共載姜黃素與阿霉素膠束的制備工藝優(yōu)化及體外抗腫瘤評價

李芳嬋，韋志英，羅小莉，潘翠柳，吳秀彩，梁方耀，潘真真*，李耀華*（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實驗實訓(xùn)中心，南寧 50200；2. 廣西高校中藥提取純化與質(zhì)量分析重點實驗室，南寧 50200；. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧 50200）

目前，乳腺癌約占女性癌癥病例的24.5%，占癌癥死亡的15.5%，發(fā)病率和病死率均居首位，已經(jīng)成為嚴重威脅女性健康的惡性腫瘤[1]，隨著生活水平日益提高、環(huán)境污染和人口老年化的加劇，預(yù)計2070年新發(fā)乳腺癌病例將達到440萬[2]。在我國乳腺癌每年新發(fā)病例約27.9萬，并以每年2%的速度遞增[3]。乳腺癌的主流治療方案一般以化學(xué)治療為主，配合手術(shù)切除和放射治療的綜合治療，化療藥物大多是小分子細胞毒性藥物，雖然能殺傷腫瘤細胞，但選擇性和靶向性差，會對人體正常的組織細胞實行“無差別攻擊”，使患者出現(xiàn)嚴重的毒副作用，化療后期患者的生存質(zhì)量差，以至于化療難以持續(xù)，在臨床中的應(yīng)用有很多局限性[4-5]。因此，探索更好的化學(xué)治療方案，提高乳腺癌治療水平具有深遠的理論和現(xiàn)實意義。

姜黃素（curcumin，CUR）是從姜黃根莖中提取的一種脂溶性多酚，具有抗腫瘤、抗菌、抗抑郁、抗炎、抗氧化等多種藥理活性[6-9]。CUR的抗腫瘤作用，在近幾年受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注，文獻報道其通過調(diào)節(jié)如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factor，NF-κB）及環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）等促炎因子和細胞因子的表達水平而抑制腫瘤細胞的增殖[10-12]。但因CUR為脂溶性多酚，難溶于水，口服給藥吸收差，在普通給藥方式下CUR的生物利用率很低，限制其臨床應(yīng)用。阿霉素（doxorubicin，DOX）是臨床一線廣譜抗腫瘤藥物，通過激發(fā)拓撲異構(gòu)酶Ⅱ裂解DNA從而破壞DNA的三級結(jié)構(gòu)，并觸發(fā)細胞凋亡途徑，是臨床治療乳腺癌的化療藥物之一[13-14]。但是，DOX選擇性較差，臨床應(yīng)用時出現(xiàn)明顯的毒副作用，對心、肝、腎等正常組織和器官造成損傷，長期使用會引起患者強烈的過敏反應(yīng)、心臟毒性和肝臟損傷[15-17]。聯(lián)合用藥是腫瘤治療的新方向之一，將不同作用機制的抗腫瘤藥物聯(lián)合起來，降低腫瘤對化療藥物的耐藥性，增強化療藥物對腫瘤的殺傷作用[18-20]。多項研究表明，CUR與DOX聯(lián)用，增強了DOX的抗腫瘤作用，降低了DOX的給藥劑量，從而降低DOX的毒副作用[21]。體外研究發(fā)現(xiàn)CUR和DOX聯(lián)合給藥，能夠有效提高乳腺癌細胞MCF-7和MDAMB-231對DOX的敏感性，降低DOX的半數(shù)抑制濃度（IC50）[22]。另一研究發(fā)現(xiàn)，在DOX耐藥細胞中，CUR和DOX聯(lián)合給藥能有效抑制ABC（ATP-binding cassette）轉(zhuǎn)運蛋白家族中的外排蛋白ABCB4的活性，從而逆轉(zhuǎn)乳腺癌細胞的DOX耐藥[23]。此外，多項研究發(fā)現(xiàn)CUR能降低DOX誘導(dǎo)的心臟毒性。有研究揭示CUR可能是通過消除大鼠的炎癥、凋亡、改善DNA氧化損傷和調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)氧化水平來改善DOX誘導(dǎo)的心臟毒性[24]。另有研究發(fā)現(xiàn)，與單用DOX給藥的小鼠組相比，DOX和CUR聯(lián)合給藥組的小鼠血清心肌酶顯著降低，抗氧化能力提高；進一步研究發(fā)現(xiàn)CUR通過 PI3K/Akt/mTOR通路抑制DOX誘導(dǎo)的心肌細胞焦亡[25]。因此，研究DOX和CUR聯(lián)合用藥具有理論和現(xiàn)實意義。

本研究以三嵌段共聚物聚己內(nèi)酯-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯（PCL-PEG-PCL）為載體，采用薄膜-水化-超聲法制備共載姜黃素/阿霉素膠束（CUR/DOX micelle）。以粒徑、包封率和載藥量為考察指標(biāo)，單因素結(jié)合正交實驗對CUR/DOX micelle制備工藝進行優(yōu)化，確定其最優(yōu)制備工藝條件。對CUR/DOX micelle進行表征，并考察其體外細胞攝取率和抗腫瘤活性。本研究通過制備膠束實現(xiàn)共載姜黃素與阿霉素，采用聯(lián)合給藥模式發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用，為腫瘤治療提供新的思路。

1 材料

1.1 儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；JY92-2D超聲波細胞粉碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；LC2030高效液相色譜儀、RF-6000熒光分光光度計（日本島津儀器有限公司）；EM10透射電子顯微鏡（德國蔡司公司）；納米粒度分析儀（美國麥奇克有限公司）；FreeZone 2.5冷凍干燥儀（美國Labconco公司）；CT 15RE冷凍離心機（日本日立公司）；Multiskan Sky型酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技公司）；LSR Fortessa流式細胞儀（BD公司）。

1.2 試藥

姜黃素原料藥（北京百靈威科技有限公司，批號：921105）；姜黃素對照品（純度：99.50%，成都曼斯特生物科技有限公司，批號：MUST-21022710）；阿霉素（大連美侖生物技術(shù)有限公司，對其進行脫鹽處理）；PCL8000-PEG6000-PCL8000（山東岱罡生物科技有限公司）；甲基偶氮唑鹽（MTT，北京索萊寶科技有限公司，批號：829Z0513）；人乳腺癌細胞MCF-7（中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所）；胎牛血清（美國Gemini，批號：A87F82H）；1640培養(yǎng)基（賽默飛世爾科技有限公司，批號：8120133）；磷酸緩沖鹽（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號：20211210）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 CUR/DOX micelle的制備

采用薄膜-水化-超聲法制備CUR/DOX micelle。稱取處方量的CUR、脫鹽DOX（CUR∶DOX＝5∶1）和PCL-PEG-PCL，加入適量的二氯甲烷-丙酮混合溶液（1∶1）使其溶解后，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，直至在瓶底形成一層橘紅色的薄膜。加入適量去離子水，水浴加熱水化。水化后于冰浴中探頭超聲處理（250 W），過0.22 μm微孔濾膜除去游離CUR和DOX，即得。同法制備不含藥的空白膠束、單載CUR膠束和單載DOX膠束。

2.2 CUR和DOX的含量測定

采用高效液相色譜法對CUR進行含量測定。色譜條件：流動相為甲醇-4%冰醋酸（48∶52），色譜柱為Hypersil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），檢測波長為430 nm，柱溫30℃；流速1 mL·min-1；進樣量10 μL。經(jīng)方法學(xué)驗證表明方法的專屬性良好；回歸方程為Y＝7.79×104X-5.95×103，r＝0.9999（n＝5），CUR在21.30～106.50 μg·mL-1內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。精密度和重復(fù)性RSD分別為1.8%、2.1%（n＝6）；平均加樣回收率為99.17%，RSD為1.4%。

采用熒光分光光度法對DOX含量進行測定（避光操作），激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為590 nm，測定其熒光強度?；貧w方程為Y＝0.2203X+32.13，r＝0.9999（n＝5），結(jié)果表明DOX在400～6400 ng·mL-1內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。精密度和重復(fù)性RSD分別為1.4%、1.0%（n＝6）；平均加樣回收率為99.33%，RSD為2.5%。

2.3 包封率和載藥量的測定

按“2.1”項下方法制備CUR/DOX micelle，并且取出部分進行冷凍干燥。采用高速離心法測定其載藥量及包封率，稱取一定量CUR/DOX micelle，計為WM，加入一定量甲醇超聲10 min，超高速離心10 min（35 000 r·min-1），取上清液按“2.2”項下方法分別測定CUR和DOX的含量，計為Ws，投藥量記為W總。按載藥量及包封率的計算公式，分別計算CUR和DOX的包封率和載藥量。

載藥量（%）＝WS/WM×100%；

包封率（%）＝WS/W總×100%。

2.4 粒徑測定

按“2.1”項下方法制備CUR/DOX micelle，分散在一定量的去離子水中，通過納米粒粒度儀測定其粒徑和多分散系數(shù)（PDI），平行測定3次，取其平均值。

2.5 CUR/DOX micelle處方工藝優(yōu)化

2.5.1 正交實驗因素和水平 在前期單因素實驗基礎(chǔ)上，選取對膠束制備影響較大的因素藥物與PCL-PEG-PCL的比例（A）、水化溫度（B）、超聲時間（C）為考察因素，每個因素設(shè)定3個水平，以粒徑、CUR和DOX的平均包封率和平均載藥量為評價指標(biāo)。按照正交實驗設(shè)計表L9（34）設(shè)計實驗，因素水平表見表1。

表1 因素水平表Tab 1 Factor and level

2.5.2 正交實驗優(yōu)選制備工藝 按照表1的因素和水平進行實驗，考察膠束制備過程中藥物與PCLPEG-PCL的比例（A）、水化溫度（B）、超聲時間（C）對CUR/DOX micelle制備工藝的影響，最終測定各實驗樣品膠束的粒徑、包封率和載藥量。采用加權(quán)評分法分析實驗結(jié)果，設(shè)定膠束粒徑的加權(quán)系數(shù)為0.5，包封率為0.25，載藥量的加權(quán)系數(shù)為0.25，綜合評分值＝（粒徑最小值/粒徑×0.5+平均包封率/平均包封率最大值×0.25+平均載藥量/平均載藥量最大值×0.25）×100%。

正交實驗結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3，最終優(yōu)選的條件為A2B2C2，即藥物與PCL-PEGPCL投料比為1∶10，水化溫度為65℃，超聲時間為6 min。因此，CUR/DOX micelle的制備工藝為：稱取處方量的CUR、DOX（CUR∶DOX＝5∶1）和PCL-PEG-PCL（藥物與PCL-PEG-PCL投料比為1∶10），加入適量的二氯甲烷-丙酮混合溶液（1∶1）使其溶解后，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，直至在瓶底形成一層橘紅色的薄膜。加入適量去離子水，65℃水浴加熱水化。水化后于冰浴中探頭超聲處理處理6 min（250 W），過0.22 μm微孔濾膜除去游離CUR和DOX，即得。

表2 正交實驗設(shè)計及結(jié)果(n＝3)Tab 2 Orthogonal test design and results (n＝3)

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Variance analysis

2.5.3 處方工藝驗證 按照優(yōu)選工藝制備條件進行3批驗證實驗，結(jié)果圖1A顯示CUR/DOX micelle的粒徑為150.0 nm，PDI為0.0573±0.02，CUR載藥量為6.80%，包封率為85.21%，DOX載藥量為1.28%，包封率為82.92%。透射電鏡（TEM）觀察CUR/DOX micelle的形態(tài)特征，取少量CUR/DOX micelle滴至水化后的銅網(wǎng)上，靜置后濾紙吸干，2%的磷鎢酸負染，自然揮干，測定。TEM結(jié)果顯示CUR/DOX micelle為球形，大小均一，結(jié)果見圖1B。

2.6 CUR/DOX micelle穩(wěn)定性考察

將CUR/DOX micelle按體積比1∶1分別分散在去離子水和含10%胎牛血清的水溶液中，于0、2、4、6、8、12、24、36、48、72 h分別測定其粒徑，考察其穩(wěn)定性，見圖1C。結(jié)果顯示在水溶液中納米粒的粒徑穩(wěn)定在（151.19±1.23）nm，72 h內(nèi)粒徑RSD為0.81%；在含10%胎牛血清的水溶液中，納米粒的粒徑穩(wěn)定在（151.47±1.73）nm，72 h內(nèi)粒徑RSD為1.1%，表明在水溶液及含10%胎牛血清的水溶液中CUR/DOX micelle均具有較好的穩(wěn)定性。

圖1 CUR/DOX micelle的粒徑分布（A）、TEM（B）及穩(wěn)定性（C）Fig 1 Particle size（A），TEM photograph（B）and stability（C）of CUR/DOX micelle

2.7 CUR/DOX micelle的體外釋藥行為考察

采用透析法考察膠束的體外釋藥行為，為模擬正常體液環(huán)境和腫瘤細胞內(nèi)環(huán)境，選擇pH 7.4和pH 5.0的磷酸緩沖液（PBS）作為釋放介質(zhì)，為保障疏水藥物CUR和DOX的釋放介質(zhì)加入0.1%的吐溫80作為表面活性劑。分別取一定量CUR/DOX micelle置于預(yù)處理的透析袋中，兩端封口，浸于裝有釋放介質(zhì)的裝置中，釋放溫度為37℃，搖床轉(zhuǎn)速為120 r·min-1。定時取樣（1、2、4、8、10、12、24、36、48、72、96 h），取樣量為1 mL，取樣后補加相應(yīng)的PBS 1 mL。樣品按“2.2”項下方法分別測定，計算累積釋放率（n＝3）。以時間為橫坐標(biāo)，累積釋放率為縱坐標(biāo)繪制體外釋藥曲線，結(jié)果見圖2。由體外釋藥曲線可知，CUR/DOX micelle表現(xiàn)出較好的緩釋作用，在pH 7.4的釋放介質(zhì)中，CUR/DOX micelle中的CUR和DOX釋放速率比較慢，24 h時膠束的CUR的累積釋放率為49.38%，DOX的累積釋放率為40.09%，96 h 時CUR的累積釋放率為64.08%，DOX的累積釋放率為60.13%，而在pH 5.0的釋放介質(zhì)中，釋放速度明顯加快，96 h時CUR的累積釋放率為84.60%，DOX的累積釋放率為85.59%，上述結(jié)果表明，釋放介質(zhì)的pH值對CUR/DOX micelle影響較大，這有可能是低pH條件下膠束中脂溶性脫鹽DOX和CUR，尤其是脫鹽DOX在酸性條件下質(zhì)子化，溶解度升高，釋放加快。CUR/DOX micelle的這種pH 敏感釋藥行為可以減少DOX在體液循環(huán)中的釋放，增加其在酸性環(huán)境如腫瘤細胞內(nèi)的釋放。

圖2 CUR/DOX micelle的體外釋藥曲線Fig 2 Release profile of CUR/DOX micelle in vitro

2.8 細胞攝取考察

取對數(shù)生長期的MCF-7細胞，進行細胞計數(shù)并調(diào)整細胞密度，以5×104/孔的密度接種于24孔板中，進行攝取實驗。實驗設(shè)置分別設(shè)置CUR/DOX micelle組，游離脫鹽DOX組，并設(shè)空白對照組。給藥時棄去原培養(yǎng)基，加入含不同樣品及10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)基，每孔0.5 mL，確保DOX質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1。共孵育4 h，吸棄培養(yǎng)基，胰酶消化并離心收集細胞，冷PBS充分清洗3次，全程避光操作。最后加入PBS 0.5 mL重懸細胞，于流式細胞儀上檢測，測定細胞內(nèi)的熒光強度，并計算細胞攝取率，結(jié)果見圖3?？梢钥闯?，與空白對照組相比，游離脫鹽DOX組和CUR/DOX micelle組中的DOX均能進入細胞，游離DOX的攝取效率為73.9%，而CUR/DOX micelle組的攝取效率為82.1%，與游離脫鹽DOX組相比，CUR/DOX micelle組的攝取效率明顯提高，表明膠束包裹DOX后能顯著提高腫瘤細胞的攝取效果。

圖3 CUR/DOX micelle的細胞攝取Fig 3 Cellular uptake of CUR/DOX micelle

2.9 體外抗腫瘤活性評價

取對數(shù)生長期的MCF-7細胞，消化收集并調(diào)整密度，接種于96孔板中，密度為5×103/孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進行實驗。實驗設(shè)置空白對照組、空白納米粒組、游離CUR組、游離DOX組、單載CUR micelle組、單載DOX micelle組和CUR/DOX micelle組，CUR最終質(zhì)量濃度為：0、0.52、1.04、2.08、3.12、4.16、5.20、6.24、8.32、10.40 μg·mL-1，DOX最終質(zhì)量濃度為：0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0 μg·mL-1，空白納米粒組采用培養(yǎng)基按給藥組相同體積比例進行稀釋（n＝6）。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，加入5 mg·mL-1的MTT溶液20 μL繼續(xù)孵育4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加0.2 mL二甲基亞砜，震蕩儀震蕩1 min后，酶標(biāo)儀490 nm下測定吸光度值（OD），按以下公式計算細胞存活率：

細胞存活率（%）＝（實驗組平均OD值-空白納米粒組平均OD值）/（空白對照組平均OD值-空白納米粒組平均OD值）×100%。

實驗結(jié)果見圖4，空白納米粒組在相應(yīng)的濃度下對MCF-7細胞的生長無明顯毒性及抑制作用，可見載體PCL-PEG-PCL生物相容性較好。游離CUR組、游離DOX組、單載CUR micelle組、單載DOX micelle組和CUR/DOX micelle組均有不同程度的抑制腫瘤細胞生長作用，相較于游離DOX組、單載DOX micelle組和CUR/DOX micelle組，游離CUR組和單載CUR micelle組在相應(yīng)的給藥質(zhì)量濃度下（0.52～10.40 μg·mL-1）腫瘤細胞生長抑制作用較弱。通過擬合計算可知，游離DOX組的IC50為1.24 μg·mL-1，單載DOX micelle組的IC50為1.02 μg·mL-1，CUR/DOX micelle的IC50為0.79 μg·mL-1（以DOX給藥量濃度進行擬合計算），這表明聯(lián)合應(yīng)用CUR和DOX增強了藥物的抗腫瘤作用。

圖4 CUR/DOX micelle的細胞毒性Fig 4 Cytotoxicity test of CUR/DOX micelle

根據(jù)人乳腺癌MCF-7細胞在不同濃度的游離CUR、游離DOX和CUR/DOX micelle條件下的存活率，采用CompuSyn軟件分析聯(lián)合藥物指數(shù)（CI），結(jié)果見表4。從CompuSyn結(jié)果可知，抑制作用（Fa）為50%時CI值、75%CI值、90%CI值及95%CI值均小于1，表明CUR和DOX聯(lián)用具有協(xié)同作用。當(dāng)CUR質(zhì)量濃度大于5.2 μg·mL-1，DOX質(zhì)量濃度大于1 μg·mL-1時，隨著藥物濃度和抑制率的增加，CI值逐漸降低，這表明CUR和DOX協(xié)同作用逐漸增強。

表4 姜黃素和阿霉素的聯(lián)合藥物指數(shù)Tab 4 Combination index of curcumin and doxorubicin

2.10 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 9統(tǒng)計軟件進行分析，計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

聯(lián)合用藥是目前腫瘤治療的新方向，中藥活性成分與化療藥物的作用靶點不同，兩者聯(lián)用，從機制的互補、作用的協(xié)同、不良反應(yīng)的減輕等方面發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，提高治療效果。納米制劑的主要優(yōu)勢在于其能夠包裹溶解性差、穩(wěn)定性差的藥物并將藥物傳輸至體內(nèi)不同部位，降低藥物的毒副作用。采用納米技術(shù)共載化療藥物和中藥活性成分，能為中藥聯(lián)合化療藥物治療腫瘤提供新的思路。

本研究以PCL-PEG-PCL為載體，通過薄膜-水化-超聲法成功制備了CUR/DOX micelle，提高了CUR和DOX的有效利用度；有文獻報道，以PCL-PEG-PCL制備膠束時，PEG的分子量大小對納米膠束的載藥量、包封率和穩(wěn)定性影響比較大，相較于其他分子量的PEG（如PEG4000、PEG2000和PEG1000），PEG6000可以提供更加適宜的親水疏水比例，制備的膠束載藥量、包封率較高且穩(wěn)定性好[26-28]，故本研究選擇PEG6000作為親水端。在前期研究中，采用單因素實驗對PCLPEG-PCL分子量、藥物與PCL-PEG-PCL的比例、有機溶劑的比例、水化溫度、超聲功率、超聲時間等因素進行考察。在對PCL-PEG-PCL分子量的單因素實驗中分別考察了PCL4500-PEG6000-PCL4500、PCL10000-PEG6000-PCL10000和PCL8000-PEG6000-PCL8000，發(fā)現(xiàn)PCL8000-PEG6000-PCL8000制備的膠束最為合適；在正交實驗中，選擇對膠束制備影響較大的因素：藥物與PCL-PEG-PCL的比例、水化溫度和超聲時間作為考察因素進行優(yōu)化，得到粒徑合適，分布均勻，載藥量和包封率均較為理想的膠束；本文采用最優(yōu)制備工藝制得的CUR/DOX micelle的粒徑為（150.0±0.6）nm，大小均一；穩(wěn)定性考察結(jié)果表明，72 h內(nèi)膠束在去離子水和含10%胎牛血清的水溶液中穩(wěn)定性良好；體外釋放考察表明CUR/DOX micelle具有緩釋作用；細胞攝取結(jié)果表明，在相同濃度下相較于游離DOX，CUR/DOX micelle的入胞能力更強，這有利于更好地發(fā)揮抗腫瘤作用；體外實驗結(jié)果顯示，對于人乳腺癌MCF-7細胞，載體PCL-PEG-PCL無明顯的生長抑制作用，CUR/DOX micelle組的抑制作用強于游離CUR組、游離DOX組、單載CUR組和單載DOX組，這可能是CUR和DOX聯(lián)用共同發(fā)揮了抗腫瘤作用，并且制成膠束后有效地提高了藥物的入胞能力。采用CompuSyn 軟件分析聯(lián)合藥物指數(shù)，當(dāng)CUR質(zhì)量濃度大于5.2 μg·mL-1，DOX質(zhì)量濃度大于1 μg·mL-1時，CUR和DOX聯(lián)用具有協(xié)同作用。在后續(xù)的工作中，將進一步研究CUR/DOX micelle的活性及抗腫瘤作用機制，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。