磷霉素氨基葡萄糖鹽β-CD包合物的制備與研究

張尹萌，馬強，金學(xué)平，祝宏*（.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院 新型反應(yīng)器與綠色化學(xué)工藝湖北省重點實驗室，武漢 430205；2.武漢軟件工程職業(yè)學(xué)院，武漢 430205；3.武漢市藥物增溶工程技術(shù)研究中心，武漢 430205）

1969年，磷霉素從鏈霉菌中分離得到，在臨床上應(yīng)用廣泛，其作用機制是通過干擾細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，從而達到抑菌效果，對多數(shù)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌至今仍保持著較高的抗菌活性[1-2]。但磷霉素中的環(huán)氧基團在強酸、高溫等條件下容易開環(huán)，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，通常以鹽的形式存在，從而獲得較高的穩(wěn)定性[3]，如磷霉素鈣及磷霉素鈉。因此，本課題組選用天然的D-氨基葡萄糖，利用拼合原理與磷霉素拼合在一起得到了磷霉素氨基葡萄糖鹽（FA），并在先前研究中對其進行了結(jié)構(gòu)鑒定和初步活性測試[4]。

目前，市面上常用的磷霉素鈣和磷霉素鈉分別以口服和注射方式給藥，會不可避免地出現(xiàn)首過效應(yīng)和不良反應(yīng)，而在治療呼吸道感染時若直接選用安全性高的抗菌藥物經(jīng)肺給藥則能更好避免以上問題[5]。β-環(huán)糊精（β-cyclodextrins，β-CD）是一種對人體無害，性質(zhì)穩(wěn)定且常用的藥用輔料。其內(nèi)部的疏水性結(jié)構(gòu)使其具有使包合的各種各樣的化合物進入空腔內(nèi)的能力，通過主客體相互作用與藥物形成包合物，用以增加藥物溶解度和穩(wěn)定性，控制藥物的釋放[6-7]。為更好地解決FA中的環(huán)氧鍵在高溫下易發(fā)生開環(huán)反應(yīng)和引濕性強等問題，本研究采用冷凍干燥法制備FA-β-CD包合物，并對所制備的包合物進行表征，探究最佳包合工藝，同時對其進行抗菌活性及穩(wěn)定性考察，為后續(xù)磷霉素類藥物肺部給藥制劑研究做準(zhǔn)備。

1 材料

1.1 儀器

MS105DU電子分析天平[梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司]；DZG-303A 超純水機（上海富詩特儀器設(shè)備有限公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（上海越眾儀器股份有限公司）；PHS-25 pH計（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；ZLGJ-10冷凍干燥機（河北盈盛儀器有限公司）；WQF-510A傅里葉紅外光譜儀（安捷倫科技股份有限公司）；BrukerAXS D8 Advance X射線光電子能譜儀（德國布魯克公司）；SDH-150型恒溫恒濕箱（上海佐誠實驗儀器有限公司）。

1.2 試藥

FA（實驗室自制）；β-CD、鹽酸、氫氧化鈉（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，分析純）；磷霉素鈣（武漢五景藥業(yè)有限公司，批號：20180715，純度≥98%）；其余試劑均為分析純，水為實驗室自制純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥物含量的測定

現(xiàn)行的藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)采用微生物檢定法測定磷霉素含量，操作復(fù)雜，結(jié)果易受操作者主觀影響[8]。磷霉素在大于220 nm處無紫外吸收，無法利用紫外分光光度計直接測定FA含量；HPLC-ELSD法能同時測定磷霉素及相關(guān)雜質(zhì)含量，但耐用性差，結(jié)果難以重現(xiàn)。因此，本研究參考《中國藥典》方法，通過電位滴定測定樣品溶液中磷酸基團的含量進而換算出藥物中磷霉素的含量[9]。

2.1.1 電位滴定測定FA含量 取一定量的FA，用0.1 mol·L-1的鹽酸溶解，加入攪拌磁子進行電磁攪拌，用標(biāo)定過的0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液緩慢滴定，記錄待測液pH和電位的變化，直至出現(xiàn)第二次突躍，pH約為11.5時可停止滴定。另取空燒杯，加入10 mL 0.1 mol·L-1的鹽酸進行空白對照滴定實驗。通過二階微商計算突躍時消耗0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液體積，并根據(jù)以下公式計算FA含藥量。

W＝（V-V1）×C×M×10-3/2m×100%

式中，V為滴定FA時消耗氫氧化鈉溶液的體積（mL），V1為空白試驗中消耗氫氧化鈉溶液的體積（mL），C為氫氧化鈉標(biāo)定后的濃度（mol·L-1），m為稱取FA的量（g），M為磷霉素的相對分子質(zhì)量138.06 g·mol-1。

2.1.2 包合物包合率和收率測定 取包合物0.1 g，按“2.1.1”項下方法進行電位滴定計算包合率，另采用稱重法計算收率，計算公式如下所示。

收率（%）＝（所得的包合物的質(zhì)量）/（FA和β-CD總質(zhì)量）×100%

包合率（%）＝（包合物中的含藥量）/（FA中的含藥量）×100%

2.2 FA-β-CD包合物的制備

經(jīng)過預(yù)實驗，選用β-CD作為FA的包合材料，采用冷凍干燥法制備包合物。取β-CD 1 g，溶解于適量純化水中，在30℃下恒溫攪拌2 h，配制成β-CD飽和溶液。待溶液澄清后加入1 g FA，繼續(xù)在該溫度下攪拌包合1 h，待冷卻至室溫后，放入冰箱預(yù)凍24 h，再進行冷凍干燥除水，得FA-β-CD包合物。另外，按照質(zhì)量比1∶1，分別稱取適量的β-CD和FA，置于研缽中研磨混勻，制備FA和β-CD物理混合物。

2.3 包合物制備的工藝優(yōu)化

2.3.1 質(zhì)量比對包合率和收率的影響 一般來說，在包合物制備過程中，主客體分子比例越高，β-CD所提供的分子腔數(shù)量也就越多，藥物分子也更容易進入空腔被包合[10]。根據(jù)“2.2”項下方法制備，保持水浴溫度為30℃、包合時間為1 h不變，考察m（β-CD）∶m（FA）＝0.75∶1、1∶1、1.25∶1、1.5∶1、1.75∶1對FA的包合率和收率的影響。結(jié)果如圖1所示，以冷凍干燥法制備FA-β-CD包合物時，包合率隨著主客體質(zhì)量比的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢。當(dāng)主客體質(zhì)量比為0.75∶1時，主分子β-CD提供的空腔不足以讓客分子FA充分進入；當(dāng)m（β-CD）∶m（FA）為1.25∶1時，包合率最高，達到89.44%；此后繼續(xù)增加β-CD的用量也無法提高FA的包合率。由圖1還可得知，F(xiàn)A-β-CD包合物的收率受主客比影響不大，但隨著主客比的增大，β-CD用量增加，在影響包合率的同時，成本也增加。因此，m（β-CD）∶m（FA）＝1.25∶1為最佳質(zhì)量比。

圖1 m（β-CD）∶m（FA）對包合率和收率的影響Fig 1 Influence of m（β-CD）∶m（FA）on the inclusion rate and yield

2.3.2 包合時間對包合率和收率的影響 在m（β-CD）∶m（FA）為1.25∶1，包合溫度為30℃的條件下，考察包合時間1、2、3、4、5 h時對FA的包合率和收率的影響。結(jié)果如圖2所示。隨著包合時間的延長，F(xiàn)A的包合率和收率均呈現(xiàn)先升后降的趨勢，當(dāng)包合時間為2 h時，β-CD對FA的包合率和收率達到最高，分別為92.30%和89.34%；繼續(xù)增加包合時間，包合率和收率不增反降，這可能是因為當(dāng)包合時間達到2 h，F(xiàn)A進入β-CD空腔的速度與從空腔中脫離的速度達到平衡，因此，繼續(xù)增加包合時間，包合率也無法上升。而且，隨著包合時間的延長，研究的時間成本增加，最后選擇2 h為最佳包合時間。

圖2 包合時間對包合率和收率的影響Fig 2 Influence of inclusion time on the inclusion rate and yield

2.3.3 包合溫度對包合率和收率的影響 溫度也影響著包合效果，在m（β-CD）∶m（FA）為1.25∶1，包合時間為2 h時，考察包合溫度在20、25、30、35、40℃時對FA的包合率及收率的影響。由圖3可知，隨著包合溫度升高，F(xiàn)A的包合率逐漸降低，當(dāng)包合溫度為20℃時包合率最大，為90.35%。

圖3 包合溫度對包合率和收率的影響Fig 3 Influence of inclusion temperature on the inclusion rate and yield

因此，F(xiàn)A-β-CD包合物的最佳制備工藝為m（β-CD）∶m（FA）＝1.25∶1，包合時間為2 h，包合溫度為20℃。

2.4 包合物的鑒定

FA經(jīng)過β-CD包合后，需要對得到的包合物進行鑒定，常用的鑒定方法有以下幾種：電鏡法、紅外光譜法（IR）、X射線衍射法（XRD）以及薄層色譜法（TLC）等[11]。本實驗運用IR和XRD兩種方法對FA-β-CD包合物進行鑒定。

2.4.1 IR 本研究使用傅里葉變換紅外光譜儀，采用溴化鉀壓片制樣，分別測定β-CD、FA、FAβ-CD包合物及FA和β-CD的1∶1物理混合物的紅外光譜。結(jié)果見圖4，F(xiàn)A的紅外光譜在3300 cm-1左右出現(xiàn)分子間氫鍵O-H伸縮振動，屬于氨基葡萄糖分子上的羥基締合形成的寬吸收峰，在與磷霉素反應(yīng)生成FA后，在1600 cm-1到1750 cm-1處出現(xiàn)多個N-H的特征吸收峰。FA-β-CD包合物的紅外圖譜與β-CD的紅外圖譜相似，在1600～1750 cm-1是一個寬峰，這是與FA及兩者的物理混合物是明顯能區(qū)別開的，初步說明FA成功包合進入β-CD的空腔內(nèi)。

圖4 樣品的 IR 圖譜Fig 4 Infrared spectroscopy pattern of the samples

2.4.2 粉末XRD 分別將FA、β-CD、FA和β-CD的1∶1物理混合物以及FA-β-CD包合物這4種樣品進行粉末XRD分析，掃描速度為2θ，角度為5°到50°。從圖5掃描結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A的粉末衍射圖有清晰且尖銳的晶體衍射峰，說明其具有明顯的晶體結(jié)構(gòu)。而β-CD幾乎沒有峰，說明其為無定型粉末。兩者的物理混合物中幾乎所有的特征峰都存在，而FA-β-CD包合物的晶體衍射峰明顯減弱，表明粉末失去晶體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o定型狀態(tài)，證明FA-β-CD包合物包合成功。

圖5 樣品的粉末 XRD 圖譜Fig 5 X-ray powder diffraction pattern of the samples

2.5 抑菌活性實驗

2.5.1 主要試劑配制 分別稱取適量磷霉素鈣、FA、FA-β-CD包合物，加純化水溶解配成實際含磷霉素1 mg·mL-1的溶液；另配制相同濃度不含藥的β-CD溶液。

2.5.2 菌懸液的制備 用接種環(huán)分別從耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）、銅綠假單胞菌（Pae）、鮑曼不動桿菌（Ab）中挑取菌落，接種于200 mL液體培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基置于恒溫振蕩器中，在37℃、120 r·min-1的條件下培養(yǎng)18～20 h，備用。

2.5.3 微量肉湯稀釋法測定MIC取各溶液和液體培養(yǎng)基各100 μL混勻，依次倍比稀釋置于96孔板中，在每個孔加入80 μL液體培養(yǎng)基及20μL菌懸液，使待測液質(zhì)量濃度梯度依次為500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9 μg·mL-1；在其后一孔加入共180 μL液體培養(yǎng)基和20 μL菌液，最后一孔加入200 μL液體培養(yǎng)基作為對照，在37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，測量藥品對3種細(xì)菌（MRSA、Pae、Ab）的MIC值。平行重復(fù)實驗3次，結(jié)果如表1所示，β-CD完全沒有抗菌活性，對測試結(jié)果不會產(chǎn)生干擾。相比于MRSA和Pae，Ab具有更強的耐藥性。各樣品對MRSA、Ab的作用效果表現(xiàn)一致，對Pae的抗菌活性表現(xiàn)為FA-β-CD包合物弱于FA，F(xiàn)A弱于磷霉素鈣，推測β-CD包合FA后可能對藥物釋放有所影響，另外可能需要進一步優(yōu)化FA的拼合工藝使其藥效發(fā)揮更加穩(wěn)定。但從整體上來看，F(xiàn)A及其包合物的抗菌活性與磷霉素鈣相比并無太大差異，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都能展示出較好的抑菌效果。

表1 抗菌活性測試結(jié)果(MIC，μg·mL-1)Tab 1 Antibacterial activity test (MIC，μg·mL-1)

2.6 穩(wěn)定性實驗

FA容易吸潮，不易儲存，以表2中所列指標(biāo)考察樣品穩(wěn)定性。分別將FA和FA-β-CD包合物用生理鹽水配制成磷霉素濃度相同的溶液，再與FA和FA-β-CD包合物固體樣品一起放置于40℃恒溫恒濕箱中，做遮光處理。于第5日檢查溶液的顏色、氣味、pH值變化以及固體樣品的增重情況。結(jié)果如表2所示，在40℃避光的條件下，F(xiàn)A增重明顯，其溶液的顏色、氣味以及pH變化也較大；而FA-β-CD的重量及其溶液的顏色和氣味變化均較小。因此，經(jīng)過β-CD包合后的FA更加穩(wěn)定，尤其是其強引濕性得到了很好的改善。另外，按“2.5.3”項下方法，利用Pae對FA-β-CD包合物溶液進行活性測試，在8 h內(nèi)其抗菌效果未減弱，這對于現(xiàn)配現(xiàn)用的溶液來說，可滿足穩(wěn)定性要求。

表2 FA及FA-β-CD包合物的穩(wěn)定性Tab 2 Stability of FA and FA-β-CD inclusion complex

3 討論

3.1 FA-β-CD包合物制備工藝優(yōu)化

本實驗以β-CD作為載體，采用冷凍干燥法制備了FA-β-CD包合物。包合物的形成需要一定的時間，主客體質(zhì)量比和包合溫度會影響最終包合效果。在包合過程中，F(xiàn)A借助外力逐漸進入到β-CD空腔中，兩者分子間相互作用，β-CD的量不足時會導(dǎo)致FA包合不全，過多時又會因其濃度過高反而阻礙FA進入空腔。只有在合適溫度下，主客比適量，包合達平衡時才能取得最佳包合效果。因此，本研究以包合率和收率為指標(biāo)，通過單因素實驗篩選出了最佳的制備工藝，即m（β-CD）∶m（FA）為1.25∶1，包合時間為2 h，包合溫度為20℃。

3.2 FA-β-CD包合物的鑒定

藥物的分子結(jié)構(gòu)決定著其紅外區(qū)的吸收特征，采用β-CD對FA包合后，可根據(jù)FA紅外吸收峰的位移以及吸收峰的減弱或消失來判斷包合效果[12]。另外，X-射線衍射性質(zhì)也會隨著結(jié)晶性藥物被包合后的結(jié)晶度的改變而發(fā)生一些變化，結(jié)晶度高的藥物通常會有較強的衍射特征峰，而經(jīng)過β-CD包合后，樣品結(jié)晶程度會下降或者消失，在X-射線衍射圖譜上則表現(xiàn)為原有的特征吸收峰消失或減弱。因此，本文通過紅外光譜分析和X-射線衍射對樣品進行表征，證實了FA-β-CD包合物的形成。

3.3 FA-β-CD包合物的抗菌活性和穩(wěn)定性

經(jīng)抗菌活性測試發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A及FA-β-CD包合物對Pae的抗菌效果弱于對照品磷霉素鈣。可能是β-CD包合FA后會對藥物釋放產(chǎn)生影響，另外，也需要進一步優(yōu)化FA的拼合工藝使其藥效發(fā)揮更加穩(wěn)定。但從整體結(jié)果來看，F(xiàn)A及FA-β-CD包合物均能有效對抗革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。而且，經(jīng)過穩(wěn)定性觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A-β-CD包合物幾乎不吸潮。因此，本次研究證明了β-CD是合適FA的包封材料，采用冷凍干燥法制備FA-β-CD包合物時不會明顯影響FA的抗菌活性，且能明顯改善FA的強引濕性，有利于藥品的儲存和應(yīng)用。這也為后續(xù)進一步的制劑研究提供了一定參考。