桑菊感冒顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)完善研究

董秋香，張?jiān)潞?，劉翀，王騰，姚輝，桑皖怡，付萍萍*（. 保定市食品藥品檢驗(yàn)所，河北 保定07000；. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)中英聯(lián)合學(xué)院，沈陽(yáng) 0000）

桑菊感冒顆粒源自清代醫(yī)學(xué)家吳瑭所著《溫病條辨》，收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第二冊(cè)）》，本方由桑葉、菊花、連翹、薄荷、苦杏仁、桔梗、甘草和蘆根8味藥材制成，方中桑葉、菊花為君藥，薄荷、杏仁、桔梗為臣藥，連翹、蘆根為佐藥，甘草為使藥，調(diào)和諸藥[1]，共奏疏風(fēng)清熱、宣肺止咳之功效，傳統(tǒng)用于風(fēng)熱感冒初起，頭痛，咳嗽，2018年流行性感冒診療方案的輕癥辨證治療方案亦新增了桑菊感冒顆粒。經(jīng)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局官網(wǎng)檢索桑菊感冒顆粒目前共有44個(gè)批準(zhǔn)文號(hào)，涉及44家生產(chǎn)企業(yè)，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅收載了性狀和顆粒劑通用檢查項(xiàng)目[2]，缺少專(zhuān)屬性鑒別及量化指標(biāo)，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不完善，不能有效評(píng)價(jià)其內(nèi)在質(zhì)量，難以保證人們用藥的安全有效。藥品質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)排查處置機(jī)制是我國(guó)首創(chuàng)的將抽檢探索性研究結(jié)果與監(jiān)督檢查相結(jié)合的監(jiān)管策略，是對(duì)藥品監(jiān)管科學(xué)理論的進(jìn)一步豐富和發(fā)展[3]。本課題參考相關(guān)文獻(xiàn)[4-6]開(kāi)展探索性研究，建立薄層色譜（TLC）法鑒別菊花、連翹及甘草，建立高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)測(cè)定連翹酯苷A、連翹苷及甘草酸的含量，對(duì)市售23批次樣品進(jìn)行綜合分析，考察市售桑菊感冒顆粒的質(zhì)量現(xiàn)狀，為其建立完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和提升整體質(zhì)量水平提供技術(shù)支撐。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AB 型高效液相色譜儀（配備PDA檢測(cè)器，LCMS solution Ver3工作站，日本島津公司）；BP211D（德國(guó)賽多利斯公司，十萬(wàn)分之一）；CAMAG 薄層色譜成像系統(tǒng)（瑞士CAMAG公司）；SK250HP超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；WGL-45B電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試藥

桑葉對(duì)照藥材（批號(hào)：121123-200603）、菊花對(duì)照藥材（批號(hào)：121384-201805）、連翹對(duì)照藥材（批號(hào)：120908-201216）、薄荷對(duì)照藥材（批號(hào)：120916-201812）、甘草對(duì)照藥材（批號(hào)：120904-202021）、苦杏仁對(duì)照藥材（批號(hào)：121554-201204）、桔梗對(duì)照藥材（批號(hào)：121028-201612）、蘆根對(duì)照藥材（批號(hào)：121107-201706）、連翹酯苷A對(duì)照品（批號(hào)：111810-201707；純度：97.2%）、連翹苷對(duì)照品（批號(hào)：110821-201816；純度：95.1%）、甘草酸銨對(duì)照品（批號(hào)：110731-202021；純度：96.2%）（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；硅膠G板、乙腈、甲醇為色譜純（德國(guó)Merck公司），水為娃哈哈純凈水，其余試劑為分析純；桑菊感冒顆粒（市售，A企業(yè)，批號(hào)：04190108，編號(hào)：A1；B企業(yè)，批號(hào)：180601、200506、210405，編號(hào)：B1～3；C企業(yè)，批號(hào)：191004、201004、211001、210405，編號(hào)：C1～4；D企業(yè)，批號(hào)：202011031、202101002、202012005、202011016，編號(hào)：D1～4；E企業(yè)，批號(hào)：201101、210402，編號(hào)：E1～2；F企業(yè)，批號(hào)：210103、201204、211204，編號(hào)：F1～3；G企業(yè)，批號(hào)：2012001、2108002、2110002，編號(hào)：G1～3；H企業(yè)，批號(hào)：21030002、21040005，編號(hào)：H1～2；I企業(yè)，批號(hào)：210603，編號(hào)：I1）。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品情況

本次共收集樣品23批次，涉及生產(chǎn)企業(yè)9家，占生產(chǎn)桑菊感冒顆粒全部企業(yè)的20%；均來(lái)自經(jīng)營(yíng)企業(yè)；規(guī)格均為11 g；貯藏條件均為密封；不同企業(yè)生產(chǎn)的樣品有效期不一致，企業(yè)A、C、E、F生產(chǎn)的10批樣品為24個(gè)月，企業(yè)B、D、G、H、I生產(chǎn)的13批樣品為36個(gè)月。

2.2 法定標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)

本品現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第二冊(cè)）》，檢驗(yàn)項(xiàng)目包括性狀、粒度、水分、溶化性、裝量差異、微生物限度，對(duì)23批樣品依據(jù)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行全項(xiàng)檢驗(yàn)，合格率為100%。

2.3 TLC 鑒別

2.3.1 菊花 取本品2 g，研細(xì)，加水20 mL，振搖使溶解（必要時(shí)過(guò)濾），用水飽和的正丁醇振搖提取2 次，每次20 mL，合并正丁醇提取液，用正丁醇飽和的水20 mL洗滌，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為供試品溶液；取處方中各藥味對(duì)照藥材，以模擬處方比例及方法制備陽(yáng)性樣品，同法制成陽(yáng)性樣品溶液（編號(hào)：Y1）。取菊花對(duì)照藥材0.1 g，加水20 mL加熱回流1 h，濾過(guò)，同法制成對(duì)照藥材溶液。以模擬處方方法制備缺菊花的陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照溶液。固定相為硅膠G，展開(kāi)劑為甲苯-乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（1∶15∶1∶1∶2）的上層溶液；點(diǎn)樣量為5 μL；展開(kāi)，晾干，噴以2%三氯化鋁乙醇溶液，加熱至干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與菊花對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性樣品無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 菊花薄層色譜圖Fig 1 TLC chromatogram of Chrysanthemi Flos

2.3.2 連翹 供試品溶液同“2.3.1”項(xiàng)下方法制備。取連翹對(duì)照藥材0.2 g，加水20 mL加熱回流1 h，濾過(guò)，同法制成對(duì)照藥材溶液。取連翹苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。以模擬處方方法制備缺連翹的陰性樣品，同法制成陰性樣品溶液。固定相為硅膠G，展開(kāi)劑為三氯甲烷-甲醇-甲酸（9∶2∶0.1）；點(diǎn)樣量為10 μL；展開(kāi)，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與連翹對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性樣品無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 連翹薄層色譜圖Fig 2 TLC chromatogram of Forsythiae Fructus

2.3.3 甘草 供試品溶液同“2.3.1”項(xiàng)下方法制備。取甘草對(duì)照藥材0.1 g，加水20 mL加熱回流1 h，濾過(guò)，同法制成對(duì)照藥材溶液。以模擬處方比例及方法制備缺少甘草的陰性樣品，同法制成陰性樣品溶液。固定相為硅膠G，展開(kāi)劑為三氯甲烷-甲醇-水（13∶6∶2）10℃以下放置的下層溶液；點(diǎn)樣量為10 μL；展開(kāi)，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與甘草對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性樣品無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 甘草薄層色譜圖Fig 3 TLC chromatogram of Glycyrrhizae Radix Et Rhizoma

2.4 多指標(biāo)成分含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Waters SunFire C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相：0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～40 min，10%～18%B；40～55 min，18%～36%B；55～65 min，36%～60%B；65～70 min，60%～100%B；70～71 min，100%～10%B；71～85 min，10%B），流速：1.0 mL·min-1，柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：237 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.4.2 溶液的制備 取連翹酯苷A、連翹苷、甘草酸銨對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加80%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為42.85、14.17、14.56 μg·mL-1的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。取本品10袋，內(nèi)容物研細(xì)，取細(xì)粉1 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，稱(chēng)定重量，超聲處理（功率：250 W，頻率：53 kHz）30 min，放冷，用80%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。分別取處方中各藥味對(duì)照藥材，以模擬處方比例及方法制備缺少連翹、甘草的陰性樣品，照供試品溶液的制備方法，同法制成缺連翹的陰性樣品溶液、缺甘草的陰性樣品溶液。

2.4.3 方法學(xué)考察

① 專(zhuān)屬性試驗(yàn)：取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液及空白溶劑，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖（見(jiàn)圖4），供試品溶液色譜圖中峰1與相鄰峰的分離度分別為1.75、1.71，峰2與相鄰峰的分離度分別為3.94、2.83，峰3與相鄰峰的分離度分別為5.38、2.68，均大于1.5。同時(shí)采用PDA檢測(cè)器在190～800 nm進(jìn)行光譜掃描，峰1、2、3的紫外光譜圖分別與連翹酯苷A、連翹苷、甘草酸對(duì)照品的紫外光譜圖一致。峰1、2、3的峰純度檢測(cè)結(jié)果顯示未檢測(cè)到雜質(zhì)，依據(jù)工作站判定規(guī)則可判斷為單一成分。結(jié)果表明，此色譜條件下3種待測(cè)成分峰與相鄰峰分離良好，陰性樣品無(wú)干擾。

圖4 高效液相色譜圖Fig 4 HPLC chromatograms

② 線性關(guān)系考察：取連翹酯苷A、連翹苷、甘草酸銨對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加80%甲醇定量稀釋制成質(zhì)量濃度分別為96.71、76.08、75.87 μg·mL-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，加80%甲醇等倍逐級(jí)稀釋成系列濃度的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。分別以3種待測(cè)成分的質(zhì)量濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果各待測(cè)成分在相應(yīng)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程及線性范圍見(jiàn)表1。

表1 主成分回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍Tab 1 Regression equation，correlation coefficient and linear range of each component

③ 定量限和檢測(cè)限：取“2.4.3”項(xiàng)下的對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，等倍逐級(jí)稀釋?zhuān)M(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果連翹酯苷A、連翹苷及甘草酸的定量限（LOQ）分別為0.47、0.23、0.45 μg·mL-1（S/N＝10）；檢測(cè)限（LOD）分別為0.14、0.07、0.14 μg·mL-1（S/N＝3）。

④ 精密度試驗(yàn)：取“2.4.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果連翹酯苷A、連翹苷、甘草酸峰面積的RSD分別為0.20%、0.40%、0.30%（n＝6），表明儀器精密度良好。

⑤ 重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品（編號(hào)B1），按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，進(jìn)樣測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算平均含量。結(jié)果樣品中連翹酯苷A、連翹苷及甘草酸的平均含量分別為1.087、0.3827、0.4485 mg·g-1，RSD分別為0.60%、0.60%、0.70%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

⑥ 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取“2.4.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：B1），分別于室溫下放置0、1.5、3、4.5、6、7.5、9、12、18、24 h，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果連翹酯苷A、連翹苷及甘草酸色譜峰面積的RSD分別為0.20%、0.40%、0.40%（n＝10），表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

⑦ 加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（編號(hào)B2）0.5 g，精密稱(chēng)定（9份），置100 mL具塞錐形瓶中，分別精密加入連翹酯苷A、連翹苷、甘草酸銨對(duì)照品適量，依法制備高、中、低濃度的供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果3種成分的回收率均在97.57%～103.06%，RSD均小于2.0%。

2.4.4 含量測(cè)定 取23批樣品，按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算3種成分的含量（甘草酸的計(jì)算結(jié)果與0.9797相乘），結(jié)果見(jiàn)表2，23批樣品連翹酯苷A、連翹苷、甘草酸的平均含量為4.68、1.86、3.60 mg/袋，RSD值為72.1%、58.7%、44.1%。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(mg/袋)Tab 2 Content determination in the samples (mg/袋)

3 討論

3.1 指標(biāo)成分的確立

本研究曾嘗試開(kāi)展處方中君藥桑葉的TLC鑒別，但選用多個(gè)展開(kāi)系統(tǒng)展開(kāi)后，均未排除陰性樣品干擾，桑葉的鑒別有待進(jìn)一步研究。本品由8味藥材組方，其中薄荷采用氣相色譜法測(cè)定薄荷腦的含量，桔梗采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器測(cè)定桔梗皂苷D的含量，蘆根質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中未收載含量測(cè)定，文獻(xiàn)報(bào)道經(jīng)堿性乙醇水溶液回流提取后測(cè)定蘆根中對(duì)香豆酸和阿魏酸的含量[7]，故未實(shí)現(xiàn)上述3味藥材的同時(shí)測(cè)定。王慶喜等[8]用鹽酸溶液回流提取后測(cè)定桑菊感冒顆粒中槲皮素的含量，亦未實(shí)現(xiàn)槲皮素的同時(shí)測(cè)定。本品中綠原酸、蘆丁、苦杏仁苷的含量較低，且綠原酸為桑葉和菊花的共有成分，蘆丁為桑葉、菊花和連翹的共有成分，均不適宜做含量測(cè)定的指標(biāo)成分。本課題組前期進(jìn)行了指紋圖譜相關(guān)研究，共標(biāo)定21個(gè)共有峰，屬桑葉、菊花、連翹、甘草和薄荷，運(yùn)用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行主成分分析，篩選出8個(gè)差異性指標(biāo)成分，結(jié)合色譜峰的保留時(shí)間及紫外光譜信息進(jìn)行解析指認(rèn)出其中3個(gè)色譜峰，分別為連翹酯苷A、連翹苷和甘草酸，其中連翹酯苷A和連翹苷屬連翹，甘草酸屬甘草，故本研究確立此3種成分為含量測(cè)定的指標(biāo)成分。

3.2 提取溶劑及方式的選擇

TLC鑒別考察用水飽和的正丁醇、乙酸乙酯、三氯甲烷、乙醚提取樣品，按擬定色譜條件測(cè)定，結(jié)果以水飽和的正丁醇為溶劑提取時(shí)，樣品信息更豐富，斑點(diǎn)更清晰，故選擇以水飽和的正丁醇作為提取溶劑；HPLC多指標(biāo)成分含量測(cè)定考察提取溶劑（甲醇、90%甲醇、80%甲醇、水）和提取時(shí)間（10、20、30、40 min）對(duì)3種成分提取效率的影響，結(jié)果顯示以80%甲醇超聲30 min時(shí)3種成分的含量較高，故選擇此方法制備供試品溶液。

3.3 色譜條件的優(yōu)化

3.3.1 TLC色譜條件 曾嘗試用相同色譜系統(tǒng)同時(shí)分析連翹和甘草，但在甘草的色譜系統(tǒng)下連翹苷的Rf值偏低，連翹的色譜系統(tǒng)下甘草主斑點(diǎn)的Rf值均偏高，最終確定本文的色譜條件分別測(cè)定連翹和甘草。

3.3.2 HPLC流動(dòng)相 甲醇-水系統(tǒng)洗脫能力較差，無(wú)法檢測(cè)到甘草酸峰，以乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)峰形較差，采用乙腈-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液和乙腈-0.2%磷酸溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，乙腈-0.05%磷酸溶液系統(tǒng)下色譜峰形較差，后兩者差異不大，分離度符合要求且峰形較好，故選擇乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相。

3.4 含量測(cè)定限度制定

由于青翹與老翹中連翹酯苷A含量存在一定差異[9]，而本品制法項(xiàng)下未明確青翹或老翹投料，且不同廠家生產(chǎn)工藝與設(shè)備不同造成的轉(zhuǎn)移率差異，故未能采用樣品的測(cè)定結(jié)果結(jié)合轉(zhuǎn)移率確定含量限度。國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)工作手冊(cè)規(guī)定中藥材和中藥飲片原則上按照平均值的-20%制定含量測(cè)定限度，另2017年3月18日廣東省藥品檢驗(yàn)所網(wǎng)站發(fā)布的關(guān)于“在廣東省提高國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)行動(dòng)計(jì)劃有關(guān)問(wèn)題的解答”中提到，中成藥含量限度一般按平均值下浮20% 較合適，故以23批次樣品含量測(cè)定結(jié)果的平均值下浮20%為標(biāo)準(zhǔn)，將連翹酯苷A、連翹苷、甘草酸的限度暫定為3.74、1.49、2.88 mg/袋。針對(duì)青翹與老翹中連翹酯苷A含量的差異，有必要對(duì)本品中連翹酯苷A的含量制訂更加科學(xué)的限度，此項(xiàng)工作有待進(jìn)一步研究。

3.5 整體質(zhì)量分析

23批樣品按現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行法定檢驗(yàn)全部合格，但結(jié)合探索性研究結(jié)果深入分析，仍可發(fā)現(xiàn)一些與藥品質(zhì)量相關(guān)的問(wèn)題。TLC鑒別結(jié)果分析23批樣品均檢出與菊花、甘草、連翹對(duì)照藥材和連翹苷對(duì)照品相應(yīng)的斑點(diǎn)，但斑點(diǎn)深淺不一；以本文制訂的限度進(jìn)行檢驗(yàn)，有11批樣品不合格，不合格率為47.8%，不合格樣品涉及7家企業(yè)；23批樣品的3種成分含量測(cè)定結(jié)果RSD值顯示樣品間質(zhì)量存在顯著差異，特別是連翹酯苷A的RSD值超過(guò)70%，推測(cè)可能是連翹采收期及生產(chǎn)工藝不同導(dǎo)致連翹酯苷A含量差異尤為顯著。本文運(yùn)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)含量測(cè)定與水分、裝量及粒度的相關(guān)性進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示樣品中連翹酯苷A和連翹苷的含量與水分成顯著正相關(guān)，提示生產(chǎn)過(guò)程中干燥方式對(duì)含量測(cè)定結(jié)果有影響，建議生產(chǎn)企業(yè)嚴(yán)格控制干燥溫度及時(shí)間。

3.6 有效期的制訂

現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)在關(guān)鍵檢驗(yàn)項(xiàng)目上的缺失，致使有效期的制訂不科學(xué)，且不同企業(yè)產(chǎn)品的有效期不同，建議生產(chǎn)企業(yè)對(duì)有效期重新考察，且不能忽略包裝材料對(duì)有效期的影響。

桑菊感冒顆?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)在項(xiàng)目設(shè)置上未關(guān)注影響藥品有效性和安全性的重要質(zhì)量要素，無(wú)法準(zhǔn)確評(píng)價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量，標(biāo)準(zhǔn)亟待完善；法定標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)合格率較高，探索性研究結(jié)果顯示市售桑菊感冒顆粒質(zhì)量存在顯著差異，產(chǎn)品質(zhì)量亟待提高。本文建立的TLC鑒別和HPLC含量測(cè)定方法填補(bǔ)了桑菊感冒顆粒關(guān)鍵質(zhì)控項(xiàng)目的缺失，為完善質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和評(píng)價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量現(xiàn)狀提供了重要依據(jù)。