基于UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)的不同產(chǎn)地肺形草化學(xué)成分的研究

張忠立，石文康，左月明，吳華強(qiáng)（江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南昌 330004）

《中華本草》收載了龍膽科雙蝴蝶屬植物肺形草、青魚(yú)膽草、黃金線、臺(tái)灣肺形草、小筋骨藤5 種中草藥[1]，其中肺形草來(lái)源于龍膽科植物雙蝴蝶[Tripterospermum chinense（Migo）H. Smith]的幼嫩全草，主要分布于江西、福建、湖北等地，味甘、性寒，歸肺、腎經(jīng)，具有清肺止咳、涼血止血、利尿解毒等功效[2]。國(guó)內(nèi)外研究主要集中在玉山雙蝴蝶、日本雙蝴蝶、雙蝴蝶和臺(tái)灣雙蝴蝶等幾種植物，目前已從雙蝴蝶屬植物中分離得到100多個(gè)化合物，主要含有環(huán)烯醚萜類和黃酮類（呫噸酮）等成分[2-4]，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明其具有抗炎、抗氧化、抗高血壓、抗禽流感病毒、抑菌等作用[4-6]。本課題組前期依據(jù)“肺脾兩虛，痰瘀內(nèi)阻”的中醫(yī)病機(jī)，建立肺脾兩虛型慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）病理模型，利用此模型研究發(fā)現(xiàn)肺形草提取物具有治療COPD的生物活性，故本實(shí)驗(yàn)以不同產(chǎn)地的肺形草為研究對(duì)象，采用超高效液相-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-Q-TOF-MS）測(cè)定不同產(chǎn)地樣本，運(yùn)用多種統(tǒng)計(jì)方法分析不同產(chǎn)地肺形草所含化學(xué)成分的差異性，以提供較全面的肺形草技術(shù)資料，促進(jìn)肺形草資源的合理利用和開(kāi)發(fā)。

1 材料

1.1 儀器

Nexera X2 LC-30A 型超高效液相色譜儀（日本島津公司），Triple TOF 5600+型高分辨質(zhì)譜（美國(guó)AB SCIEX公司，配備Analyst 1.6數(shù)據(jù)處理軟件），BT255十萬(wàn)分之一電子分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），KQ3200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），GZX-9070ME數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.2 試藥

不同產(chǎn)地的肺形草藥材樣品F1～F8（見(jiàn)表1）均采自于7～8月份，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室左月明教授鑒定為龍膽科雙蝴蝶屬植物Tripterospermum chinense（Migo）H.Smith.的干燥全草。水為屈臣氏蒸餾水，甲酸、乙腈為色譜純（德國(guó)Merck公司），其他試劑均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

表1 不同產(chǎn)地肺形草藥材樣品信息Tab 1 Sample sources of the herba of Tripterospermum chinense in different areas

2 方法與結(jié)果

2.1 液相檢測(cè)條件

Welchrom HPLC C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，3 μm），流動(dòng)相乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）梯度洗脫，洗脫條件：0～2 min，5%A；2～20 min，5%～12%A；20～35 min，12%～40%A；35～38 min，40%A；38～48 min，40%～80%A；48～50 min，80%A。流速為0.3 mL·min-1，進(jìn)樣室溫度為 15℃，柱溫為35℃，進(jìn)樣量為2 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子模式檢測(cè)，掃描范圍m/z100～1250，噴霧電壓5.5 kV，離子源500℃，去簇電壓100 V，碰撞能量35 eV，數(shù)據(jù)采集時(shí)間50 min。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取干燥肺形草粉末（過(guò)三號(hào)篩）1.0 g，加入70%甲醇，質(zhì)量體積比為1∶25，回流提取3次，每次2 h，放冷，用70%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液即可。

2.4 化學(xué)成分鑒定

利用UPLC-Q-TOF-MS系統(tǒng)，按照保留時(shí)間的先后順序采集肺形草中化學(xué)成分的相關(guān)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，對(duì)樣品溶液分析得不同產(chǎn)地藥材基峰離子色譜圖，見(jiàn)圖1。通過(guò)在中國(guó)知網(wǎng)（CNKI）、SciFinder、Mass bank等數(shù)據(jù)庫(kù)查找收集肺形草中含有的化學(xué)成分（包括化學(xué)名稱、CAS號(hào)、分子式和分子量），在軟件PeakView 1.2.0.3中導(dǎo)入化合物的名稱和分子式，保留篩選出的化學(xué)式和保留時(shí)間等必要的信息，再導(dǎo)入查找到化學(xué)式的mol式，與二級(jí)碎片和化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比匹配，結(jié)合化學(xué)式裂解的基本規(guī)律和匹配度≥90%辨別成分；或者結(jié)合保留時(shí)間和文獻(xiàn)中的質(zhì)譜信息綜合鑒定成分[7-31]，共鑒定出肺形草化學(xué)成分51個(gè)（見(jiàn)表2），主要為環(huán)烯醚萜和黃酮類成分。

圖1 不同產(chǎn)地肺形草基峰色譜圖（BPI）Fig 1 Chromatogram of the base peaks of Tripterospermum chinense in different areas

表2 肺形草負(fù)離子模式色譜峰質(zhì)譜指認(rèn)Tab 2 Identification of chemical constituents from the herba of Tripterospermum chinense by negative ion mode

續(xù)表2

2.4.1 環(huán)烯醚萜類成分鑒定 峰3在負(fù)離子峰模式下m/z355.1035，分子式為C16H20O9，在丟失中性碎片-C6H10O5-CO2得到m/z149.0178，再繼續(xù)丟失-C2H4O2得到m/z89.0351，與參考文獻(xiàn)[9]比對(duì)得知，此化合物為龍膽苦苷。峰8在負(fù)離子峰模式下m/z375.1296，分子式為C16H24O10，丟失-C6H10O5得到碎片離子m/z213.0769，再失去一分子-CO2得到碎片離子m/z169.0873，丟失一分子-H2O得到碎片m/z151.0766，見(jiàn)圖2。根據(jù)二級(jí)碎片離子結(jié)合參考文獻(xiàn)[9]推測(cè)出此化合物為馬錢(qián)苷酸。

圖2 馬錢(qián)苷酸的裂解方式Fig 2 Proposed fragmentation pathways of loganic acid

2.4.2 呫噸酮類成分鑒定 峰18在負(fù)離子峰模式下m/z421.0769，分子式為C19H18O11，繼而丟失中性碎片-H2O，-C3H6O3，-C4H8O4，-C6H10O5，生成m/z403.0129，331.0470，301.0364和259.0259碎片離子，碎片離子m/z331.0470丟失-CO-H2O得到離子m/z285.0411，碎片離子m/z301.0364丟失-CH2O得到碎片離子m/z271.0254，見(jiàn)圖3。與參考文獻(xiàn)[21]比對(duì)得知，此化合物為芒果苷。峰35在負(fù)離子峰模式下m/z273.0406，分子式為C14H10O6，丟失一分子-CH3得到碎片離子m/z258.0171，或者丟失一分子-CO2得到碎片離子m/z229.0229。與參考文獻(xiàn)[9]對(duì)比得知，此化合物為雛菊葉龍膽酮。峰38在負(fù)離子峰模式下m/z259.0249，分子式為C13H8O6，一個(gè)羥基鍵斷裂，得到m/z243.0581，在雙苯基-γ-吡喃酮的母核上發(fā)生雜環(huán)的碳氧化學(xué)鍵斷裂，得到碎片離子m/z199.0852。結(jié)合文獻(xiàn)[9]推測(cè)出此化合物為去甲基雛菊葉龍膽酮。

圖3 芒果苷的裂解方式Fig 3 Proposed fragmentation pathways of mangiferin

2.4.3 黃酮類成分鑒定 峰22在負(fù)離子峰模式下m/z461.1103，分子式為C22H22O11，母離子發(fā)生RDA反應(yīng)，丟失-C4H8O4生成了m/z341.0368的碎片，隨后又丟失-CO及CH3得到碎片m/z313.0258和m/z298.0402。通過(guò)參考文獻(xiàn)[18]比對(duì)，得出此化合物為日當(dāng)藥黃素。

峰23在負(fù)離子峰模式下m/z447.0924，分子式為C21H20O11，丟失碎片-C6H10O5，-C4H8O4，-C3H6O3，生成m/z285.0681，327.0522和357.0621碎片離子，m/z357.0621離子碎片再丟失一分子水得m/z339.0582，m/z327.0522離子碎片再丟失一分子水得m/z309.0692，見(jiàn)圖4。通過(guò)參考文獻(xiàn)[22]比對(duì)，得出此化合物為異葒草苷。

圖4 異葒草苷的裂解方式Fig 4 Proposed fragmentation pathways of isoorientin

2.4.4 生物堿類成分鑒定 峰20在負(fù)離子峰模式下m/z174.0563，分子式為C10H9NO2，丟失一分子-HCHO得到碎片離子m/z144.0621，再丟失一分子-CO得碎片離子m/z116.0662，見(jiàn)圖5。通過(guò)參考文獻(xiàn)[9]比對(duì)，得出此化合物為龍膽堿。

圖5 龍膽堿的裂解方式Fig 5 Proposed fragmentation pathways of gentianine

2.4.5 三萜類成分鑒定 峰49在負(fù)離子峰模式下m/z455.3534，分子式為C30H48O3，丟失一分子-HCOOH得到碎片離子m/z409.0132，再丟失一個(gè)-H2O和RDA裂解后得到碎片離子m/z350.0721，或者原分子丟失一個(gè)-H2O得到碎片離子m/z437.0692，或者原分子發(fā)生RDA裂解后得到碎片離子m/z207.2688，再丟失一分子-H2O得到碎片離子m/z189.0126，見(jiàn)圖6。通過(guò)與參考文獻(xiàn)[31]進(jìn)行對(duì)比，得出此化合物為熊果酸。

圖6 熊果酸的裂解方式Fig 6 Proposed fragmentation pathways of ursolic acid

2.4.6 蒽醌類成分鑒定 峰46在負(fù)離子峰模式下m/z269.0455，分子式為C15H10O5，丟失一分子-CO得到碎片離子m/z241.0515，進(jìn)一步丟失一個(gè)-O得到碎片離子m/z225.0565，而后丟失一分子-CO得到m/z197.0606；或者m/z241.0515碎片丟失一分子-CO得到m/z213.0562，再丟失一分子CO得到m/z185.0585，繼續(xù)丟失一分子CH2得到m/z171.0458，見(jiàn)圖7。通過(guò)與參考文獻(xiàn)[13]比對(duì)，得出此化合物為大黃素。

圖7 大黃素的裂解方式Fig 7 Proposed fragmentation pathways of emodin

2.4.7 有機(jī)酸類成分鑒定 峰21在負(fù)離子峰模式下m/z179.0348，分子式為C9H8O4，丟失一分子-CO2得到m/z135.0459。通過(guò)與參考文獻(xiàn)[19]比對(duì)，得出此化合物為咖啡酸。

2.5 主成分分析

將不同產(chǎn)地的肺形草化學(xué)成分存在差異，主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）將不同產(chǎn)地的肺形草MS數(shù)據(jù)導(dǎo)入MarkView 1.2.1并設(shè)置參數(shù)，去除同位素離子峰，歸一化處理后得到數(shù)據(jù)。將得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1進(jìn)行PCA和OPLS-DA分析。數(shù)據(jù)在軟件中經(jīng)過(guò)處理可以得到PCA圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的樣本被明顯分為三類，說(shuō)明樣本之間的化學(xué)成分有明顯的差異，F(xiàn)3樣本為一組，F(xiàn)2和F6樣本為一組，F(xiàn)1、F4、F5、F7和F8樣本為一組，每組組內(nèi)樣本之間離散較小，表示組內(nèi)均一性良好。PCA雖然可以將樣本進(jìn)行分類，但是組內(nèi)差異并不明顯，所以在PCA的基礎(chǔ)上進(jìn)行OPLS-DA分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)組間差距依舊明顯，組內(nèi)也存在差異（見(jiàn)圖8）。聚類分析結(jié)果顯示：如果將樣本分為兩類，F(xiàn)2、F3、F6為一類，F(xiàn)1、F4、F5、F7、F8為一類；如果將樣本分為4類，則F3為一類，F(xiàn)2、F6為一類，F(xiàn)5、F8為一類，F(xiàn)1、F4、F7為一類，見(jiàn)圖9。

圖8 不同產(chǎn)地肺形草的PCA 得分（A）和 OPLS-DA 得分（B）Fig 8 PCA scores（A）and OPLS-DA scores（B）of Tripterospermum chinense in different areas

圖9 不同產(chǎn)地肺形草的聚類分析Fig 9 Cluster analysis of Tripterospermum chinense in different areas

2.6 差異性成分的篩選與分析

將不同產(chǎn)地肺形草數(shù)據(jù)導(dǎo)入MarkView 1.2.1中設(shè)置參數(shù)，去掉同位素離子峰后再進(jìn)行t檢驗(yàn)，導(dǎo)出數(shù)據(jù)保留Use一列中的Ture數(shù)據(jù)；結(jié)合OPLS-DA中VIP＞1的值與t檢驗(yàn)中P＜0.05的值取交集，對(duì)照所有的數(shù)據(jù)共得到11個(gè)差異性指標(biāo)成分，將每個(gè)產(chǎn)地的峰面積進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同產(chǎn)地肺形草存在差異的化合物信息Tab 3 Compound information of differences of Tripterospermum chinense in different areas

不同產(chǎn)地的肺形草藥材中，化學(xué)成分種類差別不大，均以黃酮和環(huán)烯醚萜類成分為其主要成分類型，而有11個(gè)差異性成分的相對(duì)含量不同，馬錢(qián)苷酸、8-表-金銀花苷、莫諾苷和芒果苷在肺形草藥材中相對(duì)含量較高。1，3，8-三羥基呫噸酮和3，6，8-三羥基-1-甲基呫噸酮在F6樣本中含量較高，大黃素和莫諾苷在F8樣本中含量較高，芒果苷在F5樣本中含量較高，馬錢(qián)苷酸、8-表-金銀花苷、當(dāng)藥黃素、熊果酸、山楂酸和千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷在F3樣本中含量較高。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-Q-TOF-MS對(duì)不同產(chǎn)地肺形草的化學(xué)成分進(jìn)行辨識(shí)，前期正、負(fù)離子模式比較發(fā)現(xiàn)，黃酮類和環(huán)烯醚萜類成分在負(fù)離子模式下所顯示的成分信息更多。同時(shí)，我們對(duì)色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)提取方法、提取時(shí)間以及流動(dòng)相等進(jìn)行了考察，最終確定以70%甲醇為提取溶劑，回流提取2 h，流動(dòng)相采用乙腈-0.1%甲酸水進(jìn)行負(fù)離子模式下梯度洗脫測(cè)試，共鑒別出51個(gè)化合物，其中以黃酮、呫噸酮和環(huán)烯醚萜類成分為主，最終篩選出大黃素、芒果苷、莫諾苷等11個(gè)差異性成分，這些差異性成分相對(duì)含量的不同直接反映不同產(chǎn)地肺形草藥材質(zhì)量的差異性，產(chǎn)于江西、浙江、福建的肺形草藥材成分相近，產(chǎn)于四川和云南的肺形草藥材成分相近，而產(chǎn)于湖北的肺形草單獨(dú)為一組。由于目前化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)尚不完善和相關(guān)領(lǐng)域研究報(bào)道較少，導(dǎo)致部分成分沒(méi)有最終鑒定，有待后續(xù)進(jìn)一步深入研究。

國(guó)內(nèi)外對(duì)雙蝴蝶屬植物的化學(xué)成分和藥理活性的研究顯示，雙蝴蝶屬植物中的化學(xué)成分多屬于環(huán)烯醚萜類和呫噸酮類成分，大多具有非常廣泛的藥理活性，其中馬錢(qián)苷酸和8-表-金銀花苷具有抗炎作用[4]，莫諾苷具有保護(hù)神經(jīng)元延緩衰老、保肝作用[32]，芒果苷具有抗炎、抗心力衰竭作用[33]，當(dāng)藥黃素具有抗炎、抗氧化和抗抑郁作用[34]，研究表明肺形草具有抗炎、抗氧化、抗高血壓、抗病毒、抑菌等作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)肺形草提取物具有治療COPD的生物活性，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不清晰，有待進(jìn)一步深入探討。此外，肺形草不同產(chǎn)地藥材中環(huán)烯醚萜類和呫噸酮類差異性成分相對(duì)含量的不同，導(dǎo)致藥材質(zhì)量的不穩(wěn)定，需要以此類差異性成分為定量指標(biāo)建立和完善肺形草藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，故通過(guò)本文研究，可為后續(xù)藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供科學(xué)依據(jù)和理論支撐，以促進(jìn)其資源的合理利用和深度開(kāi)發(fā)。