基于miRNA高通量測序探討芪玄抑甲寧改善格雷夫斯病小鼠甲狀腺功能亢進的作用機制

高長久，盧芳，柳長鳳，于棟華，丁崧，劉樹民*（. 黑龍江中醫(yī)藥大學研究生院，哈爾濱 50040；.黑龍江中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，哈爾濱 50040）

格雷夫斯?。℅raves disease，GD）是一種發(fā)生于甲狀腺的自身免疫性疾病，以促甲狀腺激素（TSH）受體刺激抗體（TRAb）的發(fā)現(xiàn)為特征，主要表現(xiàn)為彌漫性甲狀腺腫、甲狀腺毒癥和眼病。在所有甲狀腺功能亢進（以下簡稱甲亢）患者中，有80%左右的病例被診斷出患有GD。當前，治療GD主要有放射性碘、抗甲狀腺藥物和甲狀腺切除術三種方式[1-2]，但這些方式存在復發(fā)率高、易伴發(fā)甲狀腺功能減退等問題[3]。

MicroRNA（miRNA）是內源性、單鏈的非編碼微小RNA，長度一般為19～25個核苷酸。miRNA可以通過抑制mRNA翻譯或促進靶RNA降解來下調編碼蛋白基因的表達[4]，廣泛參與炎性介質的釋放、免疫反應的調控、血管的形成等諸多重要生物學事件[5]。近年來，越來越多的研究表明miRNA在GD的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[6-8]。

GD屬于中醫(yī)“癭病”范疇，初期多為氣機郁滯，繼而津凝痰聚，痰氣搏結頸前；進而肝氣郁結，日久化火，火熱內盛，耗氣傷陰，導致氣陰兩虛之候[9]。基于上述認識，劉樹民教授通過多年臨床經(jīng)驗總結并創(chuàng)建了補氣滋陰、清肝降火、化痰散結之驗方——芪玄抑甲寧，廣泛應用于臨床，并取得了良好的療效。前期藥效學研究已證實芪玄抑甲寧對GD有顯著改善作用，本研究旨在通過miRNA測序技術，從表觀遺傳學角度探索其在GD模型小鼠甲狀腺組織中的作用靶點及改善GD甲亢的作用機制。

1 材料

1.1 試藥

芪玄抑甲寧組方五味中藥黃芪-玄參-牡蠣-浙貝母-夏枯草配伍比例為3∶2∶2∶2∶1（黑龍江修生堂藥業(yè)有限公司，批號分別為20190401、20190401、20200601、20191101、20190701），經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院中藥資源與開發(fā)教研室王振月教授鑒定為正品飲片，符合2020年版《中國藥典》飲片性狀規(guī)定，按照最優(yōu)工藝進行提取[10]，制備成凍干粉；甲巰咪唑片（Merck KGaA，批號：C10002097）。

Ad-TSHR289重組腺病毒（賽業(yè)生物科技有限公司，滴度3.13×1011PFU·mL-1）；小鼠三碘甲腺原氨酸（T3）、甲狀腺素（T4）、促甲狀腺激素（TSH）ELISA試劑盒（江蘇晶美生物科技有限公司，批號分別為202112、202112、202201）；VAHTSTM Small RNA Library Prep Kit for Illumina、VAHTSTM DNA Clean Beads試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，批號分別為NR801-02、N411-03）；TransScriptⅡ All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for Qpcr/One-Step gDNA Removal、TransStart Top Green qPCR SuperMix試劑盒（北京全式金生物技術股份有限公司，批號分別為AH341、AQ131）。

1.2 儀器

Eclipse E100正置光學顯微鏡（日本Nikon公司）；M200pro型酶標儀、Nanodrop 2000超微量紫外分光光度計（美國Thermo公司）；NovaSeq 6000測序儀（美國Illumina公司）；LabChip GX大分子分析儀（美國PerkinElmer公司）；CFX96 qRT-PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 動物

6周齡SPF級雌性BALB/c小鼠，體質量18～22 g [北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK（京）2021-0006]。小鼠在溫度20～24℃、濕度40%～50%條件下適應性飼養(yǎng)1周，自由進食飲水。動物實驗在黑龍江中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院完成，動物使用許可證號：SYXK（黑）2018-007。本研究經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物福利與倫理委員會批準（批準文號：2021030605）。

2 方法

2.1 動物模型的制備與分組給藥

促甲狀腺激素受體（TSHR）是具有7個跨膜結構的G蛋白偶聯(lián)受體，包括A（細胞表面）、B（跨膜）兩個亞單位，A亞單位主要參與促甲狀腺激素（TSH）受體特異性刺激性自身抗體（TRAb）結合。通過構建TSHR-A亞單位的腺病毒（Ad-TSHR289）可成功誘導GD動物模型。在眾多造模方法中，雌性BALB/c小鼠通過Ad-TSHR289重組腺病毒免疫誘導所建立的GD模型，與人GD的發(fā)生機制類似，成模率最高（可達86%），且具有高度可重復性，此動物模型現(xiàn)被廣泛應用[11]。前期實驗結果表明，芪玄抑甲寧各劑量組對GD模型小鼠的外觀行為、甲狀腺組織病理形態(tài)具有改善作用，并對血清中T4、TRAb有回調作用，且高劑量組最顯著[12]，故本研究以前期實驗的高劑量組作為給藥組。

取雌性BALB/c小鼠50只，隨機分為對照組（10只）、造模組（40只）。造模組應用經(jīng)PBS稀釋的重組腺病毒（Ad-TSHR289）于小鼠脛前肌內注射免疫造模，每次免疫劑量為1.878×109PFU/60 μL，對照組給予等劑量的PBS，于第1、4、7周共免疫3次。第10周將檢測造模成功的小鼠分為模型組、甲巰咪唑組、芪玄抑甲寧組，每組8只。芪玄抑甲寧組灌胃芪玄抑甲寧50 g生藥/（kg·d）（質量濃度2.5 g 生藥·mL-1，20 mL·kg-1），甲巰咪唑組灌胃甲巰咪唑片3.75 mg/（kg·d），對照組、模型組灌胃給予20 mL/（kg·d）的飲用水，連續(xù)4周。

2.2 芪玄抑甲寧對GD小鼠甲狀腺功能的影響

給藥前和給藥4周后，將各組小鼠腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉（40 mg·kg-1）麻醉，于小鼠頜下靜脈叢采靜脈血，離心取上清，ELISA法檢測小鼠血清中T3、T4和TSH水平，具體操作按試劑盒說明書進行，并經(jīng)酶標儀檢測450 nm波長時的光密度值，比較各組間的差異并分析。

2.3 芪玄抑甲寧對GD小鼠甲狀腺組織病理形態(tài)的影響

給藥結束后，頸椎脫位法處死小鼠，取甲狀腺組織，用4%多聚甲醛固定，經(jīng)石蠟包埋切片，脫蠟至水，蘇木素和伊紅染色，脫水，中性樹膠封片后，在正置光學顯微鏡下觀察和拍照。

2.4 各組小鼠甲狀腺組織差異表達miRNA的分析

2.4.1 甲狀腺組織RNA的提取與檢測 從對照組、模型組和芪玄抑甲寧組每組隨機選取6只小鼠的甲狀腺組織，使用TRIzol法提取組織樣本的總RNA，使用生物大分子分析儀LabChip GX對RNA的完整性進行檢測，使用超微量紫外分光光度計Nanodrop2000對RNA進行濃度檢測。

2.4.2 文庫構建與高通量測序 使用VAHTSTM Small RNA Library Prep Kit for Illumina構建單端測序文庫，通過VAHTSTM DNA Clean Beads純化產(chǎn)物合成cDNA文庫，生成的文庫通過Qsep400方法進行質檢，在NovaSeq 6000平臺上進行測序。

2.4.3 基因鑒定與表達分析 將每個具有miRNA序列的樣品讀長與已有miRNA數(shù)據(jù)庫和新miRNA的預測結果進行比較，對各樣本中miRNA進行表達量分析，并使用TPM算法對表達量進行歸一化。以差異倍數(shù)（Fold Change，F(xiàn)C）＞1.5 或＜0.67，P＜0.05作為篩選標準，使用edgeR軟件進行差異表達分析，獲得兩組樣本之間的差異表達miRNA。

2.5 差異表達miRNA的qRT-PCR驗證

選擇miR-128-3p、miR-144-3p、miR-363-3p、miR-215-5p、miR-30a-5p這5個差異表達miRNA進行qRT-PCR驗證。取各組小鼠甲狀腺組織miRNA，使用TransScript Ⅱ All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Removal）反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA。根據(jù)TransStart Top Green qPCR SuperMix試劑盒說明書進行qRT-PCR分析。結果以差異倍數(shù)（FC）進行表示并繪制柱狀圖。引物序列見表1。

表1 miRNA引物序列Tab 1 miRNA primer sequences

2.6 差異表達miRNA靶基因的預測與網(wǎng)絡的構建

將差異表達的miRNA通過miRDB（http：//mirdb.org）、TargetScan（https：//www.targetscan.org）、Starbase（https：//starbase.sysu.edu.cn）3個數(shù)據(jù)庫預測靶基因并取交集，獲得差異表達miRNA的靶基因。運用Cytoscape 3.8.2軟件構建“差異表達miRNA-靶基因”網(wǎng)絡圖。

2.7 miRNA靶基因的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

通過Metascape數(shù)據(jù)庫（https：//metascape.org）對差異表達miRNA的靶基因進行富集分析，包括基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。

2.8 統(tǒng)計學分析

甲功三項（TSH、T3、T4）結果采用IBM SPSS Statistics 24軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組內治療前后比較采用配對樣本t檢驗；差異表達miRNA的qRT-PCR和miRNA測序結果數(shù)據(jù)比較分析采用獨立樣本t檢驗，應用GraphPad Prism 7軟件進行分組柱狀圖的繪制。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 芪玄抑甲寧對GD小鼠甲狀腺功能的影響

給藥前與對照組比較，模型組小鼠T3、T4顯著升高（P＜0.01），TSH顯著降低（P＜0.01）。給藥4周后，與模型組比較，芪玄抑甲寧組小鼠T3、T4降低（P＜0.05，P＜0.01），TSH升高（P＜0.05）；與給藥前比較，芪玄抑甲寧組T3、T4降低（P＜0.05，P＜0.01），TSH升高（P＜0.01）（見表2）。

表2 芪玄抑甲寧對GD小鼠甲狀腺功能的影響(x±s，n＝8)Tab 2 Effect of Qixuan Yijianing on the thyroid function in GD mice ( ±s，n＝8)

表2 芪玄抑甲寧對GD小鼠甲狀腺功能的影響(x±s，n＝8)Tab 2 Effect of Qixuan Yijianing on the thyroid function in GD mice ( ±s，n＝8)

注：與同組給藥前比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與同時間對照組比較，##P＜0.01；與同時間模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01.Note：Compared with the same group before the administration，*P＜0.05，**P＜0.01；compared with the control group at the same time，##P＜0.01；compared with the model group at the same time，△P＜0.05，△△P＜0.01.

組別甲功三項給藥前給藥后對照組TSH/（mU·L-1）12.93±1.2412.62±1.25 T3/（ng·mL-1）2.79±0.312.81±0.20 T4/（ng·mL-1）61.64±5.4660.21±5.67模型組TSH/（mU·L-1）10.58±0.75##10.99±0.78##T3/（ng·mL-1）3.91±0.39##4.06±0.38##T4/（ng·mL-1）87.04±9.38##85.42±10.29##甲巰咪唑組TSH/（mU·L-1）10.59±0.95##12.57±1.00** △△T3/（ng·mL-1）4.03±0.38##3.05±0.37**△△T4/（ng·mL-1）90.34±7.63##64.70±5.20**△△芪玄抑甲寧組TSH/（mU·L-1）10.79±0.95##12.38±1.13**△T3/（ng·mL-1）4.06±0.17##3.63±0.39*△T4/（ng·mL-1）91.20±5.01##67.14±5.08**△△

3.2 芪玄抑甲寧對GD小鼠甲狀腺組織病理形態(tài)的影響

對照組甲狀腺組織中的濾泡大小形狀相對比較均一，濾泡細胞排列較為疏松，甲狀腺上皮細胞呈橢圓狀、無增生，濾泡中膠質含量較豐富。模型組甲狀腺組織中的濾泡細胞大小不一，增生肥大，呈立方狀或高柱狀，部分濾泡腔中膠質缺失，存在空泡情況等病理特征。與模型組相比，芪玄抑甲寧組甲狀腺組織病理形態(tài)有一定的恢復，與對照組較為接近（見圖1）。

圖1 芪玄抑甲寧對GD小鼠甲狀腺組織病理形態(tài)的影響（HE染色，×400）Fig 1 Effect of Qixuan Yijianing on the pathological morphology of thyroid in GD mice（HE staining，×400）

3.3 三組小鼠甲狀腺組織差異表達miRNA

與對照組比較，模型組共篩選出171個差異表達的miRNA，其中99個miRNA下調、72個miRNA上調，差異最大的miRNA為miR-18b-5p；與模型組比較，芪玄抑甲寧組共篩選出127個差異表達的miRNA，其中61個miRNA下調、66個miRNA上調，差異最大的miRNA為miR-1197-3p。其中miR-128-3p、miR-144-3p和miR-363-3p在模型組表達下調，而在芪玄抑甲寧組表達上調（見圖2和表3）。

圖2 甲狀腺組織差異表達miRNA的火山圖Fig 2 Volcano plot of differentially expressed miRNAs in the thyroid tissue

表3 各組小鼠甲狀腺組織差異表達的miRNATab 3 Differentially expressed miRNAs in the thyroid tissue of mice in each group

3.4 差異表達miRNA的qRT-PCR驗證

三組小鼠甲狀腺組織miR-128-3p、miR-144-3p、miR-363-3p、miR-215-5p和miR-30a-5p mRNA相對表達量與miRNA測序結果基本一致（見圖3）。

圖3 差異表達miRNA的qRT-PCR驗證Fig 3 qRT-PCR validation of differentially expressed miRNAs

3.5 差異表達miRNA與靶基因網(wǎng)絡圖

構建了模型組與對照組、芪玄抑甲寧組與模型組“差異表達miRNA與靶基因”的網(wǎng)絡圖（見圖4），以確定miRNA-mRNA間的功能性相互作用，為探討芪玄抑甲寧改善GD甲亢的作用機制提供依據(jù)。

圖4 差異表達miRNA-靶基因網(wǎng)絡圖Fig 4 Differentially expressed miRNA-target genes network diagram

3.6 差異表達miRNA靶基因的功能分析

GO功能分析包括生物過程（biological process，BP）、細胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）3個部分。模型組與對照組比較，差異表達miRNA的靶基因主要富集在管形態(tài)發(fā)生、激酶活性的調節(jié)、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調節(jié)、脈管系統(tǒng)發(fā)育、染色質、轉錄調節(jié)復合物、mRNA結合、染色質結合、DNA轉錄因子結合等條目。芪玄抑甲寧組與模型組相比，差異表達miRNA的靶基因主要富集在對生長因子的反應、細胞對生長因子刺激的反應、染色質、神經(jīng)元細胞體、軸突、突觸后膜的內在成分、轉錄因子結合、染色質結合、DNA轉錄因子結合等條目（見圖5）。

圖5 差異表達miRNA靶基因的GO功能富集分析（前10）Fig 5 GO functional enrichment analysis of differentially expressed miRNA target genes（top 10）

KEGG富集分析結果顯示，模型組與對照組比較，差異表達miRNA的靶基因主要富集在絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、人叉頭框蛋白O（FoxO）、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）、神經(jīng)營養(yǎng)因子、T細胞受體、血管內皮生長因子（VEGF）等信號通路。芪玄抑甲寧組與模型組比較，差異表達miRNA的靶基因主要富集在FoxO、MAPK、轉化生長因子β（TGF-β）、Notch、生長激素的合成、分泌和作用、T細胞受體等信號通路（見圖6）。

圖6 差異表達miRNA靶基因的KEGG通路富集分析（前30）Fig 6 KEGG pathway enrichment analysis of differentially expressed miRNA target genes（top 30）

4 討論

GD由于TRAb過度刺激甲狀腺細胞而導致甲亢，出現(xiàn)心悸、出汗、進食和便次增多及體重減輕等癥狀[13]。本課題組前期研究結果表明，芪玄抑甲寧各劑量組能顯著降低尾靜脈注射小腸結腸炎耶爾森氏菌免疫甲亢大鼠模型血清中T3、T4的水平并提高TSH的水平，可明顯改善甲亢大鼠的外觀行為、體質量、甲狀腺組織病理樣變化，可顯著降低血清中白細胞介素-17（IL-17）、白細胞介素-6（IL-6）和TGF-β的水平，回調甲亢大鼠甲狀腺組織中IL-17、IL-17R的mRNA和蛋白表達水平[14-15]；對脛前肌內注射重組腺病毒（Ad-TSHR289）免疫的GD小鼠模型的外觀行為、甲狀腺組織病理形態(tài)具有改善作用，并對血清中對T4、TRAb有回調作用[12]。GD患者的甲狀腺組織中有miRNA異常表達的現(xiàn)象，本研究利用miRNA高通量測序技術，從表觀遺傳學角度探討GD的可能發(fā)病機制及芪玄抑甲寧治療GD的作用機制。

miRNA測序結果發(fā)現(xiàn)，模型組與對照組比較，171個miRNA存在差異表達情況，其中99個表達下調、72個表達上調，并且miR-363-3p、miR-128-3p和miR-144-3p表達在miRNA測序和qRT-PCR驗證中均下調。T輔助細胞17（Th17）介導的炎癥與多種自身免疫性疾病相關，miR-363-3p可以結合到活化T細胞核因子5（Nfat5）和維A酸相關孤核受體a（Rora）的3’-UTR上；使體外小鼠原代CD4+淋巴細胞中miR-363-3p下調，能提高Rora、IL-17a和IL-17f的表達，并增加Th17的分化和IL-17的分泌[16]。miR-128-3p的表達下調，其靶基因Wnt1誘導信號通路蛋白1（WISP1）上調，可激活PI3K/Akt信號通路，抑制軟骨細胞的增殖，誘導細胞凋亡、軟骨細胞基質降解和促炎細胞因子的產(chǎn)生[17]；GD甲狀腺新血管生的增加，可使甲狀腺體積增大，甲狀腺激素合成和釋放增多，miR-128-3p的表達下調，其靶基因VEGFC上調，從而促進血管生成[18]。GD患者血漿中循環(huán)miR-144-3p的表達顯著降低，可作為GD的潛在生物標志物，但其在GD中的作用機制尚不明確[7]；有研究表明miR-144-3p在多種腫瘤組織中下調，與血管生成密切相關[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)芪玄抑甲寧干預后，GD模型小鼠miR-363-3p、miR-128-3p和miR-144-3p表達水平均顯著上調，提示其可能為芪玄抑甲寧改善GD甲亢癥狀的作用靶點。

GO富集分析結果顯示，與GD甲亢相關條目主要集中在對生長因子的反應、細胞對生長因子刺激的反應、染色質、神經(jīng)元細胞體、細胞質核周區(qū)、轉錄調節(jié)復合物、轉錄因子結合、染色質結合、DNA轉錄因子結合、RNA聚合酶Ⅱ結合等方面，提示由于GD引起甲狀腺激素合成和釋放的增加，使染色質、細胞質和神經(jīng)元細胞等成分變化，影響機體DNA、轉錄因子、RNA聚合酶Ⅱ結合等轉錄過程，導致機體生長發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)異常。KEGG通路分析顯示，模型組差異表達miRNA的靶基因主要富集于MAPK、FoxO、PI3K/Akt、T細胞受體、TGF-β、VEGF、甲狀腺激素信號通路等。甲狀腺是高度血管化的內分泌器官，在GD的發(fā)病過程中血管過度生成，使甲狀腺血流增加，導致甲狀腺體積增大、甲狀腺激素水平增高[20]。VEGFA是血管生成的關鍵調節(jié)因子，它通過與包括血管內皮生長因子受體2（VEGFR2）在內的受體結合發(fā)揮作用，并且VEGF和VEGFR2多態(tài)性與GD難治性相關，VEGFA在GD伴格雷夫斯眼?。℅O）患者的甲狀腺和眼眶脂肪組織中顯著上調，并能觀察到血管過度生成[21]，較高的VEGFA水平可能會增加GD患者甲狀腺血管生成并導致甲狀腺腫大[22]。FOXO1主要與調節(jié)VEGFA表達并促進血管生成有關[23]。綜合芪玄抑甲寧組差異表達miRNA靶基因的KEGG通路富集分析結果[24]，推測芪玄抑甲寧可能通過調節(jié)差異miRNA的表達，調控上述相關信號通路，從而發(fā)揮減輕GD甲亢和眼病癥狀的作用。

綜上所述，本研究通過對對照組、模型組和芪玄抑甲寧組小鼠甲狀腺組織進行miRNA測序，構建“模型組與對照組”“芪玄抑甲寧組與模型組”差異miRNA的表達譜，應用生物信息學技術預測差異miRNA的靶基因并進行靶基因的富集分析，篩選出與芪玄抑甲寧干預GD甲亢密切相關的miRNA靶點及調控通路?；诒狙芯?，將選取相關miRNA、靶基因和信號通路進行細胞和動物實驗驗證，以期從表觀遺傳學角度闡明芪玄抑甲寧治療GD甲亢的作用機制。