一種植物酵素/蜂王漿混合物的抗氧化及免疫調(diào)節(jié)活性研究

楊翠婷，周晴，屈青松，李智勛，宗浩，史新元*（.北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 000；.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 000；.潁川堂健康科技有限公司，北京 0007）

“藥食同源”酵素是采用藥食同源的原料、水果、蔬菜、菌類(lèi)等經(jīng)益生菌發(fā)酵后產(chǎn)生的含有特定生物學(xué)功能的食品，其中既含有能調(diào)節(jié)機(jī)體生理功能的益生菌，又含有大量的活性成分，從而具有豐富的營(yíng)養(yǎng)保健功能[1]。酵素可產(chǎn)生大量的植物綜合酶，這些酶對(duì)人體的代謝和機(jī)能調(diào)整起著重要作用，同時(shí)還含有維生素、氨基酸、有機(jī)酸、低聚糖等營(yíng)養(yǎng)成分，進(jìn)而具有活化細(xì)胞、改善體質(zhì)、提高免疫、調(diào)整腸道菌群等作用[2]。

植物酵素/蜂王漿混合物（下稱(chēng)酵素/蜂王漿混合物）是采用傳統(tǒng)發(fā)酵工藝，選用新鮮的余甘子、牛蒡根兩種“藥食同源”原料及青梅、奇異果、檸檬，經(jīng)益生菌自然發(fā)酵成酵素原漿，再與特定比例的蜂王漿混合后制成的酵素飲品[3]。其中，余甘子營(yíng)養(yǎng)成分豐富，含黃酮和多酚化合物，如沒(méi)食子酸、沒(méi)食子鞣質(zhì)、焦性沒(méi)食子酸等[4]。黃酮類(lèi)化合物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，沒(méi)食子酸具有提高免疫力、輔助保護(hù)肝損傷等作用[5]。蜂王漿營(yíng)養(yǎng)成分豐富，其含有的特殊化合物10-羥基-2-葵烯酸（10-hydroxydec-2-enoic acid，10-HDA）在蜂王漿的各種活性功能和藥理活性中起著關(guān)鍵作用，具體表現(xiàn)為抗菌、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤等方面[6-8]。

本文以酵素/蜂王漿混合物為研究對(duì)象，對(duì)其活性成分進(jìn)行含量測(cè)定；同時(shí)以DPPH·等三種自由基的清除力以及免疫低下小鼠的臟器指數(shù)和形態(tài)、細(xì)胞因子水平等為指標(biāo)，分析酵素/蜂王漿混合物的抗氧化活性及免疫調(diào)節(jié)活性，以期為“藥食同源”型植物酵素的綜合性開(kāi)發(fā)和功能性研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LHS-80HC-Ⅱ 恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海一恒科技）；PB303-S 電子天平（波蘭RADWAG）；KQ-250E 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器）；Synergy-2多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)安捷倫）；LC-20Ai高效液相色譜儀（日本Shimadzu）；Sorvall ST 8R 高速冷凍離心機(jī)、CryoStar NX50 冷凍切片機(jī)（賽默飛世爾科技）；TS-2 熒光倒置生物顯微鏡（尼康儀器）。

1.2 試藥

酵素/蜂王漿混合物（10-HDA不低于3 mg·mL-1，批號(hào)：20211121，為潁川堂健康科技有限公司提供的潁川堂秘性皇漿）；BCA試劑盒、蘆?。╕Z-100060，HPLC＞98%）、沒(méi)食子酸對(duì)照品（CAS：139-91-6，HPLC＞99%）（上海瀘震實(shí)業(yè)有限公司）；沒(méi)食子酸對(duì)照品（批號(hào)：B20103)、左旋咪唑（批號(hào)：S30366）（上海源葉生物科技有限公司)；磷酸（CAS：1122-001）、亞硝酸鈉（CAS：Q/12GF 04-2017）、硝酸鋁（CAS：13473-90-0）、硫酸亞鐵（CAS：7782-63-0）（羅恩化學(xué)試劑公司）；DPPH試劑（CAS：1898-66-4）、水楊酸（批號(hào)：20210531）、鄰苯三酚（批號(hào)：20201014）（上海化成工業(yè)發(fā)展有限公司）；Tris（CAS：77-86-1，合肥志宏生物技術(shù)有限公司）；甲醇（色譜純，Lot：207801）、乙醇（分析純，批號(hào)：2021619）、氫氧化鈉（批號(hào)：20200709A）、鹽酸（批號(hào)：20190802A）、30%過(guò)氧化氫（CAS：7722-84-1）（北京化工廠）；SPF級(jí)ICR雄鼠（批準(zhǔn)號(hào)：BUCM-4-2021091306-2125，斯貝福生物技術(shù)有限公司）；環(huán)磷酰胺（CTX，批號(hào)：04092113，海正輝瑞制藥有限公司）；ELISA試劑盒（批號(hào)：20210816-0021，愛(ài)博泰克生物技術(shù)公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 10-HDA含量測(cè)定

采用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱；流動(dòng)相為0.03 mol·L-1HCl-甲醇-水（10∶55∶35）；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；流速1.0 mL·min-1；柱溫35℃；進(jìn)樣量4 μL。具體方法參考GB 9697-2008[9]，委托譜尼測(cè)試機(jī)構(gòu)測(cè)定。測(cè)試結(jié)果顯示酵素/蜂王漿混合物中10-HDA含量為3.30 mg·mL-1。

2.2 沒(méi)食子酸含量測(cè)定

2.2.1 溶液的配制 對(duì)照品溶液：精密稱(chēng)取沒(méi)食子酸對(duì)照品2.00 mg置5 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得0.40 mg·mL-1的沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

供試品溶液：按大力子發(fā)酵液∶青梅發(fā)酵液∶奇異果發(fā)酵液∶檸檬發(fā)酵液∶余甘子發(fā)酵液為10∶5∶5∶3∶2制備酵素原漿[3]，備用。取10 mL酵素原漿凍干，分別超聲處理3次（功率250 W，頻率45 kHz），每次處理1 h，使其完全溶于5 mL甲醇。離心取上清液，合并3次濾液，置于通風(fēng)櫥中揮干，加15 mL甲醇復(fù)溶，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.2 色譜條件 采用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱；流動(dòng)相為0.10%磷酸溶液-甲醇（93∶7）；檢測(cè)波長(zhǎng)為271 nm；流速1.0 mL·min-1；柱溫30℃；進(jìn)樣量10 μL。該方法經(jīng)方法學(xué)考察符合要求，將對(duì)照品溶液進(jìn)樣，以沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度（Y，μg·mL-1）對(duì)峰面積（X）進(jìn)行線性回歸，得沒(méi)食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y＝3.381×104X-248.62，R2＝0.999。

2.2.3 樣品測(cè)定 取供試品溶液1 mL測(cè)定，將測(cè)定的峰面積代入回歸方程計(jì)算酵素原漿中的沒(méi)食子酸含量，每個(gè)樣品平行3次。

由于酵素/蜂王漿混合物中的黃酮類(lèi)化合物來(lái)源于多種“藥食同源”原料，為提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度，采用酵素原漿進(jìn)行沒(méi)食子酸的測(cè)定。計(jì)算得供試品溶液中沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為（0.23±0.001）mg·mL-1，換算出酵素原漿中沒(méi)食子酸含量為0.35 mg·mL-1。

2.3 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

2.3.1 樣品制備 隨機(jī)選取3份酵素/蜂王漿混合物，分別精密稱(chēng)量并采用去離子水配制成5.01、5.05和4.96 mg·mL-1的溶液，置于5 mL離心管中，即得供試品溶液。

2.3.2 樣品測(cè)定 依照BCA試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，以吸光度值（Y）對(duì)蛋白含量（X，μg）進(jìn)行線性回歸。結(jié)果蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y＝0.0292X+0.1191，R2＝0.992。在標(biāo)準(zhǔn)曲線中代入樣品測(cè)得的吸光度值，計(jì)算出酵素/蜂王漿混合物中蛋白含量為（145.90±5.53）mg·g-1。

2.4 黃酮類(lèi)化合物含量測(cè)定

2.4.1 溶液的配制 對(duì)照品溶液制備：精確稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品0.020 g，置于5 mL燒杯中，加入5 mL無(wú)水乙醇溶解，30%乙醇定容至100 mL量瓶中，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

樣品溶液制備：酵素原漿制備方法同“2.2.1”項(xiàng)下。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 分別依次取蘆丁對(duì)照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL分別置于25 mL量瓶中，加入30%乙醇稀釋至10 mL，依次加入0.12 mL的6%NaNO2溶液和10%Al（NO3）3溶液，分別混勻，室溫放置6 min，再加入1.6 mL的4%NaOH溶液，最后用30%乙醇定容，混勻后放置15 min，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。以吸光度值（Y）對(duì)蘆丁質(zhì)量濃度（X，mg·mL-1）進(jìn)行線性回歸，得黃酮類(lèi)化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y＝5.3X+0.0354，R2＝0.9992。

2.4.3 樣品測(cè)定 取酵素原漿溶液1 mL測(cè)定，將測(cè)得的吸光度值代入回歸方程計(jì)算酵素原漿中黃酮類(lèi)化合物含量，每個(gè)樣品平行3次。

計(jì)算得酵素原漿中黃酮類(lèi)化合物含量為（0.16±0.002）mg·mL-1。

2.5 DPPH·自由基清除能力測(cè)定

采用DPPH·氧化法[10]測(cè)定酵素/蜂王漿混合物對(duì)DPPH·的清除能力。用去離子水對(duì)酵素/蜂王漿混合物進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)總€(gè)樣品平行3次，計(jì)算公式如下：

DPPH·清除率（%）＝[1-（Ai-Aj）/A0]×100%

式中：A0為70%乙醇的吸光度，Ai為樣品溶液與DPPH·溶液反應(yīng)后的吸光度，Aj為不加DPPH·溶液的吸光度。

由于酵素/蜂王漿混合物顏色較深，在測(cè)定其對(duì)不同自由基的清除能力時(shí)根據(jù)采用試劑體系大小將其稀釋至合適倍數(shù)，經(jīng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)稀釋至50%后的酵素/蜂王漿混合物對(duì)DPPH·的清除率可達(dá)85.11%。

2.6 超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定

采用NBT顯色法[11]測(cè)定，PMS/NADH體系會(huì)產(chǎn)生超氧自由基。用去離子水對(duì)酵素/蜂王漿混合物進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)總€(gè)樣品平行3次，計(jì)算公式如下：

超氧陰離子自由基清除率（%）＝[1-Ax/A0]×100%

式中：Ax為樣品與混合反應(yīng)溶液的吸光度，A0為水代替樣品的混合反應(yīng)溶液的吸光度。

經(jīng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)稀釋至50%后的酵素/蜂王漿混合物對(duì)超氧陰離子自由基的清除率可達(dá)72.20%。

2.7 羥自由基清除能力測(cè)定

采用水楊酸法[12]測(cè)定酵素/蜂王漿混合物對(duì)羥自由基的清除能力。用去離子水對(duì)酵素/蜂王漿混合物進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)總€(gè)樣品平行3次，計(jì)算公式如下：

羥自由基清除率（%）＝[1-（Ai-Aj）/A0]×100%

式中：A0為水溶液的吸光度，Ai為樣品溶液與混合反應(yīng)溶液的吸光度，Aj為不加水楊酸混合反應(yīng)溶液的吸光度。

稀釋至2%后的酵素/蜂王漿混合物對(duì)羥自由基的清除率仍可達(dá)44.51%。

2.8 免疫功能測(cè)定

2.8.1 劑量設(shè)計(jì) 人體推薦攝入量為30.0 g·d-1，根據(jù)《中國(guó)藥理研究方法學(xué)》人鼠劑量換算方法換算的小鼠體重與60 kg成人的等效劑量，其相對(duì)劑量設(shè)計(jì)為0.5 g·kg-1，根據(jù)該推薦量設(shè)置低、中、高3 個(gè)劑量組，分別為5 倍的低劑量組2.5 g·kg-1、10 倍的中劑量組5 g·kg-1、20倍的高劑量組10 g·kg-1，按 0.1 mL/10 g體積給小鼠灌胃。

2.8.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 將48 只雄性ICR小鼠，體質(zhì)量（21±6）g，置于（25±2）℃、12 h/12 h光暗循環(huán)、60%相對(duì)濕度的條件下，自由飲食飲水7 d使其適應(yīng)環(huán)境，記錄體重。將小鼠隨機(jī)分為6組（n＝8），空白組、模型組、左旋咪唑陽(yáng)性藥組、混合物低劑量組、混合物中劑量組、混合物高劑量組[13]。各組小鼠每日定時(shí)灌胃，空白組和模型組灌胃生理鹽水（0.2 mL/20 g），其余各組小鼠灌胃等量對(duì)應(yīng)混合物樣品，每日1 次。連續(xù)灌胃30 d[14]，每日觀察小鼠狀態(tài)、記錄體重。同時(shí)，自第24日起，空白組小鼠腹腔注射生理鹽水（0.2 mL/20 g），其余各組小鼠腹腔注射等量的環(huán)磷酰胺，每日1 次，連續(xù)注射3 d。最后一日灌胃后將各組小鼠禁食24 h，摘眼球取血，快速解剖脾臟和胸腺。所有實(shí)驗(yàn)用鼠均按照北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)的程序進(jìn)行。

2.8.3 體重變化 適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，稱(chēng)重記錄初始體重，并且在處死前再次稱(chēng)量體重，記為終末體重。

由表1可知，灌胃期結(jié)束后，與空白組相比，模型組小鼠的體重增長(zhǎng)量顯著降低；與模型組相比，陽(yáng)性藥組和混合物樣品各劑量組小鼠的體重增長(zhǎng)量均有所提高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 酵素/蜂王漿混合物對(duì)免疫低下小鼠體重的影響(g)Tab 1 Effect of plant enzyme/royal jelly mixture on the body weight of immunocompromised mice (g)

2.8.4 免疫臟器指數(shù) 解剖摘取各組小鼠的脾臟和胸腺，去除周?chē)Y(jié)締組織，用吸水紙吸除多余水分并稱(chēng)重，臟器質(zhì)量（mg）/終末體重（g）即得免疫臟器指數(shù)[15]。

如圖1所示，空白組、陽(yáng)性藥組小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均明顯高于模型組，說(shuō)明CTX可以抑制小鼠免疫器官的生長(zhǎng)發(fā)育；與模型組相比，混合物樣品中、高劑量組小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均有明顯提高。說(shuō)明酵素/蜂王漿混合物具有對(duì)抗環(huán)磷酰胺、促進(jìn)免疫器官發(fā)育、提高非特異性免疫的效果。

圖1 酵素/蜂王漿混合物對(duì)小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)的影響Fig 1 Effect of plant enzyme/royal jelly mixture on the spleen index and thymus index of mice

2.8.5 脾臟形態(tài)學(xué)觀察 將稱(chēng)量后的小鼠脾臟浸泡在10%甲醛溶液中4℃儲(chǔ)存，24 h后轉(zhuǎn)移至20%蔗糖溶液中浸泡過(guò)夜使其沉底，再轉(zhuǎn)移至30%蔗糖溶液中浸泡過(guò)夜使其沉底。取出脾臟樣品，用冷凍切片機(jī)切成5 μm的薄片，通過(guò)HE染色進(jìn)行處理后置于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

結(jié)果如圖2所示，空白組淋巴細(xì)胞分布集中，小梁結(jié)構(gòu)清晰，紅髓、白髓清楚可辨，邊緣區(qū)界限清晰；模型組淋巴細(xì)胞分布稀疏，紅髓與白髓界限模糊，脾組織存在破損現(xiàn)象。與模型組相比，陽(yáng)性藥組小鼠脾臟白髓中淋巴小結(jié)的數(shù)目多且相互連結(jié)，淋巴細(xì)胞密集；混合物樣品低、中劑量組的修復(fù)作用不明顯，高劑量組脾臟結(jié)構(gòu)恢復(fù)較為明顯，淋巴細(xì)胞相對(duì)密集，白髓中淋巴小結(jié)數(shù)目多、體積大、相互連結(jié)，紅髓、白髓邊緣區(qū)界限逐漸清晰。結(jié)果顯示，酵素/蜂王漿混合物在一定程度上可以促進(jìn)小鼠脾臟生長(zhǎng)發(fā)育，起到修復(fù)免疫臟器組織的作用。

圖2 酵素/蜂王漿混合物對(duì)免疫低下小鼠脾臟組織形態(tài)學(xué)變化的影響（×10）Fig 2 Effect of plant enzyme/royal jelly mixture on the histomorphological changes of the spleen in immunocompromised mice（×10）

2.8.6 細(xì)胞因子的測(cè)定 于第30日給藥后，取血，分離血清，用滅菌后的生理鹽水將血清稀釋至10%，參考ELISA試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算IgM、IL-1β和TNF-α的相應(yīng)含量。

各組小鼠血清中細(xì)胞因子的含量如圖3所示?？瞻捉M、陽(yáng)性藥組小鼠血清中IgM、IL-1β和TNF-α的水平明顯高于模型組，說(shuō)明CTX可以抑制小鼠的體液和細(xì)胞免疫功能。與模型組相比，低、中、高劑量的混合物樣品干預(yù)組小鼠血清中三種細(xì)胞因子的含量均有顯著提高，說(shuō)明酵素/蜂王漿混合物具有對(duì)抗環(huán)磷酰胺、促進(jìn)機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫的效果。結(jié)果提示，酵素/蜂王漿混合物可能通過(guò)影響細(xì)胞因子的分泌，從而起到改善機(jī)體免疫功能的作用，并在一定范圍內(nèi)具有量效關(guān)系。

圖3 血清中細(xì)胞因子含量Fig 3 Cytokine content in serum

2.9 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，利用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

10-HDA是蜂王漿重要成分之一，性質(zhì)穩(wěn)定，具有優(yōu)良的殺菌、抗腫瘤和提高免疫的功能[4]。沒(méi)食子酸提高免疫力的功效已被證實(shí)。在犢牛飼料中添加沒(méi)食子酸可以顯著提高IgG、TNF-α等細(xì)胞因子的水平[16]。蛋白質(zhì)是人體免疫防御能力的物質(zhì)基礎(chǔ)，人體各種免疫細(xì)胞和抗體的生成都需要蛋白質(zhì)的參與。黃酮是優(yōu)良的抗氧化劑。在探究沙苑子、柴胡等中藥不同部位抗氧化性能時(shí)發(fā)現(xiàn)，黃酮含量越高其抗氧化能力越高[17-18]。本文檢測(cè)出混合物樣品中10-HDA、蛋白質(zhì)含量分別為3.30 mg·mL-1、145.90 mg·g-1，酵素原漿中沒(méi)食子酸、黃酮類(lèi)化合物含量分別為0.35 mg·mL-1、0.16 mg·mL-1，提示酵素/蜂王漿混合物可能具有抗氧化及提高免疫力的潛能。

抗氧化即為清除相關(guān)自由基，在人體美白祛斑、抗衰老等方面具有積極意義[19]?？寡趸瘜?shí)驗(yàn)結(jié)果表明，稀釋至50%的混合物樣品對(duì)DPPH·（85.11%）和超氧陰離子自由基（72.2%）均具有較好的清除效果，稀釋至2%后對(duì)羥自由基仍具有一定清除能力（44.51%），結(jié)果表明酵素/蜂王漿混合物具有較強(qiáng)的抗氧化性能。

免疫是人體的一種生理功能，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，對(duì)于疾病的防御和治療十分關(guān)鍵。胸腺和脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，其指數(shù)一定程度上可以反映機(jī)體的免疫水平[20]。脾臟是機(jī)體內(nèi)最核心的免疫器官，其形態(tài)結(jié)構(gòu)是反映機(jī)體非特異性免疫的重要指標(biāo)[21]。免疫球蛋白是體液免疫應(yīng)答中最主要的細(xì)胞因子，在抗原刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)時(shí)，IgM、IL-1β和TNF-α等細(xì)胞因子能夠產(chǎn)生極強(qiáng)的抗感染能力、激活免疫系統(tǒng)等一系列生物學(xué)反應(yīng)[22-24]。本文研究結(jié)果表明，混合物樣品可以提高小鼠的免疫臟器指數(shù)，促進(jìn)脾臟細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育，增加小鼠血清中IgM、IL-1β和TNF-α細(xì)胞因子的含量，具有提高機(jī)體非特異性免疫、體液免疫及細(xì)胞免疫的作用，其作用可能與提高免疫臟器指數(shù)，減少免疫器官損傷，以及提高血液中一些細(xì)胞因子（IgM、IL-1β和TNF-α）含量等因素有關(guān)，并在一定范圍內(nèi)具有量效關(guān)系。

4 結(jié)論

“藥食同源”植物酵素結(jié)合了藥食兩用原料的藥效作用和酵素的營(yíng)養(yǎng)保健功能，成為近年來(lái)酵素產(chǎn)品研究的熱點(diǎn)。本研究中，以“藥食同源”原料與蜂王漿混合制備后，發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗氧化和免疫調(diào)節(jié)能力，在抗氧化和調(diào)節(jié)免疫功能的食品及藥物開(kāi)發(fā)方面具有極大的應(yīng)用前景，可為今后“藥食同源”植物酵素的綜合性開(kāi)發(fā)和進(jìn)一步應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。