非編碼RNA調(diào)控小梁網(wǎng)組織在青光眼中作用的研究進(jìn)展△

魏 苗 花雯雯 程 驗(yàn) 張國(guó)偉 管懷進(jìn) 季 敏

小梁網(wǎng)是前房水引流的主要通道，由小梁網(wǎng)細(xì)胞(TMC)和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)組成。前房水通過(guò)房角小梁網(wǎng)從前房流出到相鄰的Schlemm管，再通過(guò)集液管進(jìn)入房水，然后進(jìn)入血液循環(huán)，這一途徑是房水引流的主要方式，小梁網(wǎng)結(jié)構(gòu)和功能障礙將導(dǎo)致房水引流通道受阻，房水在眼內(nèi)積聚，導(dǎo)致眼壓(IOP)升高，發(fā)生青光眼[1]。理解小梁網(wǎng)組織結(jié)構(gòu)和功能變化的作用及機(jī)制對(duì)于高IOP機(jī)制的闡明及新的降IOP治療方法的開發(fā)至關(guān)重要。

超過(guò)90%的哺乳動(dòng)物基因組被轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA(ncRNA)，在生物細(xì)胞增殖、凋亡等基本生命活動(dòng)和癌癥、心血管及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理學(xué)中均起重要作用，是生物過(guò)程強(qiáng)有力的多功能調(diào)節(jié)因子[2]。根據(jù)堿基長(zhǎng)度大小和結(jié)構(gòu)不同,ncRNA 可大致分為短鏈ncRNA、長(zhǎng)鏈ncRNA(lncRNA)和環(huán)狀RNA (circRNA)。短鏈ncRNA包括微小RNA(miRNA)等，是不參與蛋白質(zhì)編碼的RNA。其中miRNA是一種非常小的短鏈ncRNA，參與了包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、細(xì)胞代謝以及機(jī)體免疫在內(nèi)的幾乎所有生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)和控制[3]。lncRNA是長(zhǎng)于200個(gè)核苷酸的RNA轉(zhuǎn)錄本，主要參與染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過(guò)程[4]。circRNA是一類具有閉環(huán)結(jié)構(gòu)的ncRNA，呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不受RNA外切酶影響，表達(dá)更穩(wěn)定，不易降解[5]。

1 小梁網(wǎng)的生理特點(diǎn)

小梁網(wǎng)組織由原始中胚層和神經(jīng)外胚層共同發(fā)育而來(lái)[6]，橋接于鞏膜突和Schwalbe線的篩狀組織，在前房和Schlemm管之間充當(dāng)過(guò)濾器，收集房水并將其排出到眼外。根據(jù)解剖位置和功能不同，可將小梁網(wǎng)組織分為兩部分：前小梁網(wǎng)和后小梁網(wǎng)[7]。前小梁網(wǎng)又稱非濾過(guò)小梁網(wǎng)，是Schwalbe線和后小梁網(wǎng)狀體之間的過(guò)渡區(qū)，內(nèi)含TMC。目前對(duì)于前小梁網(wǎng)的作用知之甚少，還需進(jìn)一步研究。后小梁網(wǎng)又稱為濾過(guò)性小梁網(wǎng)，因?yàn)槠渑cSchlemm管相連，可發(fā)揮功能性濾過(guò)作用，引流房水。

小梁網(wǎng)組織中TMC是結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞特性的特殊細(xì)胞，可調(diào)節(jié)房水流出阻力[8]；ECM是存在于TMC之間的動(dòng)態(tài)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，由纖維蛋白、透明質(zhì)酸和蛋白多糖等物質(zhì)組成。TMC在靠近角鞏膜面作為內(nèi)皮細(xì)胞起作用，產(chǎn)生大量抗血栓形成的物質(zhì)，如硫酸肝素和組織纖溶酶原激活劑[9]。細(xì)胞的凋亡和增殖將導(dǎo)致TMC功能受損，誘發(fā)青光眼。在生理?xiàng)l件下，ECM的合成速率和分解速率維持平衡，這種平衡失調(diào)將導(dǎo)致小梁網(wǎng)組織中ECM沉積的增加，流出通道阻力增加，房水流出減少[6]。有研究指出，小梁網(wǎng)組織具有平滑肌樣功能,可主動(dòng)參與房水流出的調(diào)節(jié)[8]。因此，房水流出可能受到TMC生存率、小梁網(wǎng)收縮性能以及小梁網(wǎng)中ECM沉積的影響。

2 miRNA與小梁網(wǎng)

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展和人類基因組計(jì)劃的成功實(shí)施，有研究通過(guò)基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)，青光眼組患者與對(duì)照組的小梁網(wǎng)組織中miRNA表達(dá)有顯著差異[10]，并且部分miRNA已被證實(shí)，在青光眼病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，這些發(fā)現(xiàn)可能在青光眼的預(yù)防、治療以及術(shù)后并發(fā)癥的預(yù)防方面發(fā)揮作用[11]。

2.1 抑制TMC凋亡的miRNA

2.1.1 miR-144-3p研究顯示，原發(fā)性開角型青光眼(POAG)患者的小梁網(wǎng)鄰近區(qū)域和Schlemm管內(nèi)壁中有大量纖連蛋白1(FN-1)沉積，并且隨著疾病的加重而增加[12]。FN-1是miR-144-3p的直接作用靶點(diǎn)，miRNA-144-3p在POAG患者血清中低表達(dá)。Yin 等[13]在人HMC(HTMCs)氧化應(yīng)激模型中發(fā)現(xiàn)，miR-144-3p表達(dá)上調(diào)，HTMCs凋亡率降低，且研究進(jìn)一步表明，過(guò)表達(dá)miR-144-3p是通過(guò)靶向抑制FN-1在氧化應(yīng)激HTMCs中的表達(dá)來(lái)促進(jìn)HTMCs的增殖和侵襲的。miR-144-3p有望成為青光眼治療的潛在靶標(biāo)。

2.1.2 miR-17-5p有研究表明，Bcl-2家族是一類與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白，Bcl-2和Bcl-xL主要抑制細(xì)胞凋亡，而Bax主要促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，H2O2刺激后的HTMC抑制了miR-17-5p表達(dá)，而PTEN是miR-17-5p的靶基因；抑制miR-17-5p后，Bcl-2和Bcl-xL表達(dá)均下降，Bax表達(dá)增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡率顯著增加，而通過(guò)敲減PTEN可以消除這些作用[15]。這說(shuō)明，miR-17-5p可能通過(guò)靶向PTEN調(diào)控HTMCs凋亡，在青光眼的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

2.1.3 miR-181aWang 等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)H2O2處理后的HTMCs中miR-181a表達(dá)顯著降低，過(guò)表達(dá)miR-181a增強(qiáng)了HTMCs的生存能力，抑制HTMCs凋亡，而敲除miR-181a則降低了細(xì)胞生存率，可見miR-181a可以通過(guò)阻斷核因子κB(NF-κB)和JNK信號(hào)通路來(lái)提高H2O2處理后HTMCs的存活率。

2.1.4 miR-4295枸杞多糖(LBPs)對(duì)多種疾病均具有抗氧化、抗腫瘤活性、神經(jīng)保護(hù)和免疫調(diào)節(jié)等作用[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，在H2O2給藥后，LBPs顯著促進(jìn)了HTMCs的活力，抑制了細(xì)胞凋亡，降低了pro-/caspase-3/9和活性氧(ROS)水平，該研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，miR-4295表達(dá)在H2O2和LBPs處理的細(xì)胞中上調(diào)，LBPs通過(guò)上調(diào)H2O2損傷的HTMCs中的miR-429表達(dá)，激活了PI3K/AKT和ERK信號(hào)通路。這些數(shù)據(jù)表明，miR-4295上調(diào)能緩解H2O2誘導(dǎo)的HTMCs損傷，抑制HTMCs凋亡[18]。

2.1.5 miR-200c-3pShen等[19]利用TargetScan網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)，PTEN是miR-200c-3p的潛在靶標(biāo)，并且通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定實(shí)驗(yàn)證實(shí)；該研究發(fā)現(xiàn)，用 H2O2處理HTMCs后，miR-200c-3p表達(dá)下調(diào)，而PTEN表達(dá)上調(diào)；此外，過(guò)表達(dá)miR-200c-3p增強(qiáng)了細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，而PTEN逆轉(zhuǎn)了miR-200c-3p的作用，并且，miR-200c-3p抑制了PTEN和Bax表達(dá)，并改善了AKT和雷帕霉素(mTOR)的表達(dá)，而PTEN減弱了這些作用。這些結(jié)果表明，miR-200c-3p過(guò)表達(dá)靶向性負(fù)調(diào)控PTEN以抑制Bax表達(dá)并激活PTEN/AKT/mTOR信號(hào)通路，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡。

2.2 促進(jìn)TMC凋亡的miRNA

2.2.1 miR-204有研究顯示，在小梁網(wǎng)細(xì)胞系中，miR-204過(guò)表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞早期凋亡水平升高，而下調(diào)內(nèi)源性的miR-204，細(xì)胞凋亡減少[19]。還有研究發(fā)現(xiàn)，miR-204直接靶向的基因中有5個(gè)(LTBP2、FOXO1、OPA1、SPARC和WDR36)在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用[20]。miR-204對(duì)TMC凋亡的影響可能部分是通過(guò)上述影響細(xì)胞凋亡的靶基因介導(dǎo)的，具體還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

2.2.2 miR-29b-3p有研究發(fā)現(xiàn)，miR-29b-3p在青光眼大鼠模型和H2O2刺激的HTMCs中表達(dá)增加，miR-29b-3p表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞凋亡和ROS生成以及ECM產(chǎn)生，緩解了HTMC中H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷；生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，抗凋亡基因RNF138是miR-29b-3p的下游靶標(biāo)，敲減RNF138顯著逆轉(zhuǎn)了miR-29b-3p對(duì)HTMCs的氧化損傷[21]。這表明，靶向RNF138的 miR-29b-3p在青光眼中表達(dá)升高，并且促進(jìn)HTMCs凋亡。

2.2.3 miR-93有研究顯示，與白內(nèi)障患者相比，POAG患者房水和TMC中miR-93表達(dá)增加；而研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，核轉(zhuǎn)錄因子NFE2L2蛋白是miR-93的靶基因，抑制miR-93可以促進(jìn)TMC增殖，并抑制細(xì)胞凋亡；而通過(guò)敲減NFE2L2可以消除這些作用[22]。這表明，靶向NFE2L2的miR-93在青光眼中表達(dá)升高，并且促進(jìn)TMC凋亡。

2.3 調(diào)節(jié)小梁網(wǎng)組織收縮性的miRNA小梁網(wǎng)的收縮性也是房水循環(huán)過(guò)程中的重要功能。當(dāng)小梁網(wǎng)狀細(xì)胞松弛時(shí)，房水的過(guò)濾面積增加，進(jìn)入眼外循環(huán)，IOP降低。相反，TMC收縮可以彌合TMC之間的間隙，導(dǎo)致小梁網(wǎng)孔的通透性下降并影響房水的排出[23]。目前研究表明，miRNA與小梁網(wǎng)的收縮性密切相關(guān)，在青光眼發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[19]。

2.3.1 miR-200c有研究發(fā)現(xiàn)，miR-200c可以抑制與小梁網(wǎng)狀細(xì)胞收縮相關(guān)的基因表達(dá)，如ZEB1，ZEB2，F(xiàn)HOD1和RHOA，并發(fā)現(xiàn)，當(dāng)大鼠眼過(guò)表達(dá)miR-200c時(shí)，膠原蛋白的收縮受到抑制，TMC的牽引力降低；此外，在小鼠眼內(nèi)注射miR-200c后，IOP降低，這可能是改變小梁收縮性并控制IOP的新靶點(diǎn)[24]。

2.3.2 miR-143/145Li 等[25]發(fā)現(xiàn)，miR-143和miR-145在眼平滑肌和小梁網(wǎng)組織中表達(dá)豐富，小鼠中靶向缺失miR-143/145可導(dǎo)致IOP顯著降低，房水流出量增加了約2倍；在機(jī)制上，miR-143/145調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)和TMC的收縮性，促使miRNA通過(guò)改變平滑肌組織的結(jié)構(gòu)影響房水流出，為青光眼的藥物治療提供了新方法。

2.3.3 miR-450有研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，POAG患者的全身性轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)表達(dá)顯著升高，而TGF-β1通過(guò)抑制miR-450來(lái)發(fā)揮其功能[26]。此外，miR-450促進(jìn)了肌源性分化因子(MYOD)的表達(dá)，這是一種在肌肉分化中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，該蛋白存在于青光眼患者房水中，在控制成肌細(xì)胞分化中起作用[27]。因此，miR-450是通過(guò)靶向MYOD影響TMC的收縮張力，從而參與青光眼的發(fā)病機(jī)制，但還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.4 影響小梁網(wǎng)ECM的miRNAECM合成和降解平衡失調(diào)導(dǎo)致房水流出阻力增加，導(dǎo)致青光眼患者IOP升高?；啄ぶ蠩CM的質(zhì)量和數(shù)量變化似乎是青光眼房水流出阻力異常增加的致病因素[28]。鑒于ECM動(dòng)力學(xué)對(duì)房水流出途徑的重要性，調(diào)節(jié)ECM代謝的 miRNA 似乎是減少房水流出阻力的重要靶點(diǎn)。

2.4.1 miR-483-3p氧化應(yīng)激誘導(dǎo)HTMCs中ECM成分如纖維連接蛋白、層粘連蛋白及I型膠原的mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)。有研究證實(shí)，有氧化應(yīng)激下HTMCs中miR-483-3p表達(dá)水平降低，而過(guò)表達(dá)miR-483-3p后ECM合成減少，此外，miR-483-3p通過(guò)兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)靶向Smad4，導(dǎo)致Smad4表達(dá)降低，而敲除Smad4可降低ECM的水平[29]。這表明，miR-483-3p可通過(guò)下調(diào)Smad4抑制HTMCs中ECM的產(chǎn)生，因此，miR-483-3p可能是治療青光眼的潛在靶點(diǎn)。

2.4.2 miR-29miR-29家族已經(jīng)成為各種組織中ECM穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器。miR-29家族主要包括miR-29a、miR-29b和miR-29c，在HTMCs均有表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，在TGF-β2誘導(dǎo)的TMC中，miR-29a表達(dá)增加降低了ECM中I型膠原蛋白、IV型膠原蛋白和FN1的表達(dá)，這證明，miR-29a對(duì)ECM具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用；通過(guò)抑制miR-29b表達(dá)發(fā)現(xiàn)，多種ECM成分(包括膠原蛋白、LAMC1和FN-1)表達(dá)降低[30]，這說(shuō)明，抑制miR-29對(duì)改善ECM沉積有重要作用，雖然經(jīng)TGF-β2處理后，HTMCs中的miR-29c表達(dá)沒(méi)有顯著變化，但過(guò)表達(dá)miR-29c可顯著抑制ECM合成，這表明，miR-29c在調(diào)節(jié)TGF-β2介導(dǎo)的小梁網(wǎng)ECM產(chǎn)生中起著重要作用。

3 lncRNA與小梁網(wǎng)組織

有研究表明，lncRNA參與調(diào)控器官纖維化、眼部相關(guān)疾病等多種生理病理學(xué)過(guò)程。lncRNA在白內(nèi)障、角膜疾病的研究中已經(jīng)取得了突破性的進(jìn)展，例如，lncRNA MIAT可以用作年齡相關(guān)性白內(nèi)障(ARC)的特異性生物標(biāo)志物，與其他眼部疾病相比，ARC患者血漿和房水中l(wèi)ncRNA MIAT表達(dá)量均升高[31]。此外，降低lncRNA MIAT的表達(dá)可以緩解人晶狀體上皮細(xì)胞異常生長(zhǎng)和遷移引起的后囊混濁。目前，在評(píng)估HTMC的氧化應(yīng)激研究中，有70個(gè)lncRNA差異表達(dá)，其中24個(gè)lncRNA被鑒定為屬于lncRNA-miRNA-mRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)[32]。lncRNA上有大量的特異性miRNA結(jié)合位點(diǎn)，競(jìng)爭(zhēng)性地抑制miRNA的功能，從而間接調(diào)節(jié)miRNA下游靶基因的表達(dá)，這些分子家族之間的相互作用統(tǒng)稱為競(jìng)爭(zhēng)的內(nèi)源性RNA(ceRNA)網(wǎng)絡(luò)[33]。對(duì)這種lncRNA相關(guān)ceRNA網(wǎng)絡(luò)的研究可能有助于鑒定青光眼的病理生理學(xué)機(jī)制或治療青光眼的潛在治療靶點(diǎn)。

3.1 促進(jìn)TMC凋亡的lncRNA ANRIL有研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，lncRNA ANRIL在青光眼患者血清中低表達(dá)，并且與患者病情相關(guān)[34]。lncRNA ANRIL過(guò)表達(dá)可明顯抑制H2O2誘導(dǎo)的HTMCs凋亡和ROS生成增加。lncRNA ANRIL下調(diào)miR-7表達(dá)，而miR-7過(guò)表達(dá)則抵消了lncRNA ANRIL對(duì)H2O2處理的HTMCs作用。經(jīng)H2O2處理后的HTMCs中，lncRNA ANRIL通過(guò)下調(diào)miR-7，提高了mTOR和MEK/ERK通路中關(guān)鍵激酶的磷酸化水平，降低了HTMCs的氧化損傷，提高了存活率[35]。

3.2 影響小梁網(wǎng)ECM的lncRNA

3.2.1 lncRNA-RP11-820有研究發(fā)現(xiàn)，在HTMCs中l(wèi)ncRNA-RP11-820表達(dá)在氧化應(yīng)激條件下上調(diào)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-RP11-820直接與miR-3178結(jié)合，調(diào)控靶基因MYOD的表達(dá)。重要的是，MYOD可以與STAT3一起轉(zhuǎn)錄激活HTMCs中FN-1、層粘連蛋白和I型膠原蛋白的表達(dá)，并減少ECM增殖，從而構(gòu)建了lncRNA-RP11-820/miR-3178/MYOD/ECM軸參與POAG的發(fā)生[36]。

3.2.2 lncRNA GAS5lncRNA GAS5廣泛參與了細(xì)胞增殖、遷移，與ECM作用相關(guān)[21]。過(guò)表達(dá)lncRNA GAS5能有效緩解HTMCs的氧化損傷，減少ECM的表達(dá)；此外，lncRNA GAS5直接調(diào)控miR-29b-3p，而STAT3直接受miR-29b-3p調(diào)控。沉默miR-29b-3p緩解了STAT3的抑制，恢復(fù)細(xì)胞活力，減少ECM沉積，緩解青光眼的發(fā)展[21]。

3.2.3 lncRNA TGFβ2-AS1Lü等[37]研究通過(guò)H2O2誘導(dǎo)的HTMCs氧化應(yīng)激模型發(fā)現(xiàn)，敲除lncTGFB2-AS1降低了TGF-β2表達(dá)，而過(guò)表達(dá)lncTGFβ2-AS1明顯上調(diào)TGF-β2表達(dá)，并促進(jìn)了SMAD2/3磷酸化，上調(diào)ECM的基因表達(dá)，從而參與青光眼的發(fā)生。

4 circRNA與小梁網(wǎng)組織

circRNA是一類內(nèi)源性ncRNA，其特征在于共價(jià)閉合的連續(xù)環(huán)結(jié)構(gòu)，可調(diào)節(jié)真核細(xì)胞中的基因表達(dá)。circRNA在許多細(xì)胞活動(dòng)中起著重要作用，包括增殖、遷移和轉(zhuǎn)移[38]。circRNA根據(jù)其結(jié)構(gòu)差異可分為以下3類：外顯子circRNA、外顯子內(nèi)含子circRNA和內(nèi)含子circRNA，大多數(shù)外顯子circRNA存在于細(xì)胞質(zhì)中，而其他2種類型主要位于細(xì)胞核內(nèi)，并在眼中動(dòng)態(tài)表達(dá)[39]。Shen等[40]研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子直接靶向miR-646，以調(diào)節(jié)HTMCs在氧化應(yīng)激下的表皮生長(zhǎng)因子受體表達(dá)，并且表皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路可以轉(zhuǎn)錄激活ECM基因(纖維連接蛋白和I型膠原蛋白)，從而促進(jìn)ECM的產(chǎn)生。這種纖維化過(guò)程被認(rèn)為是POAG發(fā)生的主要原因之一。目前，缺乏更多關(guān)于circRNA在小梁網(wǎng)組織病理生理學(xué)中作用的研究。circRNA是通過(guò)抑制miRNA的表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用，從而在轉(zhuǎn)錄后水平上增加相關(guān)mRNA靶標(biāo)的翻譯和穩(wěn)定性。

5 小結(jié)

各種病理?xiàng)l件下，ncRNA在小梁網(wǎng)中發(fā)生不同程度的表達(dá)改變，影響小梁網(wǎng)的結(jié)構(gòu)和功能。目前，關(guān)于miRNA、lncRNA和circRNA在眼科相關(guān)研究中的應(yīng)用尚不成熟，應(yīng)引起更廣泛的關(guān)注。此外，隨著生物信息學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，還有更多已知的ncRNA需要深入研究，進(jìn)一步的研究可能會(huì)揭示這些分子在與青光眼發(fā)展相關(guān)功能中的具體作用。ncRNA作為調(diào)控分子具有巨大潛力，而其細(xì)胞類型和疾病特異性表達(dá)將有望成為青光眼潛在診斷標(biāo)志物或新的治療靶點(diǎn)。