丁郁柿蒂湯對肝郁脾虛延遲性CINV大鼠SP和NK-1受體表達的影響*

韓 琦，李洪海 ，李 萍 ，安 冬 ，李 璐， 梁永林

(甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000)

延遲性化療后嘔吐( delayed chemotherapy-induced nausea and vomiting，CINV)指在化療24小時后發(fā)生的惡心嘔吐，可持續(xù)病發(fā)數(shù)天，是化療藥物帶來的主要副作用之一。研究[1]表明，CINV的發(fā)生幾率為70%～80%，是臨床面臨的高發(fā)難題。臨床對延遲性CINV的控制最為不足。西醫(yī)學研究表明,P物質(substance P，SP)是延遲性CINV的關鍵性神經遞質[2]，與神經激肽-1 受體(natural killer cell-1 receptor，NK-1)受體一同在延遲性CINV中起主導作用。丁香與郁金雖是相畏藥物，但二者同用于難治性、頑固性嘔吐的治療，可收到良好療效[3]。丁郁柿蒂湯即丁香柿蒂湯加郁金和甘草。本實驗研究了丁郁柿蒂湯對延遲性CINV作用，并通過檢測其對延遲性CINV模型大鼠SP及NK-1受體、PPTA表達的影響，探討其干預延遲性CINV的分子機制。

1 材料與方法

1.1 動 物

SPF級Wistar雄性大鼠48只，體質量(200±20)g，購自中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，SPF級動物質量合格證號：SCXK(甘)2015-0001。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學動物實驗室，溫度為(21±4)℃，濕度為50%±5%，自然光照，自由進食、飲水。

1.2 藥品、試劑與儀器

丁香、柿蒂、甘草、生姜、郁金、黨參緩釋顆粒劑，均購自甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院。注射用順鉑，齊魯制藥有限公司所產品，批號6M023A89。阿瑞匹坦膠囊，Merck Sharp&Dohme Ltd.產品，批號M046386。ELISA試劑盒，購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號2017-04-04；GoScriptTMReverse Transcription System(批號0000185600)、GoTaq?qPCR Master Mix(批號0000250185)，均為美國Promega公司產品；TRIzol?Reagent，美國Ambion公司產品，批號113405；PPTA、NK-1引物，由上海生工生物工程公司設計、提供。EX423ZH-E型電子分析天平，奧豪斯儀器有限公司產品；3K15型通用臺式高速離心機，德國Sigma公司產品；DM-86L626型立式超低溫冰箱，海爾公司產品；BioradiMark酶標儀，美國BIO-RAD公司產品；TU-100C型恒溫金屬浴，上海一恒科技有限公司產品；反轉錄儀，美國BIO-RAD公司產品；QuantStudio?5 Real-Time熒光定量PCR儀，美國Thermo Fisher Scientiflic公司產品；TMC1206210型掌上離心機，生工生物工程(上海)股份有限公司產品 。

1.3 模型的建立與分組

本研究采用慢性束縛法 21 d 復制肝郁大鼠模型[4]，采用腹腔注射順鉑注射液復制延遲性 CINV 模型[5]。將48只大鼠于實驗前先置于實驗室適應性飼養(yǎng) 7 d,然后進行造模。除正常對照組外,其余大鼠均采用慢性束縛法復制肝郁型大鼠模型。肝郁造模完成后，去除體質量不合格的大鼠，采用完全隨機分組法將實驗大鼠分為模型對照組、阿瑞匹坦組、丁香柿蒂湯組、郁金組、丁郁柿蒂湯組5組，每組6只。給大鼠投以高嶺土適應性飼養(yǎng) 3 d 后，腹腔注射順鉑6 μg/g 復制延遲性CINV大鼠模型，于造模前1 h分別灌胃治療,并于第1次灌胃后每12 h 灌胃1次。丁香柿蒂湯組、郁金組、丁郁柿蒂湯組依次灌胃相應藥物，劑量分別為7.3，4.9，12.2 g/(kg·d)；阿瑞匹坦組第1天灌胃劑量為0.011 4 g/(kg·d)，第2，3天給藥劑量為0.007 0 g/(kg·d)。

1.4 檢測指標

實驗過程中觀察各組大鼠的一般情況。延遲性CINV造模后每12小時稱量1次高嶺土的食用量。在延遲性CINV造模72 h后取材。取下腔靜脈血、回腸和延髓組織，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測P物質含量，采用實時熒光定量PCR法檢測組織PPTA 和 NK1 受體 mRNA表達。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 各組大鼠的一般情況對比

正常對照組大鼠皮毛順澤，體質量逐漸上升，精神、睡眠狀態(tài)正常，飲食量正常，大便干稀適中、成形，未見糞質變硬或稀便，反應靈敏。其余大鼠在肝郁造模后，前5天行為亢奮，解開束縛后活動活躍，四處跑動，著急尋食，抓取反應激烈；從第6天開始，大鼠蜷臥安靜，好扎堆，解開束縛后活動遲緩，尋食減少，對聲響等外界刺激反應遲緩，抓取后弓背對峙，食量減少，飲水增多，較正常對照組飲食量變化明顯，體質量減輕，大便減少，便干，毛發(fā)粗糙、缺乏光澤；從第 14天開始，大鼠出現(xiàn)目色暗紅、缺乏光澤，掉毛現(xiàn)象。在延遲性CINV造模 72 h 后，模型對照組大鼠除有以上肝郁的表現(xiàn)外，還出現(xiàn)體質量下降、食量減少、飲水量減少、扎堆蜷臥少動、活動遲緩、大便不成形。大鼠經過 3 d 灌胃給藥后，丁香柿蒂湯組飲食量略增多，大便狀況改善；郁金組大鼠目色由暗紅轉為正常紅色，仍安靜蜷臥，飲食減少，大便稀溏；丁郁柿蒂湯組大鼠目色由暗紅轉為正常紅色，精神狀況略好轉，食量增加，反應較前靈敏，大便良好、成形而不干。結果表明:肝郁脾虛大鼠模型建立成功。丁郁柿蒂湯對大鼠的治療效果良好，而郁金組大鼠出現(xiàn)了脾虛泄瀉癥狀。

2.2 各組大鼠高嶺土攝食量對比

高嶺土適應期第3天(-24-0 h。以延遲性CINV造模開始時間記為0 h，負數(shù)表示造模前)，與正常對照組對比，模型對照組和各藥物組大鼠高嶺土攝食量均增加，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。腹腔注射順鉑注射液(即延遲性CINV造模)后0-72 h，與正常對照組對比，模型對照組大鼠高嶺土攝食量升高，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，說明成功復制延遲性CINV模型。腹腔注射順鉑注射液后0-24 h，與模型對照組對比，丁香柿蒂湯組、丁郁柿蒂湯組高嶺土攝食量均降低(P<0.01)，阿瑞匹坦組高嶺土攝食量在12-24 h增高，郁金組不具有統(tǒng)計學差別。24-36 h，與模型對照組對比，阿瑞匹坦組大鼠高嶺土攝食量降低最為顯著(P<0.01)，郁金組大鼠高嶺土攝食量明顯增高(P<0.05)。36-48 h，郁金組大鼠高嶺土攝食量明顯降低，與模型對照組對比，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。48-72 h，與模型對照組對比，各給藥組高嶺土攝食量均降低，其中丁郁柿蒂湯組高嶺土攝食量降低尤為顯著(P<0.01)。以上結果表明：郁金組大鼠高嶺土食用量先顯著增高后迅速降低。阿瑞匹坦在24 h后發(fā)揮顯著療效，保持較為平穩(wěn)狀態(tài)。丁郁柿蒂湯干預延遲性CINV大鼠具有良好療效，最終的治療效果優(yōu)于阿瑞匹坦。見表1。

組 別-24-0 h0-12 h12-24 h24-36 h正常對照組1.011±0.080##1.171±0.371##0.855±.0058##0.368±0.054##模型對照組1.251±0.070**3.131±0.072**2.596±0.082**2.058±0.366**阿瑞匹坦組1.303±0.071**2.760±0.063**##3.206±0.070**##0.751±0.037**##丁香柿蒂湯組1.246±0.071**2.511±0.108**##1.246±0.062**##1.500±0.357**郁金組1.258±0.049**2.970±0.082**2.413±0.776*2.846±0.190**#丁郁柿蒂湯組1.303±0.071**1.861±0.083*##1.243±0.069**##1.251±0.160**#

組 別36-48 h48-60 h60-72 h0-72 h正常對照組0.345±0.079##0.130±0.050##0.124±0.010##0.500±0.744##模型對照組1.258±0.163**1.151±0.089**1.135±0.066**1.888±0.658**阿瑞匹坦組0.623±0.037**##0.748±0.057**##0.751±0.033**##1.474±0.733**##丁香柿蒂湯組0.748±0.034**##0.745±0.068**##0.498±0.057**##1.206±0.767**##郁金組0.623±0.008**##0.622±0.041**##0.750±0.057**##1.665±0.524**##丁郁柿蒂湯組0.713±0.077**##0.617±0.020**##0.374±0.009**##1.010±0.959**##

注：與正常對照組對比，*P<0.05，**P<0.01；與模型對照組對比，#P<0.05，##P<0.01

2.3 各組大鼠血清、回腸、延髓SP表達對比

與正常對照組對比，模型對照組大鼠血清、回腸、延髓中SP表達均升高，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型對照組對比，阿瑞匹坦組、丁香柿蒂湯組、丁郁柿蒂湯組大鼠血清、回腸、延髓中SP均降低(P<0.05或P<0.01)，其中丁郁柿蒂湯組SP的降低最為顯著。郁金組大鼠的SP在血清、回腸中表達量較高，與正常對照組對比差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，與模型對照組對比差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；在延髓中表達量減少，與模型對照組對比，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清、回腸、延髓SP表達對比

組 別血清回腸延髓SP正常對照組0.100±0.007##1.471±0.166##0.787±0.064##模型對照組0.203±0.009**2.496±0.213**1.799±0.217**阿瑞匹坦組0.157±0.004**##1.676±0.113##1.276±0.037**#丁香柿蒂湯組0.172±0.012**#2.018±0.191**##1.344±0.077**#郁金組0.203±0.003**2.248±0.185**1.302±0.025 **#丁郁柿蒂湯組0.152±0.003**##1.630±0.142##1.058±0.055 **##

注：與正常對照組對比，**P<0.01；與模型對照組對比，#P<0.05，##P<0.01

2.4 各組大鼠回腸、延髓PPTA mRNA表達對比

與正常對照組對比，模型對照組大鼠回腸、延髓PPTA mRNA表達明顯升高，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型對照組對比，阿瑞匹坦組、丁香柿蒂湯組、丁郁柿蒂湯組大鼠回腸、延髓中PPTA mRNA表達均降低(P<0.05或P<0.01)，其中丁郁柿蒂湯組降低最為顯著(P<0.01)。郁金組大鼠回腸PPTA mRNA表達與模型對照組相近，差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；延髓PPTA mRNA表達降低，與阿瑞匹坦組、丁香柿蒂湯組相近，與模型對照組對比，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表3。

組 別回腸延髓正常對照組1.000±0.000##1.000±0.000##模型對照組2.450±0.073**2.164±0.114**阿瑞匹坦組2.078±0.090**#1.525±0.094**##丁香柿蒂湯組0.988±0.172##1.459±0.047**##郁金組2.452±0.110**1.464±0.089**##丁郁柿蒂湯組0.626±0.147*##1.146±0.076##

注：與正常對照組對比，*P<0.05，**P<0.01；與模型對照組對比，#P<0.05，##P<0.01

2.5 各組大鼠回腸、延髓NK-1受體 mRNA表達對比

與正常對照組對比，模型對照組大鼠回腸、延髓NK-1受體 mRNA表達明顯升高，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型對照組對比，阿瑞匹坦組、丁香柿蒂湯組、丁郁柿蒂湯組NK-1受體 mRNA表達均降低(P<0.05或P<0.01)，其中丁郁柿蒂湯組NK-1受體 mRNA表達的降低最為顯著(P<0.01)。郁金組大鼠的回腸NK-1受體mRNA表達升高，與正常對照組對比差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，與模型對照組對比差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；延髓NK-1受體表達明顯降低，與正常對照組對比差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與模型對照組對比差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表4。

組 別回腸延髓正常對照組1.000±0.000##1.000±0.000##模型對照組2.280±0.123**2.195±0.063**阿瑞匹坦組1.915±0.099**#1.671±0.148**#丁香柿蒂湯組1.561±0.087**##1.383±0.195##郁金組2.215±0.158**1.159±0.150##丁郁柿蒂湯組1.074±0.150##0.604±0.260##

注：與正常對照組比較，**P<0.01；與順鉑模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

3 討 論

本研究綜合慢性束縛法與腹腔注射順鉑注射液，成功建立了肝郁脾虛延遲性CINV模型。經過連續(xù)束縛 21 d，大鼠出現(xiàn)目色暗紅、掉毛、好扎堆、對外界反應遲緩、大便干等肝郁癥狀。順鉑是一種高致吐化療藥物，能損傷脾胃引起嘔吐。近年來的研究認為,化療藥物屬外邪，具有寒涼肅殺之性，屬于“藥毒”或“藥邪”范疇[6]。外邪侵襲，損傷正氣，導致中陽不足，脾虛而脾胃升降失職。在本研究中，大鼠在注射順鉑注射液后，除出現(xiàn)肝郁癥狀外，還有體質量下降、食量減少、飲水量減少、大便不成形等脾虛癥狀。

丁郁柿蒂湯由丁香柿蒂湯加郁金、甘草組合而成。運用丁郁柿蒂湯干預延遲性CINV與延遲性CINV的特殊證型相關。寒涼肅殺之性的化療藥物損傷正氣，導致中陽不足，脾虛而脾胃升降失職[6]，發(fā)為延遲性CINV。《黃帝內經》云：“邪之所湊，其氣必虛?！蔽墨I研究發(fā)現(xiàn)，嘔吐的基本病機為脾氣虛[7]，因而延遲性CINV以脾虛為主，脾虛而胃失和降。延遲性CINV的難治性與頑固性的原因不僅在于脾胃還在于肝。作為延遲性CINV的唯一病因——化療藥物目前僅用于腫瘤患者。這類人群具有其體質特殊性。研究表明：100%癌癥患者具有焦慮、抑郁、擔心等負面壓抑的心理困擾，其中81%的患者心理困擾程度為中重度[8]。中醫(yī)學認為人是形神一體，負面壓抑的心理特質會直接影響形體臟腑。肝主情志，性喜調達，在負面壓抑的情志影響下，肝氣無以升發(fā)而郁滯化火。肝氣郁而化火，肝胃不和，而胃氣上逆發(fā)為嘔吐。綜上所述，延遲性CINV的證型為肝郁脾虛的特殊證型。

針對這種特殊證型，丁郁柿蒂湯在延遲性CINV中可以發(fā)揮良好療效。丁郁柿蒂湯中丁香柿蒂湯溫中健脾益氣、降逆止嘔，配伍郁金疏肝理氣，清瀉肝火。甘草甘，補中焦，與人參、生姜共同發(fā)揮溫健脾胃、補中益氣，防止丁香和郁金芳香苦寒耗傷脾胃之氣。雖然丁香與郁金是相畏藥物，但據(jù)文獻研究報道丁香、郁金配伍治療呃逆嘔吐療效顯著。如劉金梅等[3]擬方丁香郁金柿蒂湯用于治療頑固性呃逆；周英信等[9]擬方丁香郁金散用于治療頑固性呃逆。丁香、郁金兩者相畏與郁金苦寒易損傷脾胃相關。丁香辛溫，多用于治療胃寒呃逆。若是單純的胃寒呃逆運用丁香配伍郁金，郁金損傷脾胃更加重病情。有研究[10]發(fā)現(xiàn)，郁金能減弱丁香揮發(fā)油抑制小鼠胃排空的作用，此表明單純配伍丁香與郁金，郁金能減弱丁香降逆止嘔的功效。丁香溫中焦而降逆止嘔；郁金苦寒且與丁香同屬芳香類藥物，能耗能散，與丁香同用，因其易傷中焦陽氣，故而郁金能減弱丁香降逆止嘔之功，甚而因傷脾胃而發(fā)生嘔吐、氣虛而喘等。但是中醫(yī)用藥當辨證論治，不能單純考慮二藥合用的藥理作用，如果失去了證，那么處方也就無以為據(jù)了。針對不同的證，中藥處方具有不同的用藥思路與方法。丁香與郁金相畏，但是丁香與郁金并不是絕對的配伍禁忌[11]。丁香配伍郁金不可用于單純脾虛胃失和降的嘔吐，但是針對延遲性CINV的肝郁脾虛證，兩者一溫一寒，丁香可溫脾胃而防苦寒傷脾；郁金可疏肝之氣，瀉肝之火，土得木乃達而脾氣健運，又可助丁香升運脾而和胃降逆。

在本研究中，丁郁柿蒂湯干預延遲性 CINV 后，丁郁柿蒂湯組大鼠高嶺土食用量隨時間逐步穩(wěn)定下降，從第48小時開始食用量明顯低于阿瑞匹坦組，療效顯著，并且未見大鼠出現(xiàn)毒性反應。郁金組單純運用郁金干預延遲性CINV，大鼠嘔吐加重，在36 h 高嶺土食用量降低，出現(xiàn)大便稀溏，這與持續(xù)運用郁金傷脾胃之氣，脾胃虛極而無以升舉上逆發(fā)為嘔吐相關。郁金組大鼠血清、回腸中SP均明顯升高，回腸中PPTA mRNA、NK-1受體mRNA的表達均明顯升高，文獻研究表明脾虛時外周(血、回腸)SP升高[12]，這佐證了郁金組大鼠脾胃虛弱。而延髓中SP含量、PPTA mRNA、NK-1受體mRNA的表達明顯降低，筆者未查閱到關于脾虛時延髓中SP含量變化的文獻研究，這有待進一步研究證實。郁金組大鼠延髓中SP含量的降低與大鼠嘔吐程度相符。延髓作為嘔吐中樞，SP傳導的嘔吐沖動需經其而發(fā)揮作用，郁金組大鼠延髓中SP含量相對降低，因此郁金組大鼠嘔吐程度降低。上述結果佐證了郁金損傷脾胃，將其單獨用于肝郁脾虛嘔吐會加重病情，而郁金與丁香配伍干預脾虛證可取得良好療效。丁郁柿蒂湯干預延遲性CINV具有減毒增效的功能。

SP是CINV發(fā)生的主要遞質之一，嘔吐沖動通過SP傳導至嘔吐中樞，發(fā)出嘔吐行為[13]；SP又是關鍵性神經遞質[2]，與NK-1受體一同在延遲性CINV中起主導作用。本研究結果顯示：與模型對照組對比，丁郁柿蒂湯組SP的降低最為顯著。這表明：經過丁郁柿蒂湯干預，大鼠SP含量在外周及嘔吐中樞降低。結果提示：丁郁柿蒂湯防治延遲性CINV的作用機制與減少SP的表達相關。PPTA是SP的合成前體[14]。PPTA 基因經轉錄成為PPTA mRNA后再經過翻譯、加工合成SP[15]。因此，PPTA的表達異常必然會引起SP表達異常。本研究結果顯示：與模型對照組對比，丁郁柿蒂湯組PPTA mRNA表達降低最為顯著。結果表明：丁郁柿蒂湯在防治CINV過程中降低了PPTA mRNA的表達。提示：丁郁柿蒂湯通過抑制PPTA mRNA的表達減少SP的含量以治療延遲性CINV。NK-1受體是與SP親和力最大的受體，且與SP的分布大致相同[16]，又被稱為 P 物質受體。SP與NK-1受體結合，才能將嘔吐沖動傳導至嘔吐中樞，引發(fā)嘔吐。本研究結果顯示：與模型對照組對比，丁郁柿蒂湯組NK-1受體mRNA表達的降低最為顯著。表明：丁郁柿蒂湯組NK-1受體mRNA表達的降低。提示：丁郁柿蒂湯能夠通過抑制NK-1受體mRNA的表達以減少與SP結合的NK-1受體，達到防治延遲性CINV的目的。

綜上所述，丁郁柿蒂湯干預延遲性CINV的作用機制與抑制PPTA mRNA表達、降低SP的含量并抑制NK-1受體mRNA表達相關。