括可翻譯成蛋白質的編碼RNA和參與轉錄調控的非編碼RNA，以篩選可能導致生理變化和疾病進展的關鍵分子[13]。轉錄組學研究常用的方法包括差異表達分析、聚類分析等，可用于評估不同條件下基因轉錄豐度的變化、識別共調控基因，從而了解疾病相關的生物機制或途徑[13]。因此，利用轉錄組學分析來研究外泌體中差異表達的RNA，對識別糖尿病視網膜病變(DR)、年齡相關性黃斑變性(AMD)、青光眼等疾病的分子生物標志物及治療靶點至關重要[3，9-10，14-16]。

1 外泌體轉錄組學與視網膜損傷

1.1 外泌體轉錄組學與視網膜色素上皮細胞視網膜色素上皮(RPE)細胞外泌體miRNA可以參與增生型視網膜病變、糖尿病性黃斑水腫(DME)等疾病的進展過程。Zhang等[17]利用比較轉錄組學從人視網膜上皮細胞系(ARPE-19)細胞以及上皮-間充質轉化(EMT)狀態(tài)ARPE-19(EMTed ARPE-19)細胞的外泌體中鑒定出了34種有顯著表達改變的miRNA，這些miRNA可以調控細胞或組織的EMT，其中miR-543在EMTed ARPE-19細胞源性外泌體中的表達量顯著增加，通過介導EMT級聯(lián)反應導致RPE細胞轉分化為肌成纖維細胞，參與增生型玻璃體視網膜病變增殖膜形成，最終導致疾病快速進展。Dong等[18]基于該研究發(fā)現，miR-4488和miR-1273g-5p過表達的外泌體可以通過靶向調節(jié)三磷酸腺苷結合盒轉運體A4(ABCA4)的表達，抑制轉化生長因子(TGF)-β2誘導的ARPE-19細胞EMT。上述研究表明，外泌體miRNA對EMT的調控機制尚不明確，仍需進一步研究。隨后，Li等[19]對人臍帶間充質干細胞來源的外泌體進行轉錄組學分析發(fā)現，有8種miRNA與細胞纖維化密切相關，表達量最高的miR-27b可以通過抑制同源盒蛋白Hox-C6(HOXC6)基因的表達，減少TGF-β2對RPE細胞EMT的誘導。Gu等[20]研究發(fā)現，ARPE-19細胞含有3種表達受高糖刺激影響的miRNA，由外泌體轉運的miR-202-5p通過調控TGF/Smad通路，抑制高糖誘導的EMT。在DME的研究中，Jiang等[21]提出，患者血清外泌體miRNA表達具有特異性，而且，外泌體攜帶的miR-377-3p可以直接下調血管內皮生長因子(VEGF)的表達，抑制RPE增殖，有效延緩疾病進展，且該基因的受試者工作特征曲線(ROC)分析顯示，其能夠對DME進行更加精確的診斷，該研究提示，miR-377-3p為該疾病提供了一個潛在的診斷標志物。由此可見，外泌體miRNA對疾病進展具有兩面性，其攜帶的特定miRNA不僅可以加重視網膜損傷，還可以通過抑制VEGF表達來延緩疾病進展。此外，RPE細胞外泌體miRNA還是視神經衰老過程中小膠質細胞激活的關鍵調節(jié)因子。Morris等[22]對RPE細胞外泌體進行了miRNA組學分析，共檢測到66個表達具有年齡依賴性的miRNA，其中高表達的miR-21可以上調小膠質細胞中p53信號通路下游基因的表達，從而調控衰老視網膜的慢性炎癥反應，這表明，外泌體miRNA具有免疫調節(jié)作用。

以上研究表明，外泌體miRNA可通過調控EMT、VEGF表達、炎癥反應等多種途徑參與RPE損傷相關疾病的進程，具有成為病程預測標志物的潛力，甚至可能用于基因治療。

1.2 外泌體轉錄組學與視網膜新生血管形成視網膜新生血管形成是DR、AMD等疾病的病理特征。Liu等[23]應用微陣列分析增生型DR(PDR)患者及黃斑裂孔患者的玻璃體源性外泌體，鑒定出82個在PDR樣本中特異性高表達的miRNA；對表達上調排名前5的miRNA進行驗證顯示，miR-9-3p通過靶向鞘氨醇-1-磷酸受體1(S1P1)/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(AKT)/VEGF受體2通路調控視網膜新生血管形成，有潛力成為PDR的治療靶點。與玻璃體源性外泌體相比，循環(huán)外泌體易于獲取，為外泌體miRNA的研究提供了新思路。在新生血管性AMD的研究中，Grassmann等[24]對患者血漿外泌體miRNA的分析結果顯示，hsa-miR-301a-3p，hsa-miR-361-5p和hsa-miR-424-5p可能通過TGF-β、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)等信號通路參與疾病的發(fā)生和發(fā)展；后續(xù)實驗表明，hsa-mir-361-5p表達下調可以促進新生血管形成，這為理解疾病機制和設計靶向治療方案提供了新的思路。隨后，Elbay等[25]在AMD患者血清外泌體中發(fā)現，miR-486-5p、miR-626和miR-885-5p也具有特異性，主要與細胞凋亡和血管生成有關，該研究補充了對AMD發(fā)病機制的認識，提示這些miRNA可以作為疾病診斷的分子標志物。

此外，外泌體還可以通過轉運特定circRNA促進血管生成。Zhang等[26]在DR患者視網膜樣本中鑒定出529種異常表達circRNA，其中Circ_0005015在患者的玻璃體、血漿、視網膜前纖維血管膜中均高表達，且可通過外泌體轉運來調節(jié)內皮細胞的增殖、遷移和血管形成，因此該circRNA具有作為DR診斷、治療及預后標志物的潛力。

除了視網膜新生血管形成，外泌體circRNA介導的內皮細胞-周細胞串擾異常也是DR發(fā)病機制之一[27]。Liu等[28]檢測并對比了具有瘦素受體缺陷的db/db小鼠與對照組小鼠視網膜circRNA的組成，鑒定出844個差異表達的circRNA；對隨機選擇的20種circRNA進行聚類分析及驗證顯示，這些非編碼RNA具有糖尿病樣本特異性，其中cPWWP2A通過外泌體轉運可以引起周細胞-內皮細胞串擾異常，導致視網膜血管功能障礙，是DR的潛在調節(jié)因子。Ye等[29]研究發(fā)現，低氧環(huán)境可以顯著影響周細胞外泌體circRNA的表達，其中circEhmt1表達上調最顯著，且該基因可使核因子I/A(NFIA)表達量增多，抑制NOD樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥小體形成，導致周細胞-內皮細胞串擾異常。這些研究從細胞層面闡明DR的發(fā)病機制，為疾病干預提供了新視角。

不同細胞來源的外泌體所含有的miRNA分子具有異質性，因此一部分外泌體特定miRNA可以促進新生血管形成，另一部分則對視網膜微血管生成具有抑制作用[3]。Gu等[30]研究發(fā)現，間充質干細胞來源外泌體攜帶的miR-192可以負向調控整合素亞基α1(ITGA1)，抑制高糖環(huán)境中的視網膜新生血管形成，延緩DR進展。外泌體特異性miRNA的抗血管生成作用為DR的靶向治療提供了新思路，但目前對抑制視網膜血管生成的外泌體RNA認識尚不全面，有待利用轉錄組學進一步探究。

作為疾病調控的新機制，外泌體功能性RNA的發(fā)現為DR、AMD等視網膜新生血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程提出了新的見解，為疾病的早期診斷和治療提供了指導。

1.3 外泌體轉錄組學與視網膜神經節(jié)細胞視網膜缺血-再灌注損傷(RIR)是青光眼的重要病理生理基礎，最終導致視網膜神經節(jié)細胞(RGCs)凋亡。RGCs損傷后不可再生，但越來越多的研究表明，外泌體可以通過調節(jié)炎癥反應發(fā)揮神經保護作用[31-32]。Yu等[33]在腫瘤壞死因子-α(TNF-α)刺激的牙齦間充質干細胞外泌體中鑒定了28種炎癥相關miRNA，其中miR-21-5p可以通過母源性印記基因3(MEG3)/miR-21-5p/程序性死亡因子4(PDCD4)信號軸減輕RIR引起的炎癥反應，抑制RGCs凋亡，為青光眼提供了無細胞治療策略。還有研究證實，外泌體中特定miRNA可以減少RGCs軸突缺失，使細胞功能障礙得到緩解，但外泌體在視神經保護過程中的轉錄組學特征尚不明確[34-35]。

1.4 外泌體轉錄組學與光感受器細胞光感受器細胞凋亡是視網膜退行性病變的重要病理特征，抑制該細胞凋亡是治療的關鍵[36]。Bian等[37]通過分析外泌體miRNA表達譜發(fā)現，miR-181、miR-26、miR-9和let-7家族豐度較高，其中有17個miRNA通過下調炎癥因子TNF-α、白細胞介素-1β(IL-1β)和環(huán)氧合酶-2(COX-2)，抑制炎癥信號通路，進而減少光感受器細胞凋亡。此外，Xu等[38]篩選出7個外泌體特異性miRNA；后續(xù)驗證結果顯示，表達量最高的miR-24-3P可通過調節(jié)肌醇依賴性激酶1α(IRE1α)-X-盒結合蛋白1(XBP1)信號通路，抑制缺氧誘導的光感受器細胞凋亡，這為早產兒視網膜病變的治療研究提供了新思路。上述結果均揭示了外泌體miRNA對光感受器細胞的保護性作用，但具體機制仍需后續(xù)研究驗證。

2 挑戰(zhàn)與展望

將轉錄組學分析應用于視網膜損傷的相關研究，深入了解外泌體在各種視網膜損傷疾病中的轉錄組學特征，不僅能篩選出DR、AMD、青光眼、早產兒視網膜病變等視網膜疾病診斷的新指標，還能找到潛在治療靶點。值得注意的是，通過轉錄組學分析篩選出的生物標志物還需通過實驗進一步驗證。目前，外泌體轉錄組學分析在視網膜相關疾病研究中的應用處于起步階段，主要用于差異表達基因的篩選。由于外泌體RNA與多種視網膜損傷相關疾病有著密切的關系，今后可以從鑒定靶基因功能、分析下游通路、構建基因互作網絡等方面進行研究，從分子層面揭示視網膜損傷的病理機制，為疾病治療找到新的靶點。