基于高效液相色譜法測定不同產(chǎn)地、不同抽芯程度遠(yuǎn)志藥材中4種成分的含量

洪占梅，熊曉莉，肖俊萍，高慧，章芳琴，葉喜德*（.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇一醫(yī)院藥劑科，合肥 00；.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南昌 0004；.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，南昌 0006）

遠(yuǎn)志為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志Polygala tenuifoliaWilld.或卵葉遠(yuǎn)志Polygala sibiricaL. 的干燥根[1]，主產(chǎn)于山西和陜西，性溫，味苦。傳統(tǒng)用藥常以遠(yuǎn)志根皮入藥，具有鎮(zhèn)靜安神、祛痰消腫等功效，多用于治療失眠多夢、健忘等證?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)志中寡糖酯、酮和皂苷類等成分對遠(yuǎn)志鎮(zhèn)靜安神及神經(jīng)保護(hù)等藥效產(chǎn)生影響[2]。而不同產(chǎn)地遠(yuǎn)志藥材所含化學(xué)成分的含量存在差異[3-4]，其中山西產(chǎn)遠(yuǎn)志藥材中寡糖酯和酮類成分含量高且品質(zhì)優(yōu)。而當(dāng)前對不同產(chǎn)地遠(yuǎn)志成分的含量研究多集中于采用HPLC法測定寡糖酯、酮和皂苷類等成分的含量[5]。2020年版《中國藥典》以遠(yuǎn)志酮Ⅲ、3，6'-二芥子?；崽呛图?xì)葉遠(yuǎn)志皂苷為目標(biāo)成分，應(yīng)用反相色譜ODS柱及甲醇-0.05%磷酸溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫，并按照HPLC法進(jìn)行含量測定。另一方面，遠(yuǎn)志質(zhì)量優(yōu)劣，常與抽芯程度有關(guān)。所謂抽芯程度是指同一批遠(yuǎn)志抽芯所占比率，在一定程度上代表遠(yuǎn)志等級，這與遠(yuǎn)志傳統(tǒng)用藥習(xí)慣“去芯”有關(guān)，認(rèn)為遠(yuǎn)志芯是遠(yuǎn)志的主要毒性部位。由于遠(yuǎn)志抽芯困難，故遠(yuǎn)志的抽芯程度越高，商品等級越高[6]。但現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)志可不去芯，遠(yuǎn)志芯中的化學(xué)成分與遠(yuǎn)志筒相近，只是含量較低，且去芯可能更易導(dǎo)致遠(yuǎn)志發(fā)霉，從而導(dǎo)致黃曲霉毒素超標(biāo)[7]。基于此，本文研究遠(yuǎn)志不同產(chǎn)地、不同抽芯程度對其所含西伯利亞遠(yuǎn)志糖A5、西伯利亞遠(yuǎn)志糖A6、遠(yuǎn)志酮和3，6’-二芥子?；崽堑?種成分含量的影響，并比較它們之間的差異，為深入研究遠(yuǎn)志提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

1100型高效液相色譜系統(tǒng)（安捷倫公司），DFY-400型400克搖擺式高速中藥粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司），KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），TGL-16B高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），十萬分之一電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），娃哈哈純凈水。對照品西伯利亞遠(yuǎn)志糖A5（批號：MUST-21052704）、西伯利亞遠(yuǎn)志糖A6（批號：MUST-20082523）、遠(yuǎn)志酮（批號：MUST-19092310）（純度＞94.0%）（成都曼斯特生物科技有限公司）；3，6'-二芥子?；崽牵ㄅ枺簑kq 21031112）（純度＞99.0%，四川省維克奇生物科技有限公司）；除乙腈為色譜純外，其他試劑均為分析純。

本研究所用遠(yuǎn)志藥材來源于陜西和山西兩地，詳見表1，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室劉應(yīng)蛟副教授鑒定為遠(yuǎn)志（Polygala tenuifoliaWilld）的干燥根。

表1 12批遠(yuǎn)志來源信息Tab 1 12 batches of Polygala tenuifolia source information

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

取不同產(chǎn)地遠(yuǎn)志藥材20 g，粉碎，過60目篩，各取0.5 g粉末，精密稱定，置于錐形瓶中，加入60%甲醇25 mL，稱定重量，超聲45 min。靜置冷卻后，再稱定重量，用60%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，取濾液，置于25 mL量瓶中，定容至刻度。轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，5000 r·min-1下離心5 min，取上清液，微孔濾膜過濾后，得供試品溶液。

2.2 對照品溶液的制備

取西伯利亞遠(yuǎn)志糖A5、西伯利亞遠(yuǎn)志糖A6、遠(yuǎn)志酮各1 mg，3，6'-二芥子?；崽? mg，于5 mL量瓶中用純甲醇定容，制成對照品儲備液。分別從各對照品儲備液中精密吸取適量配制成西伯利亞遠(yuǎn)志糖A5、西伯利亞遠(yuǎn)志糖A6、遠(yuǎn)志酮質(zhì)量濃度均為0.05 mg·mL-1，3，6'-二芥子?；崽琴|(zhì)量濃度為0.2 mg·mL-1的混合對照品溶液，逐級稀釋，得混合對照品系列溶液。

2.3 色譜條件[8]

采用Syncronis C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），柱溫35℃，流速1 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL，檢測波長320 nm，流動相為乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～8 min，8%～15.5%A；8～22 min，15.5%～18%A；22～30 min，18%～20%A；30～50 min，20%～24%A；50～73 min，24%～33%A；73～85 min，33%～42%A）。在上述色譜條件下，各成分間分離度良好，分離度均大于1.5，見圖1。

圖1 遠(yuǎn)志中4種成分HPLC色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of 4 components in Polygala tenuifolia

2.4 線性關(guān)系考察

取混合對照品系列溶液，西伯利亞遠(yuǎn)志糖A5、西伯利亞遠(yuǎn)志糖A6、遠(yuǎn)志酮質(zhì)量濃度分別為5、10、15、25、40、50 μg·mL-1，3，6’-二芥子?；崽琴|(zhì)量濃度分別為20、40、60、100、160、200 μg·mL-1，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄各成分峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以信噪比（S/N）為10時計(jì)算定量限，結(jié)果見表2。

表2 遠(yuǎn)志中4種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍Tab 2 Standard curve and linearity of 4 components in Polygala tenuifolia

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取遠(yuǎn)志混合對照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL，重復(fù)6次，記錄并計(jì)算對照品中西伯利亞遠(yuǎn)志糖A5、西伯利亞遠(yuǎn)志糖A6、遠(yuǎn)志酮、3，6'-二芥子?；崽浅煞址迕娣eRSD值，其結(jié)果分別為1.9%、1.9%、1.1%、1.6%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批遠(yuǎn)志藥材粉末6份，精密稱定，按照“2.1”項(xiàng)方法制備，按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算西伯利亞遠(yuǎn)志糖A5、西伯利亞遠(yuǎn)志糖A6、遠(yuǎn)志酮、3，6'-二芥子酰基蔗糖峰面積RSD值，其結(jié)果分別為2.1%、2.2%、2.3%、1.8%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批遠(yuǎn)志供試品溶液適量，于室溫下分別在0、2、4、8、12 h，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算峰面積RSD值。結(jié)果西伯利亞遠(yuǎn)志糖A5、西伯利亞遠(yuǎn)志糖A6、遠(yuǎn)志酮、3，6'-二芥子?；崽欠迕娣eRSD分別為1.1%、2.0%、1.7%、1.6%，表明供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收試驗(yàn)

精密量取已知成分含量的遠(yuǎn)志供試品溶液（批號：S1）1 mL，加入低、中、高濃度的混合對照品溶液1 mL，每個濃度取3份，置于5 mL量瓶中，定容，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測定西伯利亞遠(yuǎn)志糖A5、西伯利亞遠(yuǎn)志糖A6、遠(yuǎn)志酮、3，6'-二芥子酰基蔗糖的平均回收率。結(jié)果4種成分的低、中、高濃度的平均回收率在94.8%～106.8%，RSD在0.47%～2.0%。

2.9 樣品含量測定

取各批次樣品，按“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行制備，按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測，記錄峰面積，計(jì)算供試品中各成分含量，結(jié)果見表3。

表3 不同遠(yuǎn)志中4種成分含量測定結(jié)果(mg·g-1)Tab 3 Determination of 4 components in different Polygala tenuifolia (mg·g-1)

2.10 統(tǒng)計(jì)分析

采用 SPSS 23.0 軟件分析，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.10.1 4種不同成分含量聚類分析 將12份不同產(chǎn)地、不同抽芯程度遠(yuǎn)志藥材中西伯利亞遠(yuǎn)志糖A5、西伯利亞遠(yuǎn)志糖A6、遠(yuǎn)志酮和3，6'-二芥子?；崽?種成分含量數(shù)據(jù)輸入SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件中進(jìn)行聚類分析。在分析過程中主要以遠(yuǎn)志藥材中各成分含量的相似度進(jìn)行分類。結(jié)果表明，12批遠(yuǎn)志樣品首先可聚為兩個大類，S5、S9、S10聚為一大類，其他可聚為另一大類，見圖2。在第一大類中，S5單獨(dú)為一小類，S9、S10聚為一小類；在第二大類中，可分為4個小類，S1、S2、S7、S8聚為一小類，S3、S11、S6聚為一小類，S12與S4單獨(dú)各為一小類。

圖2 12批遠(yuǎn)志的聚類分析樹狀圖Fig 2 Cluster analysis of 12 batches Polygala tenuifolia

2.10.2 4種成分含量差異分析 由表3可知，不同產(chǎn)地、不同抽芯程度遠(yuǎn)志藥材4種成分含量存在顯著差異。西伯利亞遠(yuǎn)志糖A5含量為0.787～2.193 mg·g-1，以山西未抽芯大筒遠(yuǎn)志含量最高，為2.193 mg·g-1，其次為陜西未抽芯大筒遠(yuǎn)志，含量為2.129 mg·g-1，與其他不同產(chǎn)地、不同抽芯程度遠(yuǎn)志藥材存在顯著性差異（P＜0.05）。相同產(chǎn)地、不同抽芯程度遠(yuǎn)志中西伯利亞遠(yuǎn)志糖A5含量無顯著差異，以山西抽芯98%中筒遠(yuǎn)志與抽芯90%大筒遠(yuǎn)志含量最為接近。

西伯利亞遠(yuǎn)志糖A6含量為0.627～1.574 mg·g-1，以陜西未抽芯大筒遠(yuǎn)志含量最高，為1.574 mg·g-1，其次為山西未抽芯大筒遠(yuǎn)志，含量為1.195 mg·g-1，與其他不同產(chǎn)地、不同抽芯程度遠(yuǎn)志存在顯著差異（P＜0.05）。相同產(chǎn)地、不同抽芯程度遠(yuǎn)志中西伯利亞遠(yuǎn)志糖A6含量無顯著差異，以山西抽芯95%與抽芯98%中筒遠(yuǎn)志中西伯利亞遠(yuǎn)志糖A6含量最為接近。

3，6'-二芥子?；崽呛繛?.976～8.465 mg·g-1，以陜西未抽芯大筒遠(yuǎn)志含量最高，為8.465 mg·g-1，其次為陜西抽芯98%大筒遠(yuǎn)志，含量為6.807 mg·g-1，與其他不同產(chǎn)地、不同抽芯程度的遠(yuǎn)志存在顯著差異（P＜0.05）。相同產(chǎn)地、不同抽芯程度遠(yuǎn)志中3，6'-二芥子酰基蔗糖含量無顯著差異，以陜西抽芯98%大筒遠(yuǎn)志與抽芯95%小筒遠(yuǎn)志含量最為接近。

3 總結(jié)與討論

3.1 遠(yuǎn)志藥材及測定指標(biāo)的選擇

目前，我國的遠(yuǎn)志藥材主要分布于山西、陜西、河北和山東等地，以山西和陜西為主要產(chǎn)地。在遠(yuǎn)志多指標(biāo)成分含量研究中，對山西、內(nèi)蒙、陜西等地的糖酯類指標(biāo)成分進(jìn)行研究，結(jié)果表明山西遠(yuǎn)志藥材成分含量較高，整體品質(zhì)較好[9]。因此，本研究選用山西和陜西兩地不同抽芯程度的遠(yuǎn)志藥材進(jìn)行成分含量研究。在選擇測定指標(biāo)方面，大量研究表明，遠(yuǎn)志中寡糖酯類和酮類成分與遠(yuǎn)志藥效相關(guān)，因此對不同產(chǎn)地遠(yuǎn)志藥材進(jìn)行成分含量測定時，常以遠(yuǎn)志酮、3，6'-二芥子酰基蔗糖為測定指標(biāo)。另外，參考文獻(xiàn)[10]對遠(yuǎn)志藥材中西伯利亞遠(yuǎn)志糖A5和西伯利亞遠(yuǎn)志糖A6進(jìn)行含量測定，分析遠(yuǎn)志藥材成分含量的差異性。因此，在本研究中選用西伯利亞遠(yuǎn)志糖A5、西伯利亞遠(yuǎn)志糖A6、遠(yuǎn)志酮和3，6'-二芥子?；崽?種成分進(jìn)行研究。

由含量測定結(jié)果可知，山西未抽芯大筒遠(yuǎn)志中西伯利亞遠(yuǎn)志糖A5含量比抽芯者高，陜西抽芯98%大筒遠(yuǎn)志中西伯利亞遠(yuǎn)志糖A6含量最高，山西未抽芯大筒遠(yuǎn)志中遠(yuǎn)志酮含量最高，陜西未抽芯遠(yuǎn)志中3，6'-二芥子?；崽呛孔罡撸憩F(xiàn)為整體質(zhì)量優(yōu)、品質(zhì)佳。

3.2 測定條件的篩選

2020年版《中國藥典》遠(yuǎn)志的含量測定中，采用70%甲醇對遠(yuǎn)志粉末進(jìn)行超聲提取，殘?jiān)?0%氫氧化鈉加熱回流，鹽酸調(diào)節(jié)pH值，正丁醇振搖提取等方式制備供試品溶液。本研究在設(shè)計(jì)供試品的制備方法階段對超聲提取和回流提取方式進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)[11-12]多采用超聲提取進(jìn)行供試品制備，甲醇濃度在50%～70%，此法提取效率高且用時少，因此，本研究中對遠(yuǎn)志藥材采用超聲法提取，提取溶劑為60%的甲醇。對于流動相的選擇，文獻(xiàn)[13-15]對遠(yuǎn)志成分含量測定時多采用甲醇-0.05%磷酸溶液（70∶30）為流動相進(jìn)行梯度洗脫，而在遠(yuǎn)志指紋圖譜研究以及遠(yuǎn)志質(zhì)量評價研究中多采用乙腈-0.05%磷酸溶液進(jìn)行洗脫。本文參考文獻(xiàn)并對混合對照品成分進(jìn)行測定后，采用乙腈-0.05%磷酸溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫，實(shí)現(xiàn)了對西伯利亞遠(yuǎn)志糖A5、西伯利亞遠(yuǎn)志糖A6、遠(yuǎn)志酮與3，6'-二芥子?；崽呛糠治鰷y定。

3.3 不同抽芯程度對遠(yuǎn)志藥材的影響

根據(jù)遠(yuǎn)志傳統(tǒng)藥用經(jīng)驗(yàn)[16]，遠(yuǎn)志以根皮入藥，藥效以“去凈木心者”為佳，其中大筒遠(yuǎn)志質(zhì)量最優(yōu)，中筒其次，小筒較次。而在本研究中，對不同抽芯程度遠(yuǎn)志藥材含量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)陜西、山西中未抽芯大筒遠(yuǎn)志西伯利亞遠(yuǎn)志糖A5成分含量較高，西伯利亞遠(yuǎn)志糖A6則以陜西98%抽芯大筒遠(yuǎn)志最高，遠(yuǎn)志酮以山西未抽芯大筒遠(yuǎn)志最高，陜西未抽芯大筒遠(yuǎn)志中3，6'-二芥子酰基蔗糖成分含量最高。歷代本草用藥，提倡遠(yuǎn)志去芯。但隨著研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)志不去芯時，毒性和溶血作用比取芯之后的根皮入藥時更小[17]，且祛痰作用相近。本研究結(jié)果表明，不去芯遠(yuǎn)志中化學(xué)成分含量相對較高，說明去芯會影響遠(yuǎn)志主要成分含量，這為遠(yuǎn)志去芯是否影響其藥效等方面的深入研究提供了基礎(chǔ)。