沙蟾毒精通過Nrf2-HO-1/SLC7A11途徑誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細(xì)胞鐵死亡

王文君，劉霞霞，陳馨，程卉*，王國凱*（. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，合肥 23002；2. 新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230038；3. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研技術(shù)中心，合肥 230038）

胃癌（gastric cancer，GC）是全球最常見的惡性腫瘤之一，在消化道惡性腫瘤中排第二位，2020年新增100多萬病例，有76.9萬人死亡，發(fā)病率、病死率均較高[1]。多數(shù)患者確診時(shí)已經(jīng)處于GC中晚期，術(shù)后易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[2]，化療有助于延長患者的生存時(shí)間，提高患者的生活質(zhì)量。然而，目前的化療藥物對(duì)GC的治療效果十分有限[3-4]，因此亟待發(fā)掘新的化療藥物。

天然化合物沙蟾毒精（ArBu）是從中華大蟾蜍的蟾酥和蟾皮提取得到的一種新的潛在抗腫瘤成分[5]，分子式為C24H32O6，分子量為416.5，目前已有諸多研究發(fā)現(xiàn)ArBu具有廣譜抗腫瘤活性，主要通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制血管生成以及腫瘤細(xì)胞的黏附、遷移和侵襲發(fā)揮作用[6-8]。

鐵死亡（ferroptosis）是一種依賴于鐵代謝的新的程序性細(xì)胞死亡方式，即在二價(jià)鐵或脂氧合酶的作用下，催化細(xì)胞膜上高表達(dá)的不飽和脂肪酸，使活性氧（reactive oxygen species，ROS）積聚導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[9-11]。越來越多的天然化合物被發(fā)現(xiàn)能通過鐵死亡途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[12]，但未見研究報(bào)道ArBu誘導(dǎo)GC細(xì)胞鐵死亡。核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是控制細(xì)胞氧化還原、動(dòng)態(tài)平衡和炎癥的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，與鐵死亡氧化應(yīng)激通路密切相關(guān)，Nrf2可以通過調(diào)控血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）和溶質(zhì)載體家族7成員11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）誘導(dǎo)鐵死亡[13-14]。因此，本研究旨在觀察ArBu是否能誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞系SGC-7901細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，并探討其機(jī)制。

1 材料

1.1 腫瘤細(xì)胞

人胃癌細(xì)胞SGC-7901（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫），在含10%胎牛血清，1%青霉素鏈霉素混合液的RPMI-1640培養(yǎng)基中于37℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)。

1.2 儀器

酶標(biāo)儀（美國MD公司，iD3）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher公司，BB150）；生物安全柜（浙江蘇凈凈化公司，BSC-1000ⅡA2）；離心機(jī)（德國Eppendorf公司，5418R）；顯微鏡（德國徠卡公司，DMI6000B）；透射電鏡（日本日立公司，Hitachi-600）；蛋白電泳及轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國伯樂公司，Mini-PROTEAN）；流式細(xì)胞儀（美國Beckman公司，F(xiàn)C500）；凝膠成像儀（廣州博鷺騰生物科技有限公司，GelView6000Plus）。

1.3 試藥

ArBu[安徽華潤金蟾藥業(yè)股份有限公司提供，純度為94.1%，CAS：464-74-4，用二甲基亞砜（DMSO）（終濃度＜0.1%）助溶后加入 RPMI-1640培養(yǎng)液配制]；Fer-1（批號(hào)：#28329，規(guī)格：10 mmol·L-1×1 mL，MedChemExpress公司），CCK-8試劑盒（批號(hào)：2J226，麥客生物有限公司），谷胱甘肽（GSH）檢測試劑盒（批號(hào)：20220513）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（批號(hào)：20211124）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒（批號(hào)：20210923）（南京建成科技有限公司），脂質(zhì)ROS檢測試劑盒（批號(hào)：2011556，Thermo Fisher Scientific公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號(hào)：092721220221，碧云天生物技術(shù)有限公司），細(xì)胞Fe含量檢測試劑盒（批號(hào)：BC5310，北京索萊寶公司），Nrf2抗體、谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）抗體（Cell Signaling Technology公司），SLC7A11抗體、鐵蛋白重鏈1（FTH1）抗體（Affinity Biosciences公司），HO-1抗體、β-actin抗體、二抗（正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司），ECL顯影發(fā)光液（批號(hào)：22182599，蘭杰柯科技有限公司）。

2 方法

2.1 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

將SGC-7901細(xì)胞接種到96孔板中培養(yǎng)過夜，每孔100 μL（5×103個(gè)），每組6個(gè)復(fù)孔，第2日將原培養(yǎng)基吸出，加入不同濃度的藥物培養(yǎng)基（0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μmol·L-1ArBu，5 μmol·L-1Fer-1，0.4 μmol·L-1ArBu+5 μmol·L-1Fer-1）的培養(yǎng)基100 μL繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h。每孔加入CCK-8試劑10 μL，繼續(xù)在培養(yǎng)箱里避光培養(yǎng)2 h。用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定每孔的吸光度值A(chǔ)，用不含細(xì)胞的培養(yǎng)基來校正。將細(xì)胞存活率輸入GraphPad 6.0 Prism 8.0.2計(jì)算IC50。細(xì)胞存活率（%）＝[（A藥物-A空白）/（A對(duì)照-A空白）]×100%。

2.2 顯微鏡和透射電鏡觀察細(xì)胞及線粒體形態(tài)變化

將細(xì)胞分為對(duì)照組（含同濃度DMSO）、ArBu中濃度組（0.4 μmol·L-1）和ArBu聯(lián)合Fer-1組（0.4 μmol·L-1+5 μmol·L-1）。細(xì)胞處理24 h后，分別用顯微鏡（×200）和透射電鏡（×7000）觀察細(xì)胞及線粒體形態(tài)變化。

2.3 GSH、SOD、MDA和總Fe水平的測量

將細(xì)胞分為對(duì)照組（含同濃度DMSO），ArBu低、中、高濃度組（0.2、0.4、0.8 μmol·L-1）和ArBu（0.4 μmol·L-1）聯(lián)合Fer-1（5 μmol·L-1）組。細(xì)胞處理24 h后，將SGC-7901細(xì)胞用胰酶消化收集于PBS中，并于4℃條件下超聲破碎成細(xì)胞勻漿，按照試劑盒說明書操作，檢測GSH、SOD、MDA和總Fe水平。用BCA法對(duì)細(xì)胞的蛋白水平進(jìn)行定量。

2.4 脂質(zhì)ROS水平的測量

細(xì)胞分組同“2.3”項(xiàng)下。細(xì)胞處理24 h后，棄去含藥培養(yǎng)基，加入含有C11-BODIPY581/591熒光探針的培養(yǎng)基，37℃避光孵育30 min，棄去培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)基洗滌3次，收集細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度。

2.5 Western blot檢測蛋白表達(dá)

將細(xì)胞分為對(duì)照組（含同濃度DMSO）、ArBu低、中、高濃度組（0.2、0.4、0.8 μmol·L-1），細(xì)胞處理24 h后收集細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，加入 5×loading buffer，100℃金屬浴煮沸10 min使蛋白變性。采用SDS凝膠電泳將蛋白質(zhì)分離，上樣10 μL蛋白樣品，電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5%脫脂牛奶封閉2 h，孵育相對(duì)應(yīng)的一抗（1∶1000），4℃過夜，二抗（1∶10 000）室溫孵育2 h。ECL顯影發(fā)光液顯色，凝膠成像儀拍照，Image J 6.0軟件分析條帶灰度值，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量（%）＝（目標(biāo)蛋白÷參比蛋白β-actin的灰度值）×100%。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

定量研究結(jié)果采用GraphPad Prism 8.0.2軟件進(jìn)行分析并作圖。所有實(shí)驗(yàn)都至少重復(fù)了3次。數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（One-way，ANOVA）和Dunnett’s檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 ArBu抑制SGC-7901細(xì)胞增殖

ArBu處理SGC-7901細(xì)胞24 h和48 h的細(xì)胞存活率結(jié)果見圖1。與對(duì)照組相比，SGC-7901細(xì)胞的存活率隨著ArBu的濃度增大和處理時(shí)間的延長逐漸降低，24 h和48 h 的IC50值分別為0.46 μmol·L-1和0.26 μmol·L-1。因此，選擇0.2、0.4、0.8 μmol·L-1作為ArBu低、中、高濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。此外，與0.4 μmol·L-1ArBu處理組相比，ArBu聯(lián)合Fer-1組（0.4 μmol·L-1+5 μmol·L-1）細(xì)胞存活率明顯升高（P＜0.01），說明ArBu抑制SGC-7901細(xì)胞增殖確實(shí)有鐵死亡參與，且Fer-1能部分逆轉(zhuǎn)鐵死亡所導(dǎo)致的細(xì)胞增殖的抑制。

圖1 ArBu對(duì)SGC-7901細(xì)胞存活率的影響Fig 1 Effect of ArBu on cell viability of SGC-7901 cells

3.2 細(xì)胞形態(tài)變化

ArBu處理SGC-7901細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，ArBu中濃度組（0.4 μmol·L-1）的細(xì)胞和線粒體失去正常形態(tài)，明顯變形皺縮，線粒體嵴消失，線粒體和部分細(xì)胞死亡；與0.4 μmol·L-1ArBu處理組相比，ArBu聯(lián)合Fer-1組（0.4 μmol·L-1+5 μmol·L-1）與對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)無明顯差異，線粒體并未皺縮變?。ㄒ妶D2）。

圖2 顯微鏡（×200）和透射電鏡（×7000）下0.4 μmol·L-1 ArBu以及聯(lián)合5 μmol·L-1 Fer-1處理SGC-7901細(xì)胞24 h后的細(xì)胞和線粒體形態(tài)圖Fig 2 Morphology of cells and mitochondria of SGC-7901 cells treated with 0.4 μmol·L-1 ArBu or combined with 5 μmol·L-1 Fer-1 for 24 h under microscope（×200）and transmission electron microscope（×7000）

3.3 ArBu對(duì)SGC-7901細(xì)胞GSH、SOD、MDA和總Fe水平的影響

ArBu處理SGC-7901細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)GSH和SOD水平明顯降低（P＜0.01），MDA和總Fe水平明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），且都呈現(xiàn)出濃度依賴性；與0.4 μmol·L-1ArBu組相比，ArBu聯(lián)合Fer-1組（0.4 μmol·L-1+5 μmol·L-1）細(xì)胞內(nèi)GSH和SOD水平顯著升高（P＜0.05），MDA和總Fe水平顯著降低（P＜0.01）（見圖3）。

圖3 ArBu對(duì)SGC-7901細(xì)胞GSH、SOD、MDA和總Fe水平的影響Fig 3 Effect of ArBu on GSH，SOD，MDA and total Fe levels in SGC-7901 cells

3.4 ArBu對(duì)SGC-7901細(xì)胞脂質(zhì)ROS水平的影響

ArBu處理SGC-7901細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，峰顯著右移，熒光更強(qiáng)，且呈濃度依賴性，與0.4 μmol·L-1ArBu組相比，ArBu聯(lián)合Fer-1組（0.4 μmol·L-1+5 μmol·L-1）峰明顯左移，熒光較弱（見圖4A）。細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)ROS水平變化見圖4B，與對(duì)照組相比，ArBu處理組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)ROS水平明顯升高（P＜0.01），且呈濃度依賴性。與0.4 μmol·L-1ArBu組相比，0.4 μmol·L-1ArBu聯(lián)合Fer-1（5 μmol·L-1）組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)ROS水平顯著降低（P＜0.05）。

圖4 ArBu對(duì)SGC-7901細(xì)胞脂質(zhì)ROS水平的影響Fig 4 Effect of ArBu on lipid ROS levels in SGC-7901 cells

3.5 ArBu對(duì)SGC-7901細(xì)胞Nrf2-HO-1/SLC7A11途徑相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，ArBu處理SGC-7901細(xì)胞24 h后，Nrf2、HO-1、SLC7A11、FTH1和GPX4的表達(dá)水平均降低（P＜0.05），且呈濃度依賴性（見圖5）。說明ArBu能通過Nrf2-HO-1/SLC7A11途徑誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞鐵死亡。

圖5 ArBu對(duì)SGC-7901細(xì)胞Nrf2-HO-1/SLC7A11途徑相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig 5 Effect of ArBu on the expression of Nrf2-HO-1/SLC7A11 pathway-related proteins in SGC-7901 cells

4 討論

GC占全球新發(fā)腫瘤病例的6%，我國是GC患者最多的國家，在2020年有47.85萬新發(fā)病例，37.38萬死亡病例，占全球GC新發(fā)病例和死亡病例的44.0%和48.6%[1]。尋找有效、安全、低毒的抗GC藥物已成為應(yīng)對(duì)這一威脅的主要策略。

近年來越來越多的天然藥物單體被發(fā)現(xiàn)有治療GC的潛力。蟾蜍毒的主要活性成分ArBu是一種天然甾體化合物，已被證明能在體內(nèi)外抑制多種細(xì)胞和腫瘤增殖，顯示出了良好的廣譜抗腫瘤活性。ArBu可作用于非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）PC-9細(xì)胞和A549細(xì)胞，可引起染色質(zhì)固縮、核碎裂和凋亡小體的形成[15-16]。ArBu還可通過干擾信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制血管生成，Zhang等[17]發(fā)現(xiàn)ArBu能通過PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2凋亡，Li等[18]發(fā)現(xiàn)通過VEGFR-2信號(hào)通路，ArBu可以抑制VEGF介導(dǎo)的血管生成，抑制血管內(nèi)細(xì)胞遷移和侵襲以及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的形成。本研究通過CCK-8法發(fā)現(xiàn)，ArBu能顯著降低SGC-7901細(xì)胞的存活率且具有時(shí)間和濃度依賴性，24 h和48 h的IC50值僅為0.46 μmol·L-1和0.26 μmol·L-1，顯示ArBu具有良好的抗腫瘤細(xì)胞活性。

鐵死亡領(lǐng)域自從被發(fā)現(xiàn)以來就被聯(lián)想到與腫瘤相關(guān)，鐵死亡的化學(xué)誘導(dǎo)劑也是在尋找新的抗腫瘤化合物過程中發(fā)現(xiàn)的[19-20]。鐵死亡的起始和執(zhí)行與氨基酸、脂質(zhì)和鐵代謝調(diào)節(jié)都有聯(lián)系，受到多種分子機(jī)制的調(diào)控。

當(dāng)0.4 μmol·L-1ArBu與5 μmol·L-1鐵死亡特異性抑制劑 Fer-1聯(lián)用時(shí)，24 h和48 h的細(xì)胞存活率明顯升高（P＜0.01），說明ArBu抑制SGC-7901細(xì)胞增殖可能與鐵死亡相關(guān)。用顯微鏡和透射電鏡觀察細(xì)胞和線粒體的形態(tài)變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，ArBu處理SGC-7901細(xì)胞24 h后，細(xì)胞和線粒體明顯變形皺縮，部分細(xì)胞死亡，線粒體嵴消失；但當(dāng)Fer-1聯(lián)合ArBu處理SGC-7901細(xì)胞24 h，細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組無明顯差異，線粒體并未皺縮變??；并且氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)GSH、SOD、MDA、總Fe和脂質(zhì)ROS的水平的變化，也證實(shí)了ArBu能誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。

Nrf2是控制細(xì)胞氧化還原、動(dòng)態(tài)平衡和炎癥的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)與鐵死亡氧化應(yīng)激通路密切相關(guān)，Nrf2作為轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)SLC7A11和GPX4的表達(dá)，還調(diào)控下游的靶基因HO-1和FTH1[14，21-22]。GPX4對(duì)鐵死亡起到至關(guān)重要的調(diào)控作用，GPX4和細(xì)胞膜上的胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)受體（System Xc-）以及各種鐵死亡相關(guān)蛋白是通過影響ROS代謝發(fā)揮其功能的，GSH是GPX4催化脂質(zhì)過氧化物還原過程的主要輔助因子[23]。System Xc-由SLC7A11和 SLC3A2組成，能夠使細(xì)胞內(nèi)谷氨酸和細(xì)胞外胱氨酸進(jìn)行1∶1交換[24]，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的胱氨酸可被還原成半胱氨酸，參與GSH的合成。抑制System Xc-會(huì)導(dǎo)致GSH耗竭并間接誘導(dǎo)GPX4失活，最終導(dǎo)致ROS聚集，誘發(fā)鐵死亡[9]。Western blot結(jié)果顯示，ArBu處理細(xì)胞24 h后，Nrf2、SLC7A11和GPX4的表達(dá)水平明顯下降，可能是ArBu抑制了Nrf2的表達(dá)，Nrf2又下調(diào)了SLC7A11和GPX4的表達(dá)，而下調(diào)SLC7A11的表達(dá)會(huì)耗竭GSH，進(jìn)一步抑制GPX4，GSH的試劑盒檢測結(jié)果也顯示ArBu能顯著降低GSH水平。

HO-1是一種重要的抗氧化酶，主要催化血紅素分解代謝成亞鐵、一氧化碳和膽綠素：一方面，血紅素基團(tuán)的降解有利于阻止其促氧化作用；另一方面，副產(chǎn)物膽綠素及其還原型膽紅素具有有效ROS清除活性[25-27]。HO-1是細(xì)胞鐵離子的重要來源，在鐵死亡誘導(dǎo)劑erastin誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中，可以使膜脂質(zhì)過氧化誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[28]。鐵蛋白輕鏈（FTL）和FTH1可以將細(xì)胞中多余的鐵儲(chǔ)存在胞質(zhì)中[29]，F(xiàn)TL和FTH1的失活會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鐵離子濃度因代謝失衡而升高。本研究結(jié)果顯示ArBu處理細(xì)胞24 h后，HO-1和FTH1的表達(dá)水平顯著降低，Nrf2表達(dá)的抑制可能下調(diào)了下游HO-1和FTH1的表達(dá)，從而導(dǎo)致鐵穩(wěn)態(tài)失衡，細(xì)胞內(nèi)亞鐵離子濃度升高發(fā)生芬頓反應(yīng)。

GPX4的抑制和芬頓反應(yīng)都會(huì)產(chǎn)生大量ROS，HO-1的抑制導(dǎo)致無法有效清除ROS，進(jìn)一步加劇了ROS的大量蓄積，流式細(xì)胞術(shù)也證實(shí)了ArBu處理SGC-7901細(xì)胞24 h后，脂質(zhì)ROS水平顯著升高，而ROS的蓄積最終誘發(fā)細(xì)胞鐵死亡。

綜上，ArBu能抑制Nrf2-HO-1/SLC7A11途徑，破壞SGC-7901細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)，使細(xì)胞內(nèi)鐵代謝和GSH代謝失衡，亞鐵的大量存在導(dǎo)致芬頓反應(yīng)發(fā)生，GSH的耗竭使GPX4失活，HO-1的抑制使ROS無法有效清除，最終導(dǎo)致ROS蓄積，誘發(fā)鐵死亡，抑制SGC-7901細(xì)胞增殖。本研究表明ArBu對(duì)SGC-7901細(xì)胞具有良好的抗腫瘤活性，為ArBu治療GC提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。