坐骨神經(jīng)阻滯緩解新生兒手術(shù)切口致切口痛敏化的新機(jī)制

一、主要研究背景

坐骨神經(jīng)阻滯或可治療新生兒疼痛經(jīng)歷導(dǎo)致的再次損傷后疼痛反應(yīng)加劇，是一種可能的預(yù)防策略。在極早產(chǎn)兒，新生兒手術(shù)與更差的神經(jīng)發(fā)育結(jié)果、成年期軀體感覺功能改變相關(guān)。嚙齒類動(dòng)物研究表明，新生動(dòng)物后足切口改變了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能和結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致成年期再次損傷后切口痛惡化。新生兒損傷對疼痛通路的長期影響，提示了預(yù)防策略研究的必要性。新生兒期手術(shù)時(shí)進(jìn)行坐骨神經(jīng)阻滯，可防止新生兒期切口、未經(jīng)或經(jīng)再次切口的幼年或成年嚙齒動(dòng)物脊髓興奮性突觸傳遞增加，并緩解成年期下行抑制和整體痛覺抑制。然而，坐骨神經(jīng)阻滯對切口痛敏化的長期影響及其機(jī)制仍不清楚。

生命早期的不良生活事件會破壞小膠質(zhì)細(xì)胞的成熟，引發(fā)其表型變化，并改變其對后期免疫或環(huán)境挑戰(zhàn)的反應(yīng)性。特別是，大量研究表明，新生兒期疼痛經(jīng)歷導(dǎo)致脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的過度激活。注射小膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑或小膠質(zhì)細(xì)胞p38 絲裂原活化蛋白激酶 (p38) 抑制劑，可緩解新生兒切口引起的切口痛敏化。此外，坐骨神經(jīng)阻滯可防止成年動(dòng)物周圍神經(jīng)損傷后的小膠質(zhì)細(xì)胞激活及p38 磷酸化；相反，在未經(jīng)或經(jīng)新生兒期切口的成年動(dòng)物中，電刺激坐骨神經(jīng)，會誘導(dǎo)或加劇脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。然而，脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞激活的減少，是否參與坐骨神經(jīng)阻滯對切口痛敏化的長期作用尚不清楚。

研究者之前發(fā)表的文獻(xiàn)已經(jīng)證明，脊髓背角的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 (brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、含有SH2 結(jié)構(gòu)域的蛋白酪氨酸磷酸酶2(src homology region 2-containing protein tyrosine phosphatase 2, SHP2)，分別參與新生兒期切口導(dǎo)致的切口痛敏化。特別是，鞘內(nèi)注射小膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑，可緩解新生兒期切口導(dǎo)致的BDNF 增加。越來越多的證據(jù)表明，部分來源于小膠質(zhì)細(xì)胞的脊髓BDNF 在疼痛過程中具有重要作用。此外，在神經(jīng)病理性疼痛中，BDNF 上調(diào)SHP2。BDNF 增加α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸 (α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid receptor, AMPA)受體GluA1 亞單位的磷酸化和膜轉(zhuǎn)運(yùn)。在成年動(dòng)物，脊髓背角GluA1 是切口痛的基礎(chǔ)，并參與成年期經(jīng)歷引起的切口痛時(shí)程的延長。SHP2 的激活，上調(diào)了GluA1 的磷酸化和膜轉(zhuǎn)運(yùn)。這些發(fā)現(xiàn)提示，依賴于小膠質(zhì)細(xì)胞的脊髓BDNF，可能通過SHP2 調(diào)控含GluA1 亞基的AMPA 受體，進(jìn)而參與坐骨神經(jīng)阻滯對切口痛敏化的持續(xù)作用。

該研究探討了坐骨神經(jīng)阻滯對新生兒期切口致切口痛敏化的長期影響和機(jī)制。該研究的結(jié)果表明，坐骨神經(jīng)阻滯減少了脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞激活，下調(diào)了BDNF/SHP2/含有GluA1 亞基的AMPA 受體信號通路，從而對切口痛敏化發(fā)揮了有益作用。因此，臨床實(shí)踐中，新生兒手術(shù)時(shí)的坐骨神經(jīng)阻滯，可能是對術(shù)后痛敏化的一種預(yù)防策略。

二、主要研究結(jié)果

1. 新生兒期切口時(shí)坐骨神經(jīng)阻滯，可減輕新生兒期、成年期切口大鼠的痛敏和脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞激活。

為了研究坐骨神經(jīng)阻滯對切口痛敏化的長期影響，在新生兒期切口時(shí)（切口前15 min，之后2 h間隔/次×3 次），用局部麻醉劑左旋布比卡因進(jìn)行坐骨神經(jīng)阻滯。成年大鼠進(jìn)行了新生兒期和成年期2 次切口(nIN-IN)，以模擬生命早期損傷引起的切口痛敏化，對照組包括進(jìn)行新生兒期假手術(shù)成年期切口組 (nSham-IN)、成年期切口組 (IN)、成年期假手術(shù)組 (Sham)、新生兒期切口組 (nIN)、新生兒期假手術(shù)組 (nSham)、正常組。除坐骨神經(jīng)阻滯和新生兒期切口外，該研究中的所有操作均在成年期進(jìn)行。行為學(xué)結(jié)果顯示，坐骨神經(jīng)阻滯緩解了nIN-IN 大鼠機(jī)械縮足反射閾值 (mechanical withdrawal threshold, MWT)和熱縮足反射潛伏期 (thermal withdrawal latency, TWL)的降低。

離子鈣接頭蛋白1 (ionized calcium binding adaptor molecule-1, Iba1) 是小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物，其表達(dá)增加提示小膠質(zhì)細(xì)胞激活。免疫組化染色顯示，坐骨神經(jīng)阻滯抑制了nIN-IN 大鼠脊髓背角Iba1 陽性染色的增加、細(xì)胞形態(tài)的改變（肥大的胞體、較厚的縮短的突起）。另外，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) (enzymelinked immunosorbent assay, ELISA) 結(jié)果顯示，坐骨神經(jīng)阻滯緩解了促炎細(xì)胞因子白介素-1β、白介素-6、腫瘤壞死因子-α、單核細(xì)胞趨化蛋白-1 的上調(diào)。p38 磷酸化是小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性的功能標(biāo)記物，且在nIN-IN 大鼠僅表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞。Western blot結(jié)果顯示，坐骨神經(jīng)阻滯緩解了nIN-IN 大鼠脊髓背角p38 磷酸化的增加。以上結(jié)果表明，坐骨神經(jīng)阻滯可減輕nIN-IN 大鼠的痛敏和脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞激活。

2. 脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的化學(xué)激活或抑制，減弱或模擬坐骨神經(jīng)阻滯對nIN-IN 大鼠痛行為的影響。

為了進(jìn)一步探討脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞在坐骨神經(jīng)阻滯效應(yīng)中的作用，脊髓鞘內(nèi)注射表達(dá)CD68 啟動(dòng)子/增強(qiáng)子控制下人工設(shè)計(jì)受體 (hM3Dq 或hM4Di) 的重組腺相關(guān)病毒 (adeno-associated virus, AAV)、配體氯氮平-N-氧化物 (clozapine-N-oxide, CNO)，通過化學(xué)遺傳學(xué)工具、在體特異性激活或抑制脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞。首先，驗(yàn)證了化學(xué)遺傳工具對脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的激活作用。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，hM3Dq在脊髓背角表達(dá)，并與Iba1 共定位。給予CNO 后，增加了Iba1 陽性細(xì)胞數(shù)量，改變了細(xì)胞形態(tài)，升高了促炎細(xì)胞因子濃度，增加了p38 磷酸化。之后，進(jìn)行了行為學(xué)檢測，結(jié)果顯示激活脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞，降低了坐骨神經(jīng)阻滯在nIN-IN 大鼠中對MWT 和TWL 的影響。

相反，使用表達(dá)hM4Di 的重組AAV 抑制小膠質(zhì)細(xì)胞。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)顯示，hM4Di 表達(dá)于多數(shù)小膠質(zhì)細(xì)胞。給予CNO，降低了Iba1 陽性染色、形態(tài)改變、促炎細(xì)胞因子上調(diào)、p38 磷酸化。成年期切口后1～14 天，抑制脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞，緩解了MWT和TWL 的下降。抑制小膠質(zhì)細(xì)胞在nSham-IN 大鼠也于1～3 天減輕疼痛，但其在nIN-IN 大鼠具有更長的作用時(shí)間（14 天，3 天），這與之前的報(bào)道一致，即小膠質(zhì)細(xì)胞激活參與成年期切口痛，而新生兒期疼痛經(jīng)歷加劇了脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞在切口痛中的作用。這些結(jié)果表明，操縱脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞，可減弱或模擬坐骨神經(jīng)阻滯對痛敏反應(yīng)的有益影響。綜上所述，證明了脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞參與坐骨神經(jīng)阻滯對切口痛敏化的緩解作用。

3. 脊髓背角AMPA 受體GluA1 亞基參與新生兒期切口致切口痛敏化。

在成年期切口或假手術(shù)后1 天，盡管未觀察到總GluA1 表達(dá)的改變，nIN-IN 大鼠脊髓背角GluA1 絲氨酸845 位點(diǎn) (S845) 的磷酸化增強(qiáng)。此外，GluA1 的膜轉(zhuǎn)運(yùn)在IN 大鼠中增加，在nIN-IN大鼠中進(jìn)一步增加。而絲氨酸831 位點(diǎn) (S831) 的磷酸化在IN 大鼠中升高，在nIN-IN 大鼠中未見進(jìn)一步改變。在成年期切口或假手術(shù)后7 天，IN 大鼠中S831 磷酸化、膜轉(zhuǎn)運(yùn)，均已恢復(fù)。而nIN-IN 大鼠中S845 磷酸化、膜轉(zhuǎn)運(yùn)，仍處于上調(diào)狀態(tài)。上述結(jié)果提示，GluA1 S845 磷酸化、膜轉(zhuǎn)運(yùn)可能參與切口痛敏化。

IEM-1460 是 缺 乏GluA2 亞 基AMPA 受 體 的拮抗劑，鞘內(nèi)注射IEM-1460 挽救了nIN-IN 大鼠中MWT 和TWL 的降低。與nSham-IN 大鼠相比，IEM-1460 在nIN-IN 大鼠的有效時(shí)間更長。AMPA是AMPA 受體的激動(dòng)劑，與nSham 大鼠相比，nIN大鼠中AMPA 導(dǎo)致的痛閾降低的持續(xù)時(shí)間更長。上述結(jié)果證明，含有GluA1 亞基的AMPA 受體參與切口痛敏化。

4. 脊髓背角BDNF 通過SHP2 增加GluA1，進(jìn)而參與切口痛敏化。

鞘內(nèi)注射TrkB-Fc 清除內(nèi)源性BDNF，抑制了nIN-IN 大鼠成年期切口后1～7 天 SHP2 磷酸化的增加。同時(shí)，注射TrkB-Fc，可抑制GluA1 S845磷酸化和膜轉(zhuǎn)運(yùn)的上調(diào)。相反，在nIN 大鼠鞘內(nèi)給予外源性BDNF，可提高SHP2 磷酸化，并增強(qiáng)GluA1 磷酸化和膜轉(zhuǎn)運(yùn)。通過免疫熒光和ELISA 實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了重組慢病毒對SHP2 的敲減作用。nIN-IN大鼠中，敲減SHP2 改善了GluA1 磷酸化和膜轉(zhuǎn)運(yùn)的增加。相反，鞘內(nèi)注射重組慢病毒以過表達(dá)SHP2，增強(qiáng)了GluA1 的磷酸化和膜轉(zhuǎn)運(yùn)。之后，研究了BDNF 誘導(dǎo)的nIN 大鼠GluA1 上調(diào)，是否依賴于SHP2。nIN 大鼠敲減SHP2，減弱了注射BDNF 上調(diào)的GluA1，并緩解了痛閾降低。綜上所述，BDNF通過SHP2上調(diào)GluA1，進(jìn)而導(dǎo)致切口痛敏化。

5. 抑制脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞，緩解了nIN-IN 大鼠BDNF、SHP2 和GluA1 的上調(diào)。

在nIN-IN 大鼠抑制小膠質(zhì)細(xì)胞，緩解了BDNF表達(dá)、SHP2 磷酸化、GluA1 磷酸化和膜轉(zhuǎn)運(yùn)的上調(diào)；相反，nIN 大鼠中激活小膠質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致了BDNF、SHP2和GluA1的上調(diào)，及痛閾的降低。然后，使用Cx3cr1CreER/+：Bdnfflox/flox小鼠，檢測了小膠質(zhì)細(xì)胞BDNF 的作用。在該小鼠中，通過注射他莫昔芬，可選擇性地從小膠質(zhì)細(xì)胞中刪除BDNF。結(jié)果表明，與表型正常的小鼠相比，小膠質(zhì)細(xì)胞BDNF缺失小鼠中的BDNF、SHP2、GluA1 減少。這些結(jié)果表明，BDNF/SHP2/含有GluA1 的AMPA 受體通路在切口痛敏化過程中的作用，部分依賴于脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞。

6. 在nIN-IN 大鼠，坐骨神經(jīng)阻滯可使BDNF、SHP2 和GluA1 的表達(dá)正?；?/h3>

該研究的結(jié)果表明，坐骨神經(jīng)阻滯減弱了nIN-IN大鼠脊髓背角BDNF、SHP2 的上調(diào)。在時(shí)間軸上，坐骨神經(jīng)阻滯緩解了nIN-IN 大鼠成年切口后1～14天 BDNF 的上調(diào)。坐骨神經(jīng)阻滯還減弱了nIN-IN大鼠中1～7 天磷酸化SHP2、總SHP2 的表達(dá)增加以及二者的比值。此外，坐骨神經(jīng)阻滯緩解了新生兒期、成年期切口導(dǎo)致的GluA1 增加。這些結(jié)果表明，坐骨神經(jīng)阻滯抑制了nIN-IN 大鼠脊髓背角BDNF表達(dá)的增加、SHP2 磷酸化和表達(dá)的增加，以及GluA1 磷酸化和膜轉(zhuǎn)運(yùn)的增加。

7. 在nIN-IN 大鼠，給予BDNF、過表達(dá)SHP2或激活A(yù)MPA 受體，可下調(diào)坐骨神經(jīng)阻滯對下游分子、痛行為的影響。

nIN 大鼠鞘內(nèi)注射BDNF，下調(diào)了坐骨神經(jīng)阻滯對SHP2、GluA1、痛閾的作用。在進(jìn)行了坐骨神經(jīng)阻滯的nIN-IN 大鼠中過表達(dá)SHP2，增加了GluA1 的磷酸化和膜轉(zhuǎn)運(yùn)，降低了MWT 和TWL。此外，進(jìn)行了坐骨神經(jīng)阻滯的nIN-IN 大鼠鞘內(nèi)注射AMPA，可降低MWT 和TWL。上述結(jié)果提示，坐骨神經(jīng)阻滯通過抑制BDNF/SHP2/含GluA1 亞基的AMPA 受體信號通路，對切口痛敏化發(fā)揮有益作用。

8. 在nIN-IN 大鼠，激活小膠質(zhì)細(xì)胞抑制了坐骨神經(jīng)阻滯對三分子上調(diào)的緩解作用。

成年期切口后7 天，激活脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞，抑制了坐骨神經(jīng)阻滯對nIN-IN 大鼠背角BDNF、SHP2 的影響。在時(shí)間軸上，成年期切口后1～14天，小膠質(zhì)細(xì)胞激活降低了坐骨神經(jīng)阻滯對BDNF增加的緩解作用。小膠質(zhì)細(xì)胞激活，抑制了坐骨神經(jīng)阻滯對成年切口后1～7 天 SHP2 磷酸化增加的影響。此外，小膠質(zhì)細(xì)胞激活，減弱了坐骨神經(jīng)阻滯對nIN-IN 大鼠中GluA1 增加的影響。這些結(jié)果表明，脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞激活，減弱了坐骨神經(jīng)阻滯對BDNF、SHP2 和GluA1 上調(diào)的緩解作用。

綜上所述，該研究證明，脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞激活的減少、參與坐骨神經(jīng)阻滯對新生兒期切口致切口痛敏化的長期作用。此外，脊髓背角BDNF 部分依賴于小膠質(zhì)細(xì)胞，增加SHP2 的磷酸化，上調(diào)AMPA受體GluA1 亞基的磷酸化和膜轉(zhuǎn)運(yùn)，從而惡化切口痛。相反，坐骨神經(jīng)阻滯下調(diào)BDNF/SHP2/含有GluA1 亞基的AMPA 受體信號通路，進(jìn)而對切口痛敏化產(chǎn)生持續(xù)的有益影響。因此，臨床實(shí)踐中，新生兒手術(shù)期間坐骨神經(jīng)阻滯，是術(shù)后疼痛敏化的一種可能的預(yù)防策略。