基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和UPLC-Q-TOF/MS結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探究蓍草預(yù)防急性肝損傷的作用機(jī)制

王超，付瑞嘉，左倩，徐頂巧，樂世俊，唐于平（陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西省中醫(yī)藥管理局中藥配伍重點(diǎn)研究室，西安 712046）

急性肝臟損傷（acute liver injury，ALI）可由多種因素誘發(fā)，包括酒精、藥物濫用、病毒感染、代謝和自身免疫攻擊[1-2]。ALI發(fā)展末期會(huì)演變成肝纖維化或肝硬化，治療難度高，治療費(fèi)用昂貴，故對(duì)肝臟疾病的早期防治十分重要。研究表明，肝損傷的病理過程中伴隨著大量的炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制炎癥以及緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)于治療肝損傷具有重要意義[3]。因此，具有抗炎和抗氧化活性的藥物可用于治療肝損傷。蓍草來源于菊科植物蓍Achillea alpinaL.的干燥地上部分，具有解毒利濕、活血化瘀的功效[4]?，F(xiàn)代研究表明，蓍草具有抗炎[5]、抗氧化、抗菌[6]的作用，能夠顯著改善高血壓[7]、肝損傷[8]等疾病。蓍草治療肝損傷的藥效確切[9-10]，但是缺乏藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制的研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)和藥理學(xué)的綜合性學(xué)科，通過分析生物網(wǎng)絡(luò)和生物功能，從而系統(tǒng)化闡明藥物分子作用機(jī)制。故本研究基于UPLC-Q-TOF/MS分析鑒定蓍草中含有的成分，然后利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選預(yù)測(cè)這些成分作用的靶點(diǎn)并結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)而初步探究蓍草防治ALI的藥效及作用機(jī)制，以期為臨床治療ALI提供指導(dǎo)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)SD雄性大鼠24只，體質(zhì)量（200±20）g [成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)SCXK（川）2020-030]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，動(dòng)物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作均符合實(shí)驗(yàn)管理?xiàng)l例要求。

1.2 試藥

蓍草購自銅陵禾田中藥飲片股份有限公司，藥材經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)顏永剛教授鑒定為菊科植物蓍Achillea alpinaL.的干燥地上部分；聯(lián)苯雙酯滴丸（萬邦德制藥集團(tuán)有限公司，規(guī)格：1.5 mg，批號(hào)：19J210318）。四氯化碳（CCl4，天津市天力化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20210902），橄欖油（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：H29O11P129145），LC-MS級(jí)甲醇（Honeywell Burdick & Jackson 公司），LC-MS級(jí)甲酸（德國Darmstadt 默克公司），分析純甲醇（天津天利化學(xué)試劑有限公司），二甲苯、正丁醇、無水乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），檸檬酸抗原修復(fù)液、環(huán)保型脫蠟透明液、PBS緩沖液（武漢賽維爾科技有限公司）；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）、IL-1β酶聯(lián)免疫試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；一抗TLR-4、NF-κBp65、Nfr2、keap1、HO-1以及二抗辣根 HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG 抗體（武漢賽維爾科技有限公司）。

1.3 儀器

Waters ACQUITY Ⅰ-Class UPLC、Waters SYNAPT G2-Si Q-TOF 高分辨率飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國Waters公司），Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司），RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），多功能酶標(biāo)儀（美國基因生物科技有限公司），Centrifuge 5418R臺(tái)式離心機(jī)、恒溫板式混勻儀（德國Eppendorf公司），Donatello脫水機(jī)（米蘭DIAPATH公司），JB-P5包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司），RM2016病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司），DHG-9140A烤箱（上海慧泰儀器制造有限公司）。

2 方法

2.1 UPLC-Q-TOF/MS 檢測(cè)蓍草的成分

2.1.1 樣品制備 取蓍草藥材（過2號(hào)篩）約2 g，置于具塞錐形瓶中，加入70%甲醇40 mL，密塞，稱重，40℃水浴，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）45 min，放冷，再次稱重，用70%甲醇補(bǔ)足損失量，搖勻，抽濾，取續(xù)濾液，即得蓍草提取液。取蓍草提取液以適量甲醇稀釋，5000 r·min-1離心5 min，取上清過0.22 μm微孔濾膜得供試品溶液。

2.1.2 色譜條件 Waters Acquity BEH C18 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱溫35℃；流動(dòng)相為0.1%甲酸水（A）-純甲醇（B），梯度洗脫：0～1 min，90%A；1～5 min，90%→65%A；5～7 min，65%→60%A；7～10 min，60%→30%A；10～11 min，30%→15%A；11～11.5 min，15%→5%A；11.5～12 min，5%A。流速0.3 mL·min-1，檢測(cè)波長290 nm，進(jìn)樣量5 μL。

2.1.3 質(zhì)譜條件 ESI源條件：負(fù)離子模式，毛細(xì)管電壓2.5 kV，樣品錐孔溫度55℃，源溫度120℃，脫溶劑氣溫度280℃，錐孔氣體流量50 L·h-1，氮?dú)庾鳛殪F化氣（600 L·h-1），掃描模式為全掃描，掃描范圍m/z100～1200 Da。采用MassLynx v4.2軟件處理數(shù)據(jù)。

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

2.2.1 關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選 將UPLC-Q-TOF/MS檢測(cè)到的成分英文名輸入TCMSP數(shù)據(jù)庫（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）和CTD數(shù)據(jù)庫（http：//ctdbase.org/）獲取作用靶點(diǎn)。對(duì)于靶點(diǎn)較少或檢索不到作用靶點(diǎn)的成分，使用PubChem數(shù)據(jù)庫查詢獲取成分的Canonical SMILES 號(hào)，將SMILES號(hào)上傳至Similarity Ensemble Approach數(shù)據(jù)庫（http：//sea.bkslab.org/）和Swiss Target Prediction平臺(tái)（http：//www.swisstargetprediction.ch/），預(yù)測(cè)這些成分可能作用的靶標(biāo)點(diǎn)。以“acute liver injury”或“acute hepatic damage”為關(guān)鍵詞，在OMIM（https：//www.omim.org/），GeneCards（https：//www.genecards.org/）和NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫中檢索，合并并去掉重復(fù)靶點(diǎn)，得到ALI疾病相關(guān)作用靶點(diǎn)。最后，使用Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）將所有靶點(diǎn)名稱標(biāo)準(zhǔn)化。將蓍草成分的作用靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集并將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Venn平臺(tái)繪圖，獲得蓍草防治ALI的關(guān)鍵靶點(diǎn)。將蓍草成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建蓍草“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖并分析。

2.2.2 靶點(diǎn)蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析 將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING （https：//string-db.org/）數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，限定物種為“Homo sapiens”，蛋白互作評(píng)分設(shè)定為最低不小于0.4，刪除與其他蛋白無相互作用的蛋白，將結(jié)果保存為“TSV”格式文件并導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，以各個(gè)節(jié)點(diǎn)的連接度（Degree），介度（Betweenness）及緊密度（Closeness）均大于其中位數(shù)為篩選條件篩選核心靶點(diǎn)。

2.2.3 GO功能及KEGG通路富集分析 將交集靶點(diǎn)輸入DAVID （https：//david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫中，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，進(jìn)行GO功能富集分析及KEGG通路分析。

2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.3.1 蓍草提取液的制備 蓍草經(jīng)打粉機(jī)粉碎后過2號(hào)篩，稱取150 g蓍草粉末置于2 L圓底燒瓶中，加入6倍量50%乙醇，40℃水浴250 W超聲提取45 min，抽濾，藥渣置于1 L圓底燒瓶中，加入3倍量50%乙醇，40℃水浴250 W超聲提取45 min，合并2次濾液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇，濃縮藥液。本次實(shí)驗(yàn)共提取蓍草600 g，按上述提取方法，分4次提取，最終合并4次濃縮藥液，超純水定容至400 mL，制備得到1.5 g·mL-1的蓍草提取液。

2.3.2 陽性藥配制方法 取聯(lián)苯雙酯滴丸10粒于研缽中碾碎成粉末，于40 mL純水中超聲溶解，得0.375 mg·mL-1的陽性藥溶液。

2.3.3 動(dòng)物分組及給藥 24只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，按照正常組、模型組、蓍草組、陽性藥組隨機(jī)分為4組，每組6只，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，開始給藥。蓍草組按蓍草生藥量15 g·kg-1的劑量灌胃給藥，一日一次，連續(xù)兩周。陽性藥組使用3.75 mg·kg-1聯(lián)苯雙酯滴丸溶液灌胃給藥，一日一次，連續(xù)兩周。正常組和模型組給予純水同體積灌胃。末次給藥4 h后，除正常組外，其余各組均腹腔注射50%CCl4橄欖油溶液2 mL·kg-1，正常組腹腔注射同體積橄欖油溶液，大鼠禁食不禁水12 h，烏拉坦麻醉后，腹主動(dòng)脈采血，摘取肝臟。

2.3.4 臟器指數(shù)及生化指標(biāo)的測(cè)定 取肝臟用冷生理鹽水沖洗干凈，用濾紙擦干，稱重并計(jì)算肝指數(shù)。肝指數(shù)（%）＝（肝重/體重）×100%。血液靜置0.5 h后，以3000 r·min-1離心15 min，取上清液，按照試劑盒說明書，檢測(cè)分組大鼠血清中ALT和AST水平。精密稱取肝臟組織，加入適量生理鹽水，4℃研磨成10%肝勻漿，以12 000 r·min-1離心5 min，取上清液檢測(cè)MDA、CAT和SOD活性水平；按照ELISA試劑盒操作檢測(cè)大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平。

2.3.5 肝臟組織病理學(xué)形態(tài)變化 剪取各組大鼠肝臟同一部位組織于10%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋切片，進(jìn)行HE染色后200倍物鏡下觀察病理狀態(tài)。

2.3.6 肝臟中TLR-4、NF-κBp65、Nfr2、keap1、HO-1蛋白表達(dá)的檢測(cè) 肝臟組織切片，常規(guī)脫蠟至水，使用檸檬酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，雙氧水滅活，BSA室溫封閉；加一抗[TLR-4 （1∶400）、NF-κBp65 （1∶600）、Nfr2 （1∶600）、keap1（1∶800）、HO-1 （1∶800）]4℃過夜；PBS沖洗，二抗孵育，DAB顯色后蘇木素復(fù)染，自來水沖洗，蘇木素返藍(lán)，流水沖洗，脫水封片后鏡檢，陽性為棕黃色。

2.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)均以±s表示，采用GraPhpad Prime 8進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組間的比較均采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 蓍草UPLC-Q-TOF-MS檢測(cè)結(jié)果

運(yùn)用 UPLC-Q-TOF-MS/MS 得到的蓍草鑒定圖譜，見圖 1。使用 UNIFI 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、Masslynx v4.2 軟件和查閱文獻(xiàn)比對(duì)，共鑒定出 20種化合物，見表 1。

表1 蓍草UPLC-Q-TOF/MS鑒定成分Tab 1 Components identified by UPLC-Q-TOF/MS of Achillea alpina L.

圖1 蓍草提取液負(fù)離子BPI模式圖Fig 1 BPI pattern of negative ions of Achillea alpina L. extract

3.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果

3.2.1 蓍草防治ALI的“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)

通過數(shù)據(jù)庫檢索得到20個(gè)成分作用的潛在靶點(diǎn)共316個(gè)。從OMIM、GeneCards和NCBI數(shù)據(jù)庫中共檢索到ALI相關(guān)靶點(diǎn)共19 033個(gè)。將蓍草成分的作用靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集共得到291個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)。將蓍草的成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建蓍草“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖并進(jìn)行拓?fù)浞治?，見圖2。根據(jù)度值進(jìn)行篩選，排名前十的成分分別為異櫟素、蓍素、綠原酸、芒柄花素、雙酚A、百蕊草素Ⅱ、3，4，5-tetracaffeoylquinic acid、kaempferol 3-O-（6''-caffeoyl）-β-D-glucopyranoside、quercetin 3-O-（6''-caffeoyl）-β-D-glucopyranoside、艾黃素，這些成分可能是蓍草預(yù)防治療ALI的活性成分。

圖2 “成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 “Component-target” network diagram

3.2.2 核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò) 共得到104個(gè)核心靶點(diǎn)，見圖3?？梢哉J(rèn)為是蓍草防治ALI的核心靶點(diǎn)，其中節(jié)點(diǎn)越大，顏色越深，表明度值越大。

圖3 核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 Core target PPI network diagram

3.2.3 生物信息學(xué)分析 選取P＜0.05，GO功能排名前十，KEGG通路排名前二十的結(jié)果進(jìn)行可視化，見圖4。GO生物富集結(jié)果中，生物過程（biological process，BP）主要涉及炎癥反應(yīng)、凋亡及缺氧反應(yīng)等；細(xì)胞組分 （cellular component，CC）主要涉及質(zhì)膜、漿膜及細(xì)胞外區(qū)等；分子功能 （molecular function，MF）主要涉及氧化還原酶活性以及蛋白激酶活性等。KEGG通路富集分析顯示，主要涉及IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路及Toll樣受體信號(hào)通路等。綜上Toll樣信號(hào)通路與ALI關(guān)系緊密，故選擇通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)該通路進(jìn)行驗(yàn)證。

圖4 生物信息富集圖Fig 4 Bioinformation enrichment map

3.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究

3.3.1 蓍草提取液對(duì)ALI大鼠的肝指數(shù)的影響 與正常組（N組）對(duì)比，模型組（M組）肝指數(shù)增大，血清ALT、AST水平顯著上升。與模型組相比，陽性藥組（P組）肝指數(shù)顯著降低，血清中ALT、AST水平顯著下降；蓍草給藥組（S組）肝指數(shù)顯著降低，血清中ALT、AST水平顯著下降，結(jié)果見圖5。

圖5 蓍草提取液對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷大鼠肝指數(shù)及肝功能影響（ ±s，n＝6）Fig 5 Effect of Achillea alpina L. extract on liver index and liver function in rats with acute liver injury induced by Carbon tetrachloride（x± s，n＝6）

3.3.2 蓍草對(duì)大鼠肝臟氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響 與正常組比較，模型組MDA含量增加，SOD和CAT活力明顯降低。與模型組比較，陽性藥組MDA含量顯著降低，SOD和CAT活力明顯增加；蓍草給藥組MDA含量顯著降低，SOD和CAT活力明顯增加，結(jié)果見圖6。

圖6 蓍草提取液對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷大鼠抗氧化能力的影響（ ±s，n＝6）Fig 6 Effect of Achillea alpina L. extract on the antioxidant capacity of rats with acute liver injury induced by Carbon tetrachloride（ ±s，n＝6）

3.3.3 蓍草對(duì)大鼠血清炎癥因子的影響 與正常組比較，模型組TNF-α、IL-6和IL-1β水平顯著升高。與模型組比較，陽性藥組TNF-α、IL-6和IL-1β水平顯著降低；蓍草給藥組TNF-α、IL-6和IL-1β水平顯著降低，結(jié)果見圖7。

圖7 蓍草提取液對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷大鼠抗炎能力的影響（ ±s，n＝6）Fig 7 Effect of Achillea alpina L. extract on anti-inflammatory ability of rats with acute liver injury induced by Carbon tetrachloride（ ±s，n＝6）

3.3.4 蓍草對(duì)大鼠肝組織形態(tài)的影響 正常大鼠肝臟顏色紅潤，表面光滑有光澤，質(zhì)地柔軟；四氯化碳誘導(dǎo)損傷的大鼠肝臟顏色暗紅，大葉與小葉間有白色粘連，光澤度下降，被膜下游黃白色顆粒；聯(lián)苯雙酯組與蓍草給藥組的病理變化相對(duì)較輕。

正常大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞呈索狀排列，各肝細(xì)胞間界限清晰。四氯化碳誘導(dǎo)損傷的大鼠肝臟細(xì)胞水腫嚴(yán)重，細(xì)胞排列紊亂，界限模糊，存在較多壞死細(xì)胞，炎癥浸潤明顯。聯(lián)苯雙酯組和蓍草給藥組大鼠肝細(xì)胞損傷程度較輕，存在有少量肝細(xì)胞水腫、壞死及炎癥浸潤。結(jié)果見圖8。

圖8 蓍草對(duì)急性肝損傷大鼠肝臟組織病理變化的影響Fig 8 Effect of Achillea alpina L. on histopathological changes in the liver of rats with acute liver injury

3.3.5 相關(guān)蛋白免疫組化染色結(jié)果 蓍草對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的ALI大鼠肝組織相關(guān)蛋白的影響如圖9所示，各蛋白在細(xì)胞質(zhì)中陽性表達(dá)，棕黃色的深淺代表蛋白表達(dá)量的多少。結(jié)果表明，TLR-4、NF-κBp65、HO-1和keap1在正常大鼠肝組織中僅少量表達(dá)，模型組中四者表達(dá)量上升。相較于模型組，在使用蓍草和聯(lián)苯雙酯給藥后，TLR-4、NF-κBp65 和keap1表達(dá)量降低，HO-1在蓍草組中表達(dá)量降低，在陽性藥組表達(dá)上升。Nfr2在正常大鼠肝組織中表達(dá)量較高，在模型組中表達(dá)降低，經(jīng)蓍草和聯(lián)苯雙酯給藥后的大鼠肝組織中Nfr2表達(dá)上升。

圖9 各蛋白免疫組化結(jié)果（×200）Fig 9 Immunohistochemical results for each protein （×200）

4 討論

ALI是指由多種原因引起的肝臟損傷的疾病總稱，具有發(fā)病急、易復(fù)發(fā)、風(fēng)險(xiǎn)大等特點(diǎn)。肝臟作為體內(nèi)最大的代謝器官，藥物的代謝多在肝臟中完成，而目前臨床保肝藥物需要長時(shí)間服藥且伴有許多不良反應(yīng)，這無疑加大了肝損傷的風(fēng)險(xiǎn)[11]。故尋找安全有效的治療方法是當(dāng)前肝損傷臨床研究的重點(diǎn)問題。目前，中醫(yī)藥防治肝損傷被認(rèn)為是較好的方法，但中醫(yī)藥防治肝損傷的作用機(jī)制研究尚不明朗。

本研究通過 UPLC-Q-TOF/MS檢測(cè)蓍草中的主要化學(xué)成分，共鑒定出 20 種成分。通過網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫篩選，最終選出104個(gè)核心靶點(diǎn)，包括 TNF、IL-6、ALB、TLR4、NFKBIA等。然后，進(jìn)一步構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)度值篩選出異櫟素、蓍素和綠原酸等10個(gè)成分。有研究表明異櫟素具有保肝退黃的作用[12]，能夠激活p38蛋白，促進(jìn)Nrf2的上調(diào)，TLR、NF-κB和HO-1的下調(diào)，從而減少炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)抗氧化效果[13]。綠原酸具有良好的抗炎和抗氧化活性[14]，研究表明其可以通過調(diào)節(jié)Toll樣受體信號(hào)通路緩解ALI[15]。TNF、IL-6和ALB等均為體內(nèi)炎癥信號(hào)傳導(dǎo)因子，在體內(nèi)炎癥反應(yīng)中大量存在，研究表明三者均參與ALI的發(fā)病過程[16]。由此表明蓍草可能通過異櫟素、綠原酸等活性成分通過作用于TNF、TLR4等核心靶點(diǎn)發(fā)揮預(yù)防治療ALI的作用。

GO功能富集分析表明，蓍草中活性成分可能通過質(zhì)體膜、細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)等細(xì)胞組分參與炎癥反應(yīng)的正向調(diào)節(jié)、對(duì)缺氧的反應(yīng)和凋亡過程的負(fù)調(diào)控等生物學(xué)過程，發(fā)揮酶結(jié)合、血紅素結(jié)合和蛋白磷酸酶結(jié)合等分子功能達(dá)到治療ALI的目的。KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)，蓍草治療ALI的 104 個(gè)核心靶點(diǎn)主要參與 Toll樣受體、IL-17、TNF 等信號(hào)通路。有文獻(xiàn)報(bào)道，肝損傷中肝細(xì)胞死亡受體和識(shí)別受體受到刺激，Toll樣受體會(huì)被識(shí)別激活，誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體生成，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞焦亡，可見Toll樣信號(hào)通路與ALI關(guān)系緊密[17]，故本研究選擇對(duì)該通路進(jìn)行驗(yàn)證。

使用四氯化碳誘導(dǎo)ALI是一種經(jīng)典的ALI模型，常被用于篩選治療肝損傷的藥物中[18]。在本研究中，模型組大鼠AST、ALT以及肝指數(shù)水平顯著上升，肝細(xì)胞水腫嚴(yán)重，且存在肝細(xì)胞壞死，表明ALI模型造模成功。在給予蓍草提取液的大鼠中，ALT、AST以及肝指數(shù)水平顯著降低，肝細(xì)胞損傷程度有所緩解，表明蓍草對(duì)ALI大鼠的肝臟具有一定的保護(hù)作用。

研究表明，肝損傷的病理過程中伴隨著嚴(yán)重的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[19]。四氯化碳引起肝細(xì)胞損傷后，肝臟內(nèi)會(huì)產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生大量過氧化物損傷肝細(xì)胞，如MDA[20]。為了防御這些物質(zhì)帶來的損傷，肝臟內(nèi)會(huì)產(chǎn)生SOD和CAT發(fā)揮抗氧化作用[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，相較于模型組，蓍草給藥組可以降低肝臟組織中MDA的含量和血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平，提高SOD和CAT的活性。結(jié)果表明蓍草可以通過降低肝臟的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)保護(hù)ALI大鼠的肝臟。研究表明，細(xì)胞可以通過轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)特定抗氧化劑以及抗氧化酶的合成，而主要被調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子為Nrf2[22-23]。keap1/Nrf2軸是細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡的主要調(diào)節(jié)因子，而keap1/Nrf2/HO-1信號(hào)通路是體內(nèi)維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)炎癥和解除細(xì)胞毒性的重要途徑。當(dāng)體內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，Nrf2會(huì)從keap1中解離，轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，并與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合產(chǎn)生復(fù)合物，復(fù)合物會(huì)與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，促進(jìn)HO-1抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄[24-25]。Toll樣受體信號(hào)通路與炎癥因子的調(diào)控和釋放密切相關(guān)，其激活后會(huì)合成大量TNF家族的炎癥因子。研究表明，TLR4屬于Toll樣信號(hào)通路上游信號(hào)分子，在肝細(xì)胞中廣泛存在，通過與各種病原微生物分子結(jié)合后激活，傳遞信號(hào)促使下游信號(hào)分子MyD88磷酸化，MyD88磷酸化激活后可以激活下游NF-κB分子的磷酸化，從而控制促炎因子和一些免疫相關(guān)基因的表達(dá)[26]。故本研究選擇采用免疫組化檢測(cè)Nrf2、keap1、HO-1、TLR4和NFKBIA蛋白的表達(dá)，驗(yàn)證keap1/Nrf2/HO-1和Toll樣受體信號(hào)通路，探究蓍草預(yù)防治療ALI的作用機(jī)制。研究結(jié)果顯示，蓍草可以提高Nrf2蛋白的表達(dá)，降低keap1、HO-1、TLR4和NFκBp65蛋白的表達(dá)，表明蓍草預(yù)保護(hù)治療ALI的機(jī)制可能與調(diào)控keap1/Nrf2/HO-1和Toll樣受體信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，本研究通過 UPLC-Q-TOF/MS 聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，闡明了蓍草中的活性成分、靶點(diǎn)、通路之間的相互作用關(guān)系，并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)蓍草治療ALI的作用與調(diào)節(jié)keap1/Nrf2/HO-1和Toll樣受體信號(hào)通路密切相關(guān)，這可為后續(xù)臨床中治療ALI提供指導(dǎo)。