醋酸亮丙瑞林聚乳酸-羥基乙酸共聚物微球的處方優(yōu)化及評價

郭玉賢，劉磊，鄭明秀，郭作娟，梁榮財，2*（.煙臺大學藥學院，煙臺大學新型制劑與生物技術藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心，分子藥理和藥物評價教育部重點實驗室（煙臺大學），山東 煙臺 264005；2. 山東綠葉制藥有限公司長效和靶向制劑國家重點實驗室，山東 煙臺 264003）

微球作為一類長效注射劑，通過將藥物分散或包裹在生物可降解材料中，保護藥物不被酶降解，實現緩釋和控釋給藥，提高藥物在體內的耐受性和患者的依從性，以獲得良好的治療效果[1-2]。生物可降解高分子材料因其療效好、毒性低而被用于微球的制備[3]。其中聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）可以通過改變其組成、相對分子質量和化學結構來調節(jié)藥物的釋放，是目前應用最廣泛的緩釋微球骨架材料[4]。

醋酸亮丙瑞林是一種促黃體生成激素釋放激素類似物，為水溶性九肽，具有高效的垂體-性腺系統(tǒng)抑制作用，可用于治療激素敏感型前列腺癌、乳腺癌、子宮內膜異位癥等疾病[5]。醋酸亮丙瑞林具有親水性、易被酶降解、pH敏感的物理化學性質，因此存在生物利用度低、生物半衰期短等缺點，需頻繁、長期給藥[6-7]，將其開發(fā)成長效注射劑非常必要[8-9]。自美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）于1989年批準以來，醋酸亮丙瑞林PLGA微球已成為現代長效釋放基準產品，是國內外研究的熱點[10]。

本研究采用W1/O/W2乳化溶劑揮發(fā)法制備醋酸亮丙瑞林PLGA微球，通過Box-Behnken響應面法優(yōu)化處方，以制備粒徑較小，包封率較高的微球，并對其粒徑、載藥量、包封率、表面形態(tài)、藥物穩(wěn)定性、體外加速釋放行為等進行表征，為醋酸亮丙瑞林PLGA微球工業(yè)化大規(guī)模生產的處方設計提供參考。

1 材料

IKA高速均質機（德國IKA公司）；高速剪切分散乳化機（上海依卡機電制造有限公司）；高效液相色譜儀LC25（Agilent公司）；馬爾文3000粒度儀（Malvern Instruments公司）；EM-30型掃描電鏡（韓國Coxem公司）；GL21M高速冷凍離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司）；電動攪拌器（德國IKA公司）；pH計（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；冷凍干燥機（寧波新芝凍干設備股份有限公司）；SHZ-88水浴恒溫振蕩器（江蘇金怡儀器科技有限公司）；圓二色譜儀（Applied Photophysics Ltd公司）。

醋酸亮丙瑞林（中肽生化有限公司）；二氯甲烷（南京化學試劑股份有限公司，分析純）；PLGA（7525 2A，山東綠葉制藥有限公司）；聚乙烯醇（PVA，德國Merck公司）；吐溫20（國藥集團化學試劑有限公司）；其余試劑均為色譜純。

SD大鼠，雄性，體質量（200±20）g [濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（魯）20190003]。將大鼠圈養(yǎng)在（22±1）℃且12 h光照/黑暗循環(huán)的標準環(huán)境中飼養(yǎng)，并提供標準的飲食和水。所有動物實驗均在煙臺大學動物實驗倫理委員會的指導原則下進行，符合歐盟指令2010/63/EU和國際實驗動物評估和認可委員會的要求。

2 方法

2.1 高效液相色譜條件

色譜柱：Agilent C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-三乙胺/磷酸鹽緩沖溶液（15.2 g三乙胺溶于800 mL超純水中，用磷酸調節(jié)pH 3.0，然后稀釋至1000 mL）＝24∶76；柱溫：30℃；流速：1 mL·min-1；檢測波長：220 nm；進樣量：20 μL[11]。醋酸亮丙瑞林的保留時間為8.79 min。

2.2 醋酸亮丙瑞林PLGA微球的制備

采用W1/O/W2乳化溶劑揮發(fā)法制備醋酸亮丙瑞林PLGA微球。將PLGA溶于二氯甲烷中形成油相（O），醋酸亮丙瑞林溶于水中，形成內水相（W1）。將油相加入內水相中，在冰水浴條件下21 600 r·min-1均質3 min 50 s，形成初乳（W1/O）。將初乳緩慢加入到1% PVA（W2），在高速剪切分散機的作用下，剪切2 min，形成復乳（W1/O/W2）。轉移至恒溫攪拌器中固化3 h，以除去大部分二氯甲烷。將所得溶液過180目篩網，離心水洗3次，冷凍干燥后收球。

2.3 Box-Behnken響應面法優(yōu)化微球處方

通過前期單因素實驗的考察，采取三因素三水平Box-Behnken響應面設計對微球粒徑、包封率影響較為顯著的三個因素進行處方優(yōu)化。以理論載藥量、PVA體積分數[φ（PVA）]、水油相比例（水油比）為自變量，以粒徑（Y1）、包封率（Y2）為響應指標。每個自變量選擇三個水平，如表1所示。

表1 Box-Behnken響應面設計因素及水平Tab 1 Factor and level of Box-Behnken response surface

按照Box-Behnken響應面法設計原理，17次實驗設計方案及數據處理結果如表2所示，使用Design-Expert軟件對各項實驗數據擬合分析，得到的多項式模型如下：

表2 Box-Behnken響應面設計及其結果Tab 2 Design and response value of Box-Behnken response surface

①Y1：Y1＝44.18+11.56A-12.11B-5.78C-2.32AB-4.00AC+1.50BC-3.29A2-3.84B2-2.51C2（R2＝0.9922）。

②Y2：Y2＝93.79+4.50A+1.64B+4.71C+0.40AB-3.91AC-0.91BC-10.79A2-1.55B2+0.30C2（R2＝0.9911）。

對模型進行顯著性檢驗及方差分析，結果如表3、4所示。Y1、Y2模型的F均較大（分別為98.88、86.97），P均小于0.0001，表明模型回歸性顯著；模型失擬項的P均大于0.05，表明失擬項不顯著，模型擬合度較高，可用于描述各因素與響應指標之間的關系。Y1、Y2模型的R2均大于0.9000（分別為0.9922、0.9911），表明模型相關性良好，可有效預測實驗結果。

表3 粒徑的響應面方差分析結果Tab 3 Variance analysis of particle size

根據擬合方程繪制三維響應曲圖，進一步分析各因素與響應指標之間的相互作用，響應曲圖越陡峭，表明該因素影響越顯著。圖1為粒徑的響應面圖，可以看出微球粒徑隨著φ（PVA）和水油比的增加呈現逐漸減小的趨勢，隨著理論載藥量的增加呈現逐漸增大的趨勢。結合表3可知，各因素對粒徑響應值的影響依次為B＞A＞C。

圖1 各因素對粒徑影響的響應面圖Fig 1 Response surface of the effect of various factors on the particle size

圖2為包封率的響應面曲圖?？梢钥闯鑫⑶虬饴孰S理論載藥量的增加先增大后減小，隨水油比的增加而增大，隨φ（PVA）的增加而減小。結合表4可知，各因素對包封率響應值的影響依次為A＞C＞B。

表4 包封率的響應面方差分析結果Tab 4 Variance analysis of encapsulation efficiency

圖2 各因素對包封率影響的響應面圖Fig 2 Response surface of the effect of various factors on the encapsulation efficiency

2.4 最佳工藝的驗證

得到軟件模擬出的制備微球的最優(yōu)處方為：理論載藥量為7.59%，φ（PVA）為2%，水油比為200∶1。預測響應值：粒徑為20.04 μm，包封率為97.16%。按最優(yōu)處方制備的3批微球平均粒徑為（20.81±1.34）μm，包封率為（95.88±1.56）%，預測值與實際值較為接近，說明該模型可有效預測實驗結果。

2.5 微球的評價

2.5.1 粒徑的測定 稱取適量制備的微球，以超純水為分散介質，超聲1 min，使其分散均勻，測定其粒徑。3批微球的粒徑分別為20.89、20.54、21.01 μm，PDI分別為2.00、2.11、2.63，粒徑分布圖見圖3。

圖3 3批醋酸亮丙瑞林PLGA微球的粒徑分布圖Fig 3 Particle size distribution of 3 batches of leuprolide acetate PLGA microspheres

2.5.2 載藥量和包封率的測定 精密稱取10 mg微球，溶于少量乙腈中，超聲使其溶解，用水稀釋定容至10 mL，離心收集上清液，按“2.1”項下色譜條件測定醋酸亮丙瑞林的含量。分別以下式計算其載藥量和包封率：

載藥量（%）＝微球中醋酸亮丙瑞林的重量/微球總重量×100%

包封率（%）＝實際載藥量/理論載藥量×100%

按最優(yōu)處方制得的3批微球的平均載藥量為（7.28±0.27）%，包封率為（95.88±1.56）%。

2.5.3 表面形態(tài) 將適量微球粉末分散固定于導電膠上，真空狀態(tài)下噴金后放置于掃描電鏡中觀察微球的表面形態(tài)，結果如圖4所示。醋酸亮丙瑞林PLGA微球呈球形，表面圓整，且孔道較多。

圖4 醋酸亮丙瑞林PLGA微球的表面形態(tài)Fig 4 Surface morphology of leuprolide acetate PLGA microspheres

2.5.4 藥物的穩(wěn)定性 精密稱取適量醋酸亮丙瑞林原料藥及PLGA微球，以乙腈-水為溶劑，配制成一定濃度的溶液，比較其高效液相色譜圖和圓二色譜圖。前者可以提供不同衍生物的定性信息，后者可以顯示二級結構的變化[12]。由圖5可知，提取出的藥物與原料藥的色譜圖沒有顯著差別，表明微球制備過程不影響藥物的化學完整性，不存在衍生化產物。圓二色譜圖也沒有明顯的區(qū)別，199 nm和228 nm附近分別有一個負峰和一個正峰，其二級結構不受影響（見圖6）。因此，醋酸亮丙瑞林的生物穩(wěn)定性得到了較好的保留。

圖5 原料藥與醋酸亮丙瑞林PLGA微球的高效液相色譜圖Fig 5 HPLC of API and leuprolide acetate PLGA microspheres

圖6 原料藥與醋酸亮丙瑞林PLGA微球的圓二色譜圖Fig 6 CD spectra of API and leuprolide acetate PLGA microspheres

2.5.5 體外加速釋放 精密稱取20 mg微球置于25 mL離心管中，加入5 mL 5%（V/V）甲醇水溶液，在45℃、50 r·min-1條件下振蕩釋放。分別在2 h、8 h、24 h、2 d、3 d、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d、11 d、13 d取樣，離心，取出4 mL上清液，同時補加相同體積的釋放介質。按“2.1”項下條件測定醋酸亮丙瑞林含量，計算其累計釋放量，以時間為橫坐標，累計釋放度為縱坐標，繪制其累計釋放曲線，結果見圖7。醋酸亮丙瑞林PLGA微球在5%甲醇水中的釋放呈雙相特征。

圖7 醋酸亮丙瑞林PLGA微球的體外累計釋放曲線Fig 7 In vitro cumulative release profiles of leuprolide acetate PLGA microspheres

以零級釋藥模型、一級釋藥模型、Higuchi模型和Korsmeyer-Peppas模型分別對制備的醋酸亮丙瑞林PLGA微球體外累計釋放曲線進行擬合，探究其釋藥機制，結果見表5。各擬合方程的相關性依次為：一級釋藥模型（R2＝0.9946）＞Korsmeyer-Peppas模型（R2＝0.9716）＞Higuchi模型（R2＝0.9706）＞零級釋藥模型（R2＝0.8418），因此藥物在微球中的釋放行為可用一級釋藥模型評價，表明微球呈濃度依賴性[13]。

表5 醋酸亮丙瑞林PLGA微球釋藥行為擬合方程Tab 5 Fitting equation of drug release behavior of leuprolide acetate PLGA microspheres

2.5.6 生物相容性 將8只SD大鼠隨機分為4組，對背部進行脫毛處理，范圍為2 cm×2 cm。A、B兩組作為對照組，皮下注射生理鹽水；C、D兩組作為實驗組，皮下注射醋酸亮丙瑞林PLGA微球。在注射后的4 d和25 d分別處死大鼠，取出注射部位的組織，制備成石蠟切片，并用蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察大鼠的皮膚在注射部位上的差異。結果對照組和實驗組注射部位外觀無明顯變化，皮膚組織無明顯炎癥反應，表明所制備的微球具有良好的生物相容性（見圖8）。

圖8 SD大鼠皮下注射生理鹽水（A和B）、微球（C和D）后注射部位HE染色結果（×40）Fig 8 HE staining at the injection site after subcutaneous injection of normal saline（A and B）and microspheres（C and D）（×40）

3 討論

微球因其巨大的工業(yè)價值和廣闊的應用前景，已成為藥劑學研究熱點之一，但我國鮮有相關產品上市，醋酸亮丙瑞林微球作為國內首個上市的微球產品，其工業(yè)化規(guī)模尚有待擴大[14-15]。本研究采用Box-Behnken響應面法對醋酸亮丙瑞林PLGA微球處方進行優(yōu)化，通過多元二次回歸方程來擬合相關因素與響應值之間的函數關系，得到最優(yōu)處方的實測值與預測值較為接近，說明響應面法優(yōu)化微球處方合理可行，準確度高，重現性良好。

本研究選用粒徑和包封率作為響應值能直觀反映微球制備工藝。三個因素中，φ（PVA）和理論載藥量對粒徑的影響更大，這是由于φ（PVA）的增加使得外水相黏度增加，液滴聚結減少，形成更小的液滴；另一方面理論載藥量增加，引起內水相黏度增加，乳滴變大，微球粒徑隨之增大[16]。理論載藥量和水油比對包封率的影響更大，這是由于理論載藥量增加，藥物被包封的概率也隨之增加，但同時初乳濃度梯度逐漸增大，促使藥物流失到外水相中；另一方面，隨著外水相體積的增加，有機溶劑接觸到的水體積增加，從而使聚合物聚結速度更快，限制了藥物的外溢，使更多藥物保留在微球中[9]。

體外釋放行為是評價微球性質的關鍵性參數。注射用雙羥萘酸曲普瑞林使用的釋放介質為5%甲醇水溶液。由于亮丙瑞林和曲普瑞林同為促性腺激素釋放激素類似物，其釋放行為可能具有相似性[17]。因此，本研究選擇5%甲醇水作為釋放介質。醋酸亮丙瑞林PLGA微球的釋放可分為兩個階段，前期快速釋放階段可能是因為微球表面藥物的快速溶解，此時微球的釋放機制為擴散作用[18]；后期藥物的釋放可能是由于PLGA的降解，微球骨架結構被逐漸破壞，藥物通過孔道和骨架的溶蝕逐漸從微球內部擴散到介質中[19]。

本研究所制備出的醋酸亮丙瑞林PLGA微球包封率高，藥物穩(wěn)定性和生物相容性良好，可為其工業(yè)化生產的處方設計提供參考，但其生物有效性有待進一步研究。