王文君,劉霞霞,陳馨,程卉*,王國凱*(. 安徽中醫(yī)藥大學藥學院,合肥 23002;2. 新安醫(yī)學教育部重點實驗室,合肥 230038;3. 安徽中醫(yī)藥大學科研技術(shù)中心,合肥 230038)
胃癌(gastric cancer,GC)是全球最常見的惡性腫瘤之一,在消化道惡性腫瘤中排第二位,2020年新增100多萬病例,有76.9萬人死亡,發(fā)病率、病死率均較高[1]。多數(shù)患者確診時已經(jīng)處于GC中晚期,術(shù)后易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[2],化療有助于延長患者的生存時間,提高患者的生活質(zhì)量。然而,目前的化療藥物對GC的治療效果十分有限[3-4],因此亟待發(fā)掘新的化療藥物。
天然化合物沙蟾毒精(ArBu)是從中華大蟾蜍的蟾酥和蟾皮提取得到的一種新的潛在抗腫瘤成分[5],分子式為C24H32O6,分子量為416.5,目前已有諸多研究發(fā)現(xiàn)ArBu具有廣譜抗腫瘤活性,主要通過誘導(dǎo)細胞凋亡、抑制血管生成以及腫瘤細胞的黏附、遷移和侵襲發(fā)揮作用[6-8]。
鐵死亡(ferroptosis)是一種依賴于鐵代謝的新的程序性細胞死亡方式,即在二價鐵或脂氧合酶的作用下,催化細胞膜上高表達的不飽和脂肪酸,使活性氧(reactive oxygen species,ROS)積聚導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化,從而誘導(dǎo)細胞死亡[9-11]。越來越多的天然化合物被發(fā)現(xiàn)能通過鐵死亡途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[12],但未見研究報道ArBu誘導(dǎo)GC細胞鐵死亡。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是控制細胞氧化還原、動態(tài)平衡和炎癥的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,與鐵死亡氧化應(yīng)激通路密切相關(guān),Nrf2可以通過調(diào)控血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)和溶質(zhì)載體家族7成員11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)誘導(dǎo)鐵死亡[13-14]。因此,本研究旨在觀察ArBu是否能誘導(dǎo)人胃癌細胞系SGC-7901細胞發(fā)生鐵死亡,并探討其機制。
人胃癌細胞SGC-7901(中國科學院上海細胞庫),在含10%胎牛血清,1%青霉素鏈霉素混合液的RPMI-1640培養(yǎng)基中于37℃,5%CO2的條件下培養(yǎng)。
酶標儀(美國MD公司,iD3);細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司,BB150);生物安全柜(浙江蘇凈凈化公司,BSC-1000ⅡA2);離心機(德國Eppendorf公司,5418R);顯微鏡(德國徠卡公司,DMI6000B);透射電鏡(日本日立公司,Hitachi-600);蛋白電泳及轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國伯樂公司,Mini-PROTEAN);流式細胞儀(美國Beckman公司,F(xiàn)C500);凝膠成像儀(廣州博鷺騰生物科技有限公司,GelView6000Plus)。
ArBu[安徽華潤金蟾藥業(yè)股份有限公司提供,純度為94.1%,CAS:464-74-4,用二甲基亞砜(DMSO)(終濃度<0.1%)助溶后加入 RPMI-1640培養(yǎng)液配制];Fer-1(批號:#28329,規(guī)格:10 mmol·L-1×1 mL,MedChemExpress公司),CCK-8試劑盒(批號:2J226,麥客生物有限公司),谷胱甘肽(GSH)檢測試劑盒(批號:20220513)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(批號:20211124)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒(批號:20210923)(南京建成科技有限公司),脂質(zhì)ROS檢測試劑盒(批號:2011556,Thermo Fisher Scientific公司),BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號:092721220221,碧云天生物技術(shù)有限公司),細胞Fe含量檢測試劑盒(批號:BC5310,北京索萊寶公司),Nrf2抗體、谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)抗體(Cell Signaling Technology公司),SLC7A11抗體、鐵蛋白重鏈1(FTH1)抗體(Affinity Biosciences公司),HO-1抗體、β-actin抗體、二抗(正能生物技術(shù)有限責任公司),ECL顯影發(fā)光液(批號:22182599,蘭杰柯科技有限公司)。
將SGC-7901細胞接種到96孔板中培養(yǎng)過夜,每孔100 μL(5×103個),每組6個復(fù)孔,第2日將原培養(yǎng)基吸出,加入不同濃度的藥物培養(yǎng)基(0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μmol·L-1ArBu,5 μmol·L-1Fer-1,0.4 μmol·L-1ArBu+5 μmol·L-1Fer-1)的培養(yǎng)基100 μL繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h。每孔加入CCK-8試劑10 μL,繼續(xù)在培養(yǎng)箱里避光培養(yǎng)2 h。用酶標儀在450 nm波長處測定每孔的吸光度值A(chǔ),用不含細胞的培養(yǎng)基來校正。將細胞存活率輸入GraphPad 6.0 Prism 8.0.2計算IC50。細胞存活率(%)=[(A藥物-A空白)/(A對照-A空白)]×100%。
將細胞分為對照組(含同濃度DMSO)、ArBu中濃度組(0.4 μmol·L-1)和ArBu聯(lián)合Fer-1組(0.4 μmol·L-1+5 μmol·L-1)。細胞處理24 h后,分別用顯微鏡(×200)和透射電鏡(×7000)觀察細胞及線粒體形態(tài)變化。
將細胞分為對照組(含同濃度DMSO),ArBu低、中、高濃度組(0.2、0.4、0.8 μmol·L-1)和ArBu(0.4 μmol·L-1)聯(lián)合Fer-1(5 μmol·L-1)組。細胞處理24 h后,將SGC-7901細胞用胰酶消化收集于PBS中,并于4℃條件下超聲破碎成細胞勻漿,按照試劑盒說明書操作,檢測GSH、SOD、MDA和總Fe水平。用BCA法對細胞的蛋白水平進行定量。
細胞分組同“2.3”項下。細胞處理24 h后,棄去含藥培養(yǎng)基,加入含有C11-BODIPY581/591熒光探針的培養(yǎng)基,37℃避光孵育30 min,棄去培養(yǎng)基,用無血清培養(yǎng)基洗滌3次,收集細胞后用流式細胞儀檢測熒光強度。
將細胞分為對照組(含同濃度DMSO)、ArBu低、中、高濃度組(0.2、0.4、0.8 μmol·L-1),細胞處理24 h后收集細胞,提取總蛋白,BCA法進行蛋白定量,加入 5×loading buffer,100℃金屬浴煮沸10 min使蛋白變性。采用SDS凝膠電泳將蛋白質(zhì)分離,上樣10 μL蛋白樣品,電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5%脫脂牛奶封閉2 h,孵育相對應(yīng)的一抗(1∶1000),4℃過夜,二抗(1∶10 000)室溫孵育2 h。ECL顯影發(fā)光液顯色,凝膠成像儀拍照,Image J 6.0軟件分析條帶灰度值,計算相對表達量(%)=(目標蛋白÷參比蛋白β-actin的灰度值)×100%。
定量研究結(jié)果采用GraphPad Prism 8.0.2軟件進行分析并作圖。所有實驗都至少重復(fù)了3次。數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析(One-way,ANOVA)和Dunnett’s檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
ArBu處理SGC-7901細胞24 h和48 h的細胞存活率結(jié)果見圖1。與對照組相比,SGC-7901細胞的存活率隨著ArBu的濃度增大和處理時間的延長逐漸降低,24 h和48 h 的IC50值分別為0.46 μmol·L-1和0.26 μmol·L-1。因此,選擇0.2、0.4、0.8 μmol·L-1作為ArBu低、中、高濃度進行后續(xù)實驗。此外,與0.4 μmol·L-1ArBu處理組相比,ArBu聯(lián)合Fer-1組(0.4 μmol·L-1+5 μmol·L-1)細胞存活率明顯升高(P<0.01),說明ArBu抑制SGC-7901細胞增殖確實有鐵死亡參與,且Fer-1能部分逆轉(zhuǎn)鐵死亡所導(dǎo)致的細胞增殖的抑制。
圖1 ArBu對SGC-7901細胞存活率的影響Fig 1 Effect of ArBu on cell viability of SGC-7901 cells
ArBu處理SGC-7901細胞24 h后,與對照組相比,ArBu中濃度組(0.4 μmol·L-1)的細胞和線粒體失去正常形態(tài),明顯變形皺縮,線粒體嵴消失,線粒體和部分細胞死亡;與0.4 μmol·L-1ArBu處理組相比,ArBu聯(lián)合Fer-1組(0.4 μmol·L-1+5 μmol·L-1)與對照組細胞形態(tài)無明顯差異,線粒體并未皺縮變?。ㄒ妶D2)。
圖2 顯微鏡(×200)和透射電鏡(×7000)下0.4 μmol·L-1 ArBu以及聯(lián)合5 μmol·L-1 Fer-1處理SGC-7901細胞24 h后的細胞和線粒體形態(tài)圖Fig 2 Morphology of cells and mitochondria of SGC-7901 cells treated with 0.4 μmol·L-1 ArBu or combined with 5 μmol·L-1 Fer-1 for 24 h under microscope(×200)and transmission electron microscope(×7000)
ArBu處理SGC-7901細胞24 h后,與對照組相比,細胞內(nèi)GSH和SOD水平明顯降低(P<0.01),MDA和總Fe水平明顯升高(P<0.05,P<0.01),且都呈現(xiàn)出濃度依賴性;與0.4 μmol·L-1ArBu組相比,ArBu聯(lián)合Fer-1組(0.4 μmol·L-1+5 μmol·L-1)細胞內(nèi)GSH和SOD水平顯著升高(P<0.05),MDA和總Fe水平顯著降低(P<0.01)(見圖3)。
圖3 ArBu對SGC-7901細胞GSH、SOD、MDA和總Fe水平的影響Fig 3 Effect of ArBu on GSH,SOD,MDA and total Fe levels in SGC-7901 cells
ArBu處理SGC-7901細胞24 h后,與對照組相比,峰顯著右移,熒光更強,且呈濃度依賴性,與0.4 μmol·L-1ArBu組相比,ArBu聯(lián)合Fer-1組(0.4 μmol·L-1+5 μmol·L-1)峰明顯左移,熒光較弱(見圖4A)。細胞內(nèi)脂質(zhì)ROS水平變化見圖4B,與對照組相比,ArBu處理組細胞內(nèi)脂質(zhì)ROS水平明顯升高(P<0.01),且呈濃度依賴性。與0.4 μmol·L-1ArBu組相比,0.4 μmol·L-1ArBu聯(lián)合Fer-1(5 μmol·L-1)組細胞內(nèi)脂質(zhì)ROS水平顯著降低(P<0.05)。
圖4 ArBu對SGC-7901細胞脂質(zhì)ROS水平的影響Fig 4 Effect of ArBu on lipid ROS levels in SGC-7901 cells
與對照組相比,ArBu處理SGC-7901細胞24 h后,Nrf2、HO-1、SLC7A11、FTH1和GPX4的表達水平均降低(P<0.05),且呈濃度依賴性(見圖5)。說明ArBu能通過Nrf2-HO-1/SLC7A11途徑誘導(dǎo)SGC-7901細胞鐵死亡。
圖5 ArBu對SGC-7901細胞Nrf2-HO-1/SLC7A11途徑相關(guān)蛋白表達的影響Fig 5 Effect of ArBu on the expression of Nrf2-HO-1/SLC7A11 pathway-related proteins in SGC-7901 cells
GC占全球新發(fā)腫瘤病例的6%,我國是GC患者最多的國家,在2020年有47.85萬新發(fā)病例,37.38萬死亡病例,占全球GC新發(fā)病例和死亡病例的44.0%和48.6%[1]。尋找有效、安全、低毒的抗GC藥物已成為應(yīng)對這一威脅的主要策略。
近年來越來越多的天然藥物單體被發(fā)現(xiàn)有治療GC的潛力。蟾蜍毒的主要活性成分ArBu是一種天然甾體化合物,已被證明能在體內(nèi)外抑制多種細胞和腫瘤增殖,顯示出了良好的廣譜抗腫瘤活性。ArBu可作用于非小細胞肺癌(NSCLC)PC-9細胞和A549細胞,可引起染色質(zhì)固縮、核碎裂和凋亡小體的形成[15-16]。ArBu還可通過干擾信號通路誘導(dǎo)細胞凋亡和抑制血管生成,Zhang等[17]發(fā)現(xiàn)ArBu能通過PI3K/AKT/mTOR信號通路誘導(dǎo)肝癌細胞HepG2凋亡,Li等[18]發(fā)現(xiàn)通過VEGFR-2信號通路,ArBu可以抑制VEGF介導(dǎo)的血管生成,抑制血管內(nèi)細胞遷移和侵襲以及人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)的形成。本研究通過CCK-8法發(fā)現(xiàn),ArBu能顯著降低SGC-7901細胞的存活率且具有時間和濃度依賴性,24 h和48 h的IC50值僅為0.46 μmol·L-1和0.26 μmol·L-1,顯示ArBu具有良好的抗腫瘤細胞活性。
鐵死亡領(lǐng)域自從被發(fā)現(xiàn)以來就被聯(lián)想到與腫瘤相關(guān),鐵死亡的化學誘導(dǎo)劑也是在尋找新的抗腫瘤化合物過程中發(fā)現(xiàn)的[19-20]。鐵死亡的起始和執(zhí)行與氨基酸、脂質(zhì)和鐵代謝調(diào)節(jié)都有聯(lián)系,受到多種分子機制的調(diào)控。
當0.4 μmol·L-1ArBu與5 μmol·L-1鐵死亡特異性抑制劑 Fer-1聯(lián)用時,24 h和48 h的細胞存活率明顯升高(P<0.01),說明ArBu抑制SGC-7901細胞增殖可能與鐵死亡相關(guān)。用顯微鏡和透射電鏡觀察細胞和線粒體的形態(tài)變化時發(fā)現(xiàn),與對照組相比,ArBu處理SGC-7901細胞24 h后,細胞和線粒體明顯變形皺縮,部分細胞死亡,線粒體嵴消失;但當Fer-1聯(lián)合ArBu處理SGC-7901細胞24 h,細胞形態(tài)與對照組無明顯差異,線粒體并未皺縮變?。徊⑶已趸瘧?yīng)激相關(guān)指標GSH、SOD、MDA、總Fe和脂質(zhì)ROS的水平的變化,也證實了ArBu能誘導(dǎo)SGC-7901細胞發(fā)生鐵死亡。
Nrf2是控制細胞氧化還原、動態(tài)平衡和炎癥的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,同時與鐵死亡氧化應(yīng)激通路密切相關(guān),Nrf2作為轉(zhuǎn)錄因子促進SLC7A11和GPX4的表達,還調(diào)控下游的靶基因HO-1和FTH1[14,21-22]。GPX4對鐵死亡起到至關(guān)重要的調(diào)控作用,GPX4和細胞膜上的胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運受體(System Xc-)以及各種鐵死亡相關(guān)蛋白是通過影響ROS代謝發(fā)揮其功能的,GSH是GPX4催化脂質(zhì)過氧化物還原過程的主要輔助因子[23]。System Xc-由SLC7A11和 SLC3A2組成,能夠使細胞內(nèi)谷氨酸和細胞外胱氨酸進行1∶1交換[24],進入細胞內(nèi)的胱氨酸可被還原成半胱氨酸,參與GSH的合成。抑制System Xc-會導(dǎo)致GSH耗竭并間接誘導(dǎo)GPX4失活,最終導(dǎo)致ROS聚集,誘發(fā)鐵死亡[9]。Western blot結(jié)果顯示,ArBu處理細胞24 h后,Nrf2、SLC7A11和GPX4的表達水平明顯下降,可能是ArBu抑制了Nrf2的表達,Nrf2又下調(diào)了SLC7A11和GPX4的表達,而下調(diào)SLC7A11的表達會耗竭GSH,進一步抑制GPX4,GSH的試劑盒檢測結(jié)果也顯示ArBu能顯著降低GSH水平。
HO-1是一種重要的抗氧化酶,主要催化血紅素分解代謝成亞鐵、一氧化碳和膽綠素:一方面,血紅素基團的降解有利于阻止其促氧化作用;另一方面,副產(chǎn)物膽綠素及其還原型膽紅素具有有效ROS清除活性[25-27]。HO-1是細胞鐵離子的重要來源,在鐵死亡誘導(dǎo)劑erastin誘導(dǎo)的細胞死亡中,可以使膜脂質(zhì)過氧化誘導(dǎo)細胞發(fā)生鐵死亡[28]。鐵蛋白輕鏈(FTL)和FTH1可以將細胞中多余的鐵儲存在胞質(zhì)中[29],F(xiàn)TL和FTH1的失活會導(dǎo)致細胞內(nèi)鐵離子濃度因代謝失衡而升高。本研究結(jié)果顯示ArBu處理細胞24 h后,HO-1和FTH1的表達水平顯著降低,Nrf2表達的抑制可能下調(diào)了下游HO-1和FTH1的表達,從而導(dǎo)致鐵穩(wěn)態(tài)失衡,細胞內(nèi)亞鐵離子濃度升高發(fā)生芬頓反應(yīng)。
GPX4的抑制和芬頓反應(yīng)都會產(chǎn)生大量ROS,HO-1的抑制導(dǎo)致無法有效清除ROS,進一步加劇了ROS的大量蓄積,流式細胞術(shù)也證實了ArBu處理SGC-7901細胞24 h后,脂質(zhì)ROS水平顯著升高,而ROS的蓄積最終誘發(fā)細胞鐵死亡。
綜上,ArBu能抑制Nrf2-HO-1/SLC7A11途徑,破壞SGC-7901細胞的抗氧化應(yīng)激系統(tǒng),使細胞內(nèi)鐵代謝和GSH代謝失衡,亞鐵的大量存在導(dǎo)致芬頓反應(yīng)發(fā)生,GSH的耗竭使GPX4失活,HO-1的抑制使ROS無法有效清除,最終導(dǎo)致ROS蓄積,誘發(fā)鐵死亡,抑制SGC-7901細胞增殖。本研究表明ArBu對SGC-7901細胞具有良好的抗腫瘤活性,為ArBu治療GC提供了實驗依據(jù)。