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    芹菜素納米膠束的制備工藝優(yōu)化及質(zhì)量評(píng)價(jià)

    2023-04-01 05:29:04劉雄英周韻秋于恩江典成陽(yáng)冉夢(mèng)楠典靈輝廣東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院廣東東莞523808
    中南藥學(xué) 2023年2期
    關(guān)鍵詞:磁力藥量芹菜

    劉雄英,周韻秋,于恩江,典成陽(yáng),冉夢(mèng)楠,典靈輝(廣東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,廣東 東莞 523808)

    芹菜素(apigenin,API,4',5,7-三羥基黃酮)是一種天然存在的黃酮類(lèi)化合物,無(wú)毒,具有抗氧化、抗炎、神經(jīng)保護(hù)、抗腫瘤等藥理作用[1-2],能抑制乳腺癌、肺癌、肝癌等多種類(lèi)型腫瘤細(xì)胞的增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,發(fā)揮抗腫瘤作用[3-4]。然而芹菜素屬于生物藥劑學(xué)分類(lèi)系統(tǒng)Ⅱ類(lèi)藥物(即低溶解性和高滲透性),它在pH 1.0、6.8和7.5下的溶解度分別為1.43、1.56和2.16 μg·mL-1,其水溶性較差、腸道吸收少,生物利用度較低[5],這影響了其在體內(nèi)發(fā)揮活性,限制了臨床應(yīng)用。

    提高芹菜素的溶解度和口服生物利用度的方法有很多,比如制備成納米顆粒、脂質(zhì)體、納米乳劑等,但作用效果不顯著[6]。而納米膠束作為一種新型的納米藥物遞送系統(tǒng),具有載藥范圍廣、組織滲透性好等優(yōu)點(diǎn),且能提高難溶性藥物的溶解度和控制藥物釋放,具有更好的應(yīng)用前景[7-9]。聚乙烯己內(nèi)酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物(Soluplus)是一種兩親性非離子型共聚物,其兩親性結(jié)構(gòu)可在溶液中自組裝形成納米膠束,可以將難溶性藥物溶于疏水核心,提高難溶性藥物的溶解度[10-11],具有較低的臨界膠束濃度(6.44×10-8mol·L-1),在水中易形成穩(wěn)定的膠束。Soluplus的疏水結(jié)構(gòu)具有羰基,能與具有羥基的化合物形成氫鍵,增強(qiáng)納米膠束的穩(wěn)定性[12]。D-α生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯(TPGS)是一種非離子表面活性劑、增溶劑、吸收促進(jìn)劑,能顯著促進(jìn)難溶性藥物的溶解度及其在體內(nèi)的吸收[13]。TPGS常與其他材料制備混合膠束或納米粒,增強(qiáng)單一膠束的穩(wěn)定性,并能形成功能化納米膠束,促進(jìn)藥物的吸收,增強(qiáng)藥物治療效果[14]。

    因此,本試驗(yàn)以Soluplus為納米載體材料,采用薄膜分散法制備芹菜素納米膠束(apigeninloaded soluplus nanomicelles,API-PMs),用響應(yīng)面法對(duì)其制備工藝進(jìn)行優(yōu)化,并考察其體外釋放特性,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用芹菜素奠定基礎(chǔ)。

    1 材料

    1.1 儀器

    UM-4T磁力攪拌器(北京憂晟聯(lián)合科技有限公司),KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆明市超聲儀器有限公司),SZ-100納米粒度分析儀(日本HORIBA公司),UV-650型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司),WQF-510A型傅里葉變換紅外光譜儀(北京瑞利分析儀器有限公司),RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

    1.2 試藥

    芹菜素(批號(hào):CAS 520-36-5,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、D-α生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯(TPGS,批號(hào):CAS 9002-96-4)(美國(guó)Sigma公司),聚乙烯己內(nèi)酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物(Soluplus,批號(hào):84414368E0,德國(guó)BASF公司),Tween80(化學(xué)純,天津市富宇精細(xì)化工有限公司),甲醇、無(wú)水乙醇(分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠)水為超純水。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 芹菜素含量測(cè)定

    2.1.1 芹菜素紫外檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 取適量芹菜素配制芹菜素乙醇溶液,用紫外分光光度計(jì)在200~600 nm內(nèi)掃描,確定芹菜素的檢測(cè)波長(zhǎng)為336 nm,且各輔料對(duì)芹菜素的測(cè)定無(wú)干擾。

    2.1.2 線性關(guān)系和方法學(xué)考察 分別配制質(zhì)量濃度為 1、2、5、10、20、30、40、50 μg·mL-1的芹菜素乙醇溶液,測(cè)定吸光度(A),以芹菜素質(zhì)量濃度(C,μg·mL-1)為橫坐標(biāo),A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得標(biāo)準(zhǔn)曲線A=0.0766C+0.0102,r=0.9999,線性范圍為1~50 μg·mL-1。低、中、高濃度(5、20、50 μg·mL-1)的芹菜素乙醇溶液日內(nèi)精密度的RSD分別為 1.1%、0.79%、1.6%(n=3),日間精密度的RSD分別為1.8%、0.56%、1.5%(n=3),平均回收率分別為105.2%、103.4%、100.8%,RSD分別為1.8%、0.40%、1.5%(n=3),表明本方法的儀器精密度和回收率良好。

    2.2 API-PMs的制備及處方工藝的優(yōu)化

    2.2.1 API-PMs的制備 采用薄膜分散法制備,稱取適量芹菜素和Soluplus于茄形瓶中,加適量無(wú)水乙醇完全溶解,于50℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮去有機(jī)溶劑,使其在瓶壁上形成一層均勻的含藥薄膜;再將一定量的TPGS水溶液加入茄形瓶中,渦旋,磁力攪拌一定時(shí)間,經(jīng)過(guò)0.22 μm微孔濾膜,得淡黃色透明乳光的API-PMs溶液。

    2.2.2 單因素試驗(yàn) 其他條件不變,分別對(duì)芹菜素投藥量(1.0、1.5、2.0、2.5、3 mg)、TPGS濃度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·mL-1)、磁力攪拌時(shí)間(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h)、磁力攪拌速度(400、500、600、700、800 r·min-1)進(jìn)行單因素試驗(yàn),采用紫外分光光度計(jì)和納米粒度分析儀測(cè)定膠束的包封率和粒徑的變化。

    結(jié)果如圖1所示,芹菜素投藥量對(duì)納米膠束粒徑影響較大,隨著投藥量的增加,粒徑逐漸增大,而包封率緩慢減??;當(dāng)投藥量在1.5 mg時(shí)具有最大包封率。隨著TPGS濃度的增加,粒徑無(wú)明顯變化,包封率則緩慢增大;當(dāng)TPGS濃度為0.4 mg·mL-1時(shí),包封率最大。隨著磁力攪拌時(shí)間的增加,粒徑無(wú)明顯變化,包封率在攪拌時(shí)間為3 h時(shí)最大。隨著磁力攪拌速度的增大,粒徑無(wú)明顯變化,當(dāng)磁力攪拌速度為700 r·min-1時(shí),包封率最大。

    圖1 單因素對(duì)納米膠束包封率和粒徑的影響Fig 1 Effect of single factor on the encapsulation efficiency and particle size of API-PMs

    2.2.3 Box-Behnken設(shè)計(jì)(BBD)-響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化納米膠束的制備工藝

    ① BBD 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果:根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,采用BBD響應(yīng)面法來(lái)進(jìn)行制備工藝優(yōu)化,以投藥量(A)、TPGS濃度(B)、磁力攪拌速度(C)和磁力攪拌時(shí)間(D)為因素,并以包封率、載藥量和粒徑為響應(yīng)值進(jìn)行試驗(yàn),試驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用軟件Design-Expert 8.0.6分析處理,因素與水平見(jiàn)表1。

    表1 因素與水平Tab 1 Factor and level

    由于試驗(yàn)設(shè)計(jì)包括包封率、載藥量和粒徑三個(gè)指標(biāo)評(píng)價(jià),因此可采用多指標(biāo)數(shù)據(jù)總評(píng)歸一值(overall desirability,OD)法,對(duì)取值越小越好的指標(biāo)(粒徑)和取值越大越好的指標(biāo)(包封率和載藥量),采用Hassan 方法,通過(guò)計(jì)算各個(gè)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)“歸一值”的幾何平均值,得到綜合評(píng)價(jià)的“歸一值”[15]。故以O(shè)D為響應(yīng)變量(Y),結(jié)果見(jiàn)表2。

    表2 BBD響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab 2 BBD response surface experiment design and results

    ② 模型擬合及方差分析: 以O(shè)D值為響應(yīng)值,利用Design Expert 8.0.6軟件分別對(duì)各因素多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合,得到OD值對(duì)A、B、C、D四個(gè)因素的二項(xiàng)式回歸方程:

    OD=0.92-0.31A+0.035B-1.944×10-3C+0.018D+0.11AB-0.016AC+0.022AD+7.34110-3BC+0.018BD-1.657×10-3CD-0.5A2+0.063B2-0.019C2-8.526×10-3D2

    響應(yīng)面模型對(duì)OD值的方差分析結(jié)果如表3所示,模型P值小于0.0001,表明該模型是顯著的;失擬項(xiàng)P值大于0.05,不顯著,說(shuō)明模型方程擬合程度好,可以用此模型對(duì)制備工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè);并且模型中參數(shù)A、AB、A2和B2都是顯著的,對(duì)比所有因素的F值大小,得出影響制備工藝的因素強(qiáng)弱排序?yàn)橥端幜浚綯PGS濃度>磁力攪拌時(shí)間>磁力攪拌速度。

    表3 響應(yīng)面模型對(duì)OD值的方差分析結(jié)果Tab 3 Variance analysis of response surface model on OD value

    ③ 響應(yīng)面交互作用結(jié)果分析與預(yù)測(cè):為了進(jìn)一步研究不同因素之間交互作用以及確定最優(yōu)工藝處方參數(shù),通過(guò)Design-Expert 8.0.6軟件繪制出OD值隨著不同因素交互作用變化的三維響應(yīng)面圖。結(jié)果見(jiàn)圖2,可知,OD存在最大值,經(jīng)軟件分析篩選,得到最優(yōu)工藝處方參數(shù)為投藥量1.89 mg,TPGS濃度為0.49 mg·mL-1,磁力攪拌速度為662.97 r·min-1,磁力攪拌時(shí)間為2.26 h,預(yù)測(cè)粒徑為57.1 nm,包封率為99.35%,OD為1.04。

    圖2 四個(gè)因素相互作用的三維響應(yīng)面圖Fig 2 Three-dimensional response surface of interaction of 4 factors

    ④ 最優(yōu)制備工藝處方的驗(yàn)證:綜合實(shí)際情況,確定芹菜素投藥量2 mg,TPGS質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1,磁力攪拌速度為700 r·min-1,磁力攪拌時(shí)間為2.5 h,平行3次試驗(yàn),測(cè)定包封率、載藥量和粒徑。結(jié)果見(jiàn)表4,實(shí)際測(cè)得OD值與預(yù)測(cè)OD值基本接近,RSD為1.0%,表明該方法預(yù)測(cè)的最優(yōu)工藝處方參數(shù)可靠,可用于該制備處方工藝優(yōu)化。

    表4 制備工藝驗(yàn)證結(jié)果Tab 4 Verification of preparation process

    2.3 API-PMs的質(zhì)量評(píng)價(jià)

    2.3.1 包封率和載藥量測(cè)定 精密吸取50 μL納米膠束溶液,加無(wú)水乙醇破乳并稀釋至5 mL,按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定藥物的含量,平行測(cè)定3次。計(jì)算包封率和載藥量:包封率(%)=(包封的藥物質(zhì)量/加入的藥物質(zhì)量)×100%,載藥量(%)=(包封的藥物質(zhì)量/膠束和藥物總質(zhì)量)×100%。計(jì)算得出膠束中芹菜素的包封率和載藥量分別為(93.49±1.28)%和(4.45±0.06)%。

    2.3.2 粒徑測(cè)定 取API-PMs溶液適量,加水稀釋后用納米粒度分析儀測(cè)量粒徑大小,平行測(cè)定3組,結(jié)果如圖3所示,測(cè)得的API-PMs粒徑為(62.8±1.1)nm,表明制備的納米膠束粒徑小且分布均勻。

    圖3 API-PMs的粒徑分布圖Fig 3 Particle size distribution of API-PMs

    2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將API-PMs溶液置于室溫,分別在第0、7、14、21、28日測(cè)定膠束的包封率和粒徑,結(jié)果包封率和粒徑RSD分別為1.5%和1.8%,表明納米膠束在室溫條件下28 d內(nèi)是比較穩(wěn)定的。

    2.3.4 傅里葉變換紅外光譜法(FTIR) 將芹菜素原料藥(API)、空白納米膠束凍干樣品(PMs)、芹菜素原料藥與空白納米膠束的物理混合物凍干樣品、芹菜素納米膠束(API-PMs)凍干樣品,分別與一定量的溴化鉀混合均勻,壓片,測(cè)定400~4000 cm-1內(nèi)樣品的紅外光譜圖,如圖4所示,芹菜素原料藥的O-H特征吸收峰(3278 cm-1)和C=O特征吸收峰(1654 cm-1,1608 cm-1),芹菜素原料藥與空白納米膠束的物理混合物的紅外光譜中,既有空白納米膠束的特征吸收峰,也有芹菜素原料藥的特征吸收峰;芹菜素納米膠束出現(xiàn)的C=O特征吸收峰(1735 cm-1,1631 cm-1)相比空白納米膠束出現(xiàn)C=O的特征吸收峰(1737 cm-1,1639 cm-1),位移發(fā)生了改變,這表明在芹菜素納米膠束中,芹菜素分子中的羥基與納米膠束疏水結(jié)構(gòu)中的羰基之間形成了氫鍵。

    圖4 納米膠束的紅外光譜圖Fig 4 Infrared spectra of nanomicelles

    2.3.5 體外釋放試驗(yàn) 在參考文獻(xiàn)[16]和預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用動(dòng)態(tài)透析袋法考察API-PMs中芹菜素的釋放行為。分別取1 mL API溶液和1 mL API-PMs溶液,置透析袋(截留分子量為10000 Da),兩端扎緊,在滿足漏槽條件的前提下,放入磷酸鹽緩沖液(pH 7.4,0.5% Tween 80)20 mL釋放介質(zhì)中。在37℃、100 r·min-1條件下振搖,分別于0.5、1、2、3、4、5、6、8、10、12、24、36、48、72 h時(shí)取出全部釋放介質(zhì)(同時(shí)補(bǔ)入同溫等量的新鮮釋放介質(zhì)),平行3組。按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定釋放介質(zhì)中芹菜素的含量,計(jì)算累積釋放率(Q),繪制釋放曲線。結(jié)果如圖5所示,API在72 h內(nèi)僅釋放出30.04%,API-PMs在72 h內(nèi)持續(xù)緩慢釋放出43.63%,具有明顯的緩釋作用。采用Higuchi方程對(duì)膠束的體外釋放數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,顯示其體外釋放符合Higuchi方程,所得回歸方程Q=5.326t1/2,r=0.9991,表明其體外釋放以擴(kuò)散為主,藥物從膠束的疏水內(nèi)核中慢慢擴(kuò)散到釋放介質(zhì)中。

    圖5 API和API-PMs的累積釋放曲線(n=3)Fig 5 Cumulative release profile of API and API-PMs(n=3)

    3 討論

    本試驗(yàn)通過(guò)單因素試驗(yàn)和Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法,優(yōu)化API-PMs的制備工藝,驗(yàn)證試驗(yàn)顯示實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值偏差較小,表明Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法具有較好的預(yù)測(cè)性,可用于API-PMs的制備工藝的優(yōu)化設(shè)計(jì)。

    對(duì)于納米膠束輸送系統(tǒng),更高的包封率和載藥量意味著同等給藥劑量下進(jìn)入患者體內(nèi)的載體材料和輔料更少,毒性和免疫原性風(fēng)險(xiǎn)更低。本試驗(yàn)中的API-PMs具有較高的包封率和載藥量,表明藥物包封與載體載藥性能良好。其粒徑約62 nm,小于100 nm,符合口服吸收的粒徑范圍[17]。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示,API-PMs在常溫條件下貯存28 d后,其包封率和粒徑?jīng)]有顯著變化,表明納米膠束性質(zhì)穩(wěn)定,藥物不易析出且貯存方便。從FTIR分析可以得出,芹菜素與載體之間形成的氫鍵提高了納米膠束的穩(wěn)定性,使得載藥量和包封率增加,減少藥物泄漏[18]。

    體外釋放試驗(yàn)中,在滿足漏槽條件的前提下,選擇磷酸鹽緩沖液(pH 7.4,0.5% Tween 80)為其釋放介質(zhì),結(jié)果顯示,芹菜素原料藥水溶性差,快速在透析袋中沉淀,不再釋放,而API-PMs具有明顯的緩慢擴(kuò)散作用,達(dá)到了緩釋、長(zhǎng)循環(huán)的目的。本試驗(yàn)制備的API-PMs中加入TPGS吸收促進(jìn)劑,有利于胃腸道對(duì)納米膠束的吸收,而納米膠束能否促進(jìn)芹菜素吸收,有待進(jìn)一步研究。

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