基于UPLC-Q-Exactive-MS技術(shù)鑒定蒙藥蓽茇的化學(xué)成分

張弘，張慧文，張晨，劉宏，許佳綺，王煥蕓（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，呼和浩特 010110）

蓽茇又名蓽拔、畢勃、蓽撥梨，為胡椒科植物蓽茇PiperlongumL.的干燥近成熟或成熟果穗，收載于歷版《中國藥典》。國內(nèi)主產(chǎn)于云南、兩廣地區(qū)，國外主產(chǎn)于印度尼西亞、菲律賓、越南。蓽茇是藥食兩用中藥[1]，蒙醫(yī)體系中也常見它的身影，但中藥學(xué)和蒙藥學(xué)對蓽茇的藥性認(rèn)識和臨床應(yīng)用不盡相同，范圍亦有差異[2]。目前臨床上主要用于脘腹冷痛，嘔吐，泄瀉，寒凝氣滯，胸痹心痛，頭痛，牙痛?，F(xiàn)代植物化學(xué)研究表明，蓽茇中含有的化學(xué)成分以生物堿類和揮發(fā)油類成分為主[3]，同時含有少量黃酮類、有機(jī)酸類、萜類和甾醇類、氨基酸類以及微量無機(jī)元素等成分，其中酰胺類化合物為蓽茇的主要特征成分。蓽茇的藥理活性報道較多，但最新的研究側(cè)重于抗腫瘤、降脂、抗菌抗炎、抗抑郁和抗氧化等方面的作用[4]。

蓽茇的化學(xué)成分復(fù)雜，闡述其化學(xué)成分的文獻(xiàn)很少，且研究方法相對單一。因此，全面且快速鑒定蓽茇的化學(xué)成分很有必要。近年來，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)因其簡便、快捷與準(zhǔn)確等特點常應(yīng)用于中藥化學(xué)成分的分離鑒定中。因此本試驗采用UPLC-Q-Exactive-MS技術(shù)對蓽茇化學(xué)成分進(jìn)行分析，旨在探求其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，為其進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

Q-Exactive 高效液相色譜-四極桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀、UltiMate 3000 超高效液相色譜儀（美國Thermo公司）；AB 135-S 型十萬分之一分析天平（瑞士Metter Toledo公司）；CF1524R高速冷凍型微量離心機(jī)（美國SCILOGEX）；KQ-250 DA型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；WH-1微型渦旋混合儀（上海滬西分析儀器廠）；FDU2110型冷凍干燥機(jī)（東京理化器械株式會社）。

1.2 試藥

甲醇（色譜純，Thermo公司）；水為超純水。蓽茇（內(nèi)蒙古騰翔中藥飲片有限公司，批號：170701，產(chǎn)地內(nèi)蒙古，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室張慧文博士鑒定，均符合2020年版《中國藥典》一部規(guī)定）。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

取蓽茇藥材，粉碎過40目篩，稱取200 g蓽茇粉末，甲醇超聲提取3次，每次1 h，合并提取液，減壓濃縮后，冷凍干燥制成蓽茇凍干粉。精密稱取蓽茇凍干粉1 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，加入25 mL甲醇，稱定重量，超聲（功率100 W）處理20 min，放冷后補(bǔ)重，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液即得蓽茇供試品溶液。

2.2 分析條件

2.2.1 色譜條件 Welch Ultimate C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相：甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，55%A，5～25 min，55%～90%A，25～50 min，90%～100%A）；流速1 mL·min-1；檢測波長272 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量20 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜條件：離子源為HESI源；正、負(fù)離子模式同時檢測；正離子檢測模式下，輔助氣體輔助氣體體積流量30 L·min-1，噴霧電壓4.00 kV，離子傳輸管溫度300℃，輔助氣溫度100℃，碰撞能量（CE）45 eV；負(fù)離子模式下，輔助氣體體積流量30 L·min-1，噴霧電壓3.5 kV，離子傳輸管溫度300℃，輔助氣溫度100℃，CE為30 eV，檢測方式均為Full-MS/dd-MS2；Full MS分辨率70 000，dd-MS2分辨率17 500，掃描范圍m/z110～1000。

2.3 蓽茇數(shù)據(jù)庫的建立與分析鑒定

通過Compound Discoverer 3.0軟件對所檢測樣本的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行自動初步篩查，再查閱Chemspider數(shù)據(jù)庫和蓽茇化學(xué)成分的相關(guān)中英文文獻(xiàn)，收集整理蓽茇中已報道的化合物，將各化學(xué)成分進(jìn)行匯總，包括分子式、分子結(jié)構(gòu)式、相對分子質(zhì)量、分子離子、藥材來源、中英文名稱等，采用Xcalibur3.0軟件進(jìn)行峰提取、峰匹配等質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理方法，質(zhì)譜偏差范圍δ≤5×10-6，對目標(biāo)化合物進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，結(jié)合已有文獻(xiàn)信息[3，5-13]推測可能的化合物的裂解規(guī)律并進(jìn)行初步分析鑒定。

3 結(jié)果與討論

3.1 蓽茇藥材的UPLC-Q-Exactive-MS/MS鑒定

正、負(fù)離子模式下蓽茇的總離子流圖如圖1所示。通過參考相關(guān)文獻(xiàn)、對比保留時間、精確質(zhì)譜信息等，對蓽茇的化學(xué)成分進(jìn)行確認(rèn)，鑒定出57個可能的化學(xué)成分，包括16個A型酰胺類生物堿、13個B型酰胺類生物堿、9個C型酰胺類生物堿、10個D型酰胺類生物堿、3個E型酰胺類生物堿、6個O型化合物（4個酰胺化合物、1個羧酸、1個酯類化合物）。UPLC-Q-Exactive-MS/MS數(shù)據(jù)見表1。

圖1 正離子模式（A）和負(fù)離子模式（B）下蓽茇的總離子流圖Fig 1 Total ion flow chromatogram of Piperlongum L. in the positive（A）and negative ion mode（B）

表1 蓽茇化學(xué)成分結(jié)構(gòu)鑒定Tab 1 Structure identification of chemical components in Piperlongum L.

續(xù)表1

續(xù)表1

3.2 成分鑒定過程

蓽茇中的生物堿由不同的脂肪酸和胺部分組成，其中脂肪酸部分的差異集中在末端結(jié)構(gòu)（亞甲二氧基苯基和正戊基）；胺部分由哌啶、異丁胺或吡咯組成。根據(jù)構(gòu)成生物堿的兩部分之間的差異可以將生物堿分為6類，分別為Type A、Type B、Type C、Type D、Type E、Type O型，Type A～E型結(jié)構(gòu)見圖2。其中，Type O型為其他化合物。鑒于相似結(jié)構(gòu)具有相同的裂解規(guī)律，選擇Type A型和Type C型兩類成分進(jìn)行詳細(xì)說明。

圖2 Type A～E型結(jié)構(gòu)Fig 2 Structure of type A～E

3.2.1 Type A型 Type A型結(jié)構(gòu)為吡啶結(jié)合末端帶有亞甲二氧基苯的不飽和脂肪酸，其質(zhì)譜裂解特點為胺部分容易失去一個中性哌啶（C5H11N，85.0886 Da）或甲?；哙ぃ–6H11NO，113.0835 Da），其末端結(jié)構(gòu)易產(chǎn)生m/z161.0597[C10H8O2+H]+的丙烯基亞甲二氧基苯和m/z135.0440[C8H6O2+H]+的甲基亞甲二氧基苯，共發(fā)現(xiàn)16個A型酰胺類生物堿。以胡椒堿為例來說明鑒別過程。胡椒堿可能的裂解規(guī)律見圖3，二級質(zhì)譜圖見圖4。在正離子模式下檢測到m/z286.1449[M+H]+的分子離子峰，丟失C5H11N形成m/z201.0554的碎片離子，再丟失CO形成m/z173.0603的離子碎片，以及脂肪酸末端產(chǎn)生的m/z161.0604[C10H8O2+H]+的丙烯基亞甲二氧基苯和m/z135.0446[C8H6O2+H]+的甲基亞甲二氧基苯。結(jié)合化合物的分子式、裂解規(guī)律、碎片信息及比對結(jié)果，確認(rèn)化合物為胡椒堿[8]。

圖3 胡椒堿的質(zhì)譜裂解途徑Fig 3 Fragmentation pathway of piperine

圖4 胡椒堿的二級質(zhì)譜圖Fig 4 MS/MS spectrum of piperine

3.2.2 Type B型 Type B型結(jié)構(gòu)為異丁胺結(jié)合末端帶有亞甲二氧基苯的不飽和脂肪酸，與Type A型結(jié)構(gòu)相比，其質(zhì)譜裂解特點為胺部分容易失去1個中性異丁胺（C4H11N，73.0886 Da）或甲?；惗“罚–5H11NO，101.0835 Da），其末端結(jié)構(gòu)的裂解模式與Type A型相同，共發(fā)現(xiàn)13個B型酰胺類生物堿。3.2.3 Type C型 Type C型結(jié)構(gòu)為異丁胺結(jié)合末端結(jié)構(gòu)為正戊基的不飽和脂肪酸，其質(zhì)譜裂解特點為胺部分容易失去1個中性異丁胺（C4H11N，73.0886 Da），有時會伴隨脫羰基（CO，27.9943 Da），也會產(chǎn)生一系列烷基碎片（并不是特征碎片），結(jié)構(gòu)中有共軛雙鍵，易發(fā)生α裂解脫烷基，共發(fā)現(xiàn)9個C型酰胺類生物堿。以N-isobutyl-（2E，4E）-dodecadienamide為例來說明鑒別過程。N-isobutyl-（2E，4E）-dodecadienamide可能的裂解規(guī)律見圖5，二級質(zhì)譜圖見圖6。在正離子模式下檢測到m/z252.2334 [M+H]+的分子離子峰，丟失C4H8形成m/z196.1706的碎片離子，再丟失NH3形成m/z179.1439的離子碎片，脂肪酸部分經(jīng)過α裂解丟失C6H12后產(chǎn)生m/z168.1386[C10H17NO+H]+的碎片離子。結(jié)合化合物的分子式、裂解規(guī)律、碎片信息及比對結(jié)果，確認(rèn)化合物為N-isobutyl-（2E，4E）-dodecadienamide[8]。

圖5 N-isobutyl-（2E，4E）-dodecadienamide的質(zhì)譜裂解途徑Fig 5 Fragmentation pathway of N-isobutyl-（2E，4E）-dodecadienamide

圖6 N-isobutyl-（2E，4E）-dodecadienamide的二級質(zhì)譜圖Fig 6 MS/MS spectrum of N-isobutyl-（2E，4E）-dodecadienamide

3.2.4 Type D型 Type D型結(jié)構(gòu)為哌啶結(jié)合末端結(jié)構(gòu)為正戊基的不飽和脂肪酸，與Type C型結(jié)構(gòu)相比，其質(zhì)譜裂解特點為胺部分容易失去1個中性哌啶（C5H11N，85.0886 Da），有時會伴隨脫羰基（CO，27.9943 Da），結(jié)構(gòu)中有共軛雙鍵，則易發(fā)生α裂解脫烷基，共發(fā)現(xiàn)10個D型酰胺類生物堿。

3.2.5 Type E型 Type E型結(jié)構(gòu)為吡咯烷結(jié)合末端帶有苯并二氧雜環(huán)的不飽和脂肪酸，與Type A型結(jié)構(gòu)相比，此類結(jié)構(gòu)中胺部分容易失去1個中性吡咯（C4H9N，71.0729 Da）或甲酰基吡咯（C5H9NO，99.0678 Da），其末端結(jié)構(gòu)的裂解模式與Type A型相同，共發(fā)現(xiàn)3個E型酰胺類生物堿。

3.2.6 Type O型 除Type A～E外的結(jié)構(gòu)統(tǒng)稱為O型結(jié)構(gòu)，共發(fā)現(xiàn)6個O型化合物（4個酰胺化合物、1個羧酸、1個酯類化合物）。O型化合物的裂解規(guī)律基本相似，易在碳碳單鍵與碳碳雙鍵間裂解，區(qū)別主要在官能團(tuán)上。酰胺類化合物易失去哌啶，后繼續(xù)丟失一分子CO；而環(huán)內(nèi)酰胺則易失去CO；羧酸易先失去一分子羥基，進(jìn)一步失去CO；酯類化合物先失去烷氧基后，又失去CO。此外，甲氧基也容易離去。O型化合物可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖7。

圖7 O型化合物的質(zhì)譜裂解途徑Fig 7 Fragmentation pathway of type O compounds

4 結(jié)論

本試驗以甲醇為提取溶劑，分別考察了蓽茇回流和超聲兩種提取方式對提取的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲提取的峰容量更大，提取更完全；本試驗還考察了流動相中甲酸的含量對提取的影響，當(dāng)不加入甲酸時，以胡椒堿為代表的生物堿類成分出現(xiàn)峰分離度低及拖尾等現(xiàn)象，為避免此類現(xiàn)象發(fā)生，選用了甲醇-0.1%甲酸水為流動相。

本文建立了一種基于UPLC-Q-Exactive-MS技術(shù)的快速、靈敏、可靠的鑒定蓽茇化學(xué)成分的方法，目的是探求該中藥發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，為后續(xù)課題組進(jìn)行藥物代謝動力學(xué)和藥效學(xué)研究提供參考，從而更好地研究其作用機(jī)制。