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    重樓皂苷Ⅱ誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞B16F10鐵死亡的作用研究

    2023-04-01 05:28:46陳馨劉霞霞王文君王萌程卉安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院合肥230012安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研技術(shù)中心合肥230038
    中南藥學(xué) 2023年2期

    陳馨,劉霞霞,王文君,王萌,程卉*(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,合肥 230012;2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研技術(shù)中心,合肥 230038)

    惡性黑色素瘤是由黑色素細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化后形成的惡性腫瘤,其發(fā)病位置大多集中在皮膚表面,但有時也會在黏膜組織如眼脈絡(luò)膜等其他身體部位發(fā)現(xiàn)[1]。黑色素瘤的發(fā)展是一個動態(tài)的過程,容易發(fā)生轉(zhuǎn)移形成血管瘤,具有高侵襲性,是皮膚病變中病死率最高的一種疾病,目前其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢[2-5]。目前研究發(fā)現(xiàn)與鐵死亡相關(guān)的細(xì)胞死亡途徑對于黑色素瘤的調(diào)節(jié)具有關(guān)鍵作用,與未處理的細(xì)胞相比,鐵死亡抑制劑預(yù)處理細(xì)胞后會導(dǎo)致黑色素瘤細(xì)胞發(fā)生更多轉(zhuǎn)移[6]。這表明新的黑色素瘤的治療方法的開發(fā)可以從參與鐵死亡調(diào)節(jié)的靶點(diǎn)入手。

    鐵死亡是最近發(fā)現(xiàn)的一種調(diào)控細(xì)胞死亡形式。其形態(tài)學(xué)特征是存在比正常線粒體更小的線粒體,線粒體膜密度濃縮,線粒體嵴減少或消失,外線粒體膜破裂。而影響鐵死亡的因素有亞鐵、活性氧(ROS)和谷胱甘肽過氧化物酶 4(GPX4)[7]。在形態(tài)學(xué)、生化和遺傳水平上,鐵死亡與其他調(diào)控細(xì)胞死亡的形式不同。研究表明,人類和動物的多種生理條件和病理應(yīng)激均可引發(fā)鐵死亡[8]。

    重樓為合科植物云南重樓ParispolyphyllaSmithvar.Yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz .或七葉一枝花Paris polyphylla Smithvar.chinensis(Franch.)Hara 的干燥根莖[9],是一種常用中藥,至今有兩千多年的用藥歷史,性苦,微寒,具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚的功效。其化學(xué)成分主要有甾體皂苷類、胡蘿卜苷、氨基酸類的有效成分等,其中重樓皂苷Ⅱ是重樓主要有效成分之一。據(jù)報道,重樓皂苷Ⅱ在肺癌、膀胱癌、卵巢癌、黑色素瘤等癌癥中均表現(xiàn)出較好的抗腫瘤特性[10-14]。本實(shí)驗旨在研究重樓皂苷Ⅱ抑制黑色素瘤的增殖,并探討其抑制黑色素瘤B16F10細(xì)胞增殖是否通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞鐵死亡來介導(dǎo)。

    1 材料

    1.1 細(xì)胞株

    黑色素瘤細(xì)胞 B16F10(中國科學(xué)院細(xì)胞庫)。

    1.2 試藥

    重樓皂苷Ⅱ(純度91.4%,中國食品藥品檢定研究院)。胎牛血清(上海逍鵬生物科技有限公司);Roswell Park Memorial Institute-1640(RPMI-1640)培養(yǎng)基(武漢塞維爾生物科技有限公司);青霉素-鏈霉素溶液、ROS試劑盒、BCA蛋白濃度試劑盒、一抗稀釋液(碧云天生物技術(shù)有限公司);丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、谷胱甘肽(GSH)試劑盒、Fe 試劑盒(南京建成生物工程研究所);β-肌動蛋白(β-actin,成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司);谷胱甘肽過氧化物酶 4(GPX4,美國 Cell Signaling Technology公司);溶質(zhì)載體家族7成員11(SLC7A11)重組蛋白、重組人鐵蛋白重鏈1(FTH-1)(江蘇親科生物研究中心有限公司);?;o酶A合成酶長鏈家族成員4(ACSL4)重組蛋白(美國 abcam 公司);腫瘤蛋白53(P53)、山羊抗兔的 IgG-HRP 標(biāo)記(成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司);ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒(北京biosharp公司)。

    1.3 儀器

    CO2培養(yǎng)箱(美墨爾特貿(mào)易有限公司);全波段多功能酶標(biāo)儀iD3(美國 MD 公司);流式細(xì)胞儀FC500(美國 BECKMAN 公司);凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司);透射電子顯微鏡HITACHI-600(日本日立公司)。

    2 方法

    2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

    細(xì)胞在含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),并且置于37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每日更換培養(yǎng)基,取對數(shù)生長細(xì)胞,用于后續(xù)實(shí)驗。

    2.2 MTT法檢測細(xì)胞活力

    將黑色素瘤細(xì)胞B16F10以每孔5×103個細(xì)胞的密度接種于96孔板,待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%~80%后分別用0、1、2、4、8、16、32 μmol·L-1的重樓皂苷Ⅱ處理后培養(yǎng)24 h和48 h,采用MTT法檢測細(xì)胞存活率,在每孔中加入MTT(終質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1)后將細(xì)胞放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育4 h。吸棄舊培養(yǎng)基后加入二甲基亞砜溶解細(xì)胞中的甲瓚,并在搖床上震搖10 min。最后,在570 nm處檢測OD值。

    2.3 透射電鏡(TEM)觀察線粒體結(jié)構(gòu)

    取對數(shù)生長期的B16F10細(xì)胞,將細(xì)胞以2×106個·mL-1的密度接種于100 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng),待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%~80%后,分別用0、2 μmol·L-1的重樓皂苷Ⅱ處理后培養(yǎng)24 h后,收集細(xì)胞,離心去上清液(4500 r·min-1,10 min);用電鏡固定液(2.5%戊二醛)于4℃固定 24 h,四氧化鋨固定細(xì)胞25 min 以上,然后不同濃度的乙醇溶液將細(xì)胞團(tuán)塊梯度脫水并包埋于環(huán)氧樹脂中,使用電鏡專用切片機(jī)制成電鏡切片;醋酸雙氧鈾染色后再用醋酸鉛染色,于透射電子顯微鏡下觀察細(xì)胞并攝片。

    2.4 流式細(xì)胞儀檢測ROS含量

    取對數(shù)生長期的B16F10細(xì)胞,將細(xì)胞以2×105個·mL-1的密度接種于6孔板,待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%~80%后,分別用0、1、2、4 μmol·L-1的重樓皂苷Ⅱ處理后培養(yǎng)24 h。棄去舊培養(yǎng)基,加入用無血清培養(yǎng)液稀釋的 DCFHDA 探針,于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育 20 min后消化收集細(xì)胞于流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。實(shí)驗數(shù)據(jù)通過FlowJo_V10 軟件進(jìn)行分析。

    2.5 MDA含量的檢測

    取對數(shù)生長期的B16F10細(xì)胞,將細(xì)胞以2×105個·mL-1的密度接種于6孔板,待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%~80%后,分別用0、1、2、4 μmol·L-1的重樓皂苷Ⅱ處理后培養(yǎng)24 h。在冰上消化收集細(xì)胞,超聲破碎細(xì)胞后,根據(jù)MDA試劑盒說明書進(jìn)行操作。每組設(shè)3個復(fù)孔,使用酶標(biāo)儀在 532 nm 處測量吸光度A。

    2.6 SOD含量的檢測

    取對數(shù)生長期的B16F10細(xì)胞,將細(xì)胞以2×105個·mL-1的密度接種于6孔板,待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%~80%后,分別用0、1、2、4 μmol·L-1的重樓皂苷Ⅱ處理后培養(yǎng)24 h。在冰上消化收集細(xì)胞,超聲破碎細(xì)胞后,根據(jù) SOD試劑盒說明書進(jìn)行操作。每組設(shè)3個復(fù)孔,使用酶標(biāo)儀在 450 nm 處測量吸光度A。

    2.7 GSH含量的檢測

    取對數(shù)生長期的B16F10細(xì)胞,將細(xì)胞以2×105個·mL-1的密度接種于6孔板,待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%~80%后,分別用0、1、2、4 μmol·L-1的重樓皂苷Ⅱ處理后培養(yǎng)24 h。在冰上消化收集細(xì)胞,超聲破碎細(xì)胞后離心取上清液(3500 r·min-1,10 min),根據(jù) GSH 試劑盒說明書進(jìn)行操作。每組設(shè)3個復(fù)孔,使用酶標(biāo)儀在405 nm 處測量OD值。

    2.8 Fe含量的檢測

    取對數(shù)生長期的B16F10細(xì)胞,將細(xì)胞以2×105個·mL-1的密度接種于6孔板,待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%~80%后,分別用0、1、2、4 mol·L-1的重樓皂苷Ⅱ處理后培養(yǎng)24 h。在冰上消化收集細(xì)胞,超聲破碎細(xì)胞后離心取上清液(2500 r·min-1,10 min),根據(jù) Fe 試劑盒說明書進(jìn)行操作。每組設(shè)3個復(fù)孔,使用酶標(biāo)儀在520 nm 處測量吸光度A。

    2.9 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)

    取對數(shù)生長期的B16F10細(xì)胞,將細(xì)胞以2×106個·mL-1的密度接種于100 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng),待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%~80%后,用0、1、2、4 μmol·L-1的重樓皂苷Ⅱ處理后培養(yǎng)24 h。在冰上消化收集細(xì)胞,用含有磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液超聲提取蛋白。采用BCA蛋白測定法測定蛋白含量。加入10% SDS-PAGE處理蛋白質(zhì),加熱變性后,得到蛋白質(zhì)樣品。根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量的不同使用特定的電壓來分離蛋白質(zhì),分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝化纖維素濾膜上,在5%的脫脂牛奶中封膜,然后一抗4℃孵育過夜。主要抗體及稀釋比:β-actin(1∶1000);GPX4(1∶1000);SLC7A11(1∶1000);FTH-1(1∶1000);P53(1∶1000);ACSL4(1∶1000)。最后,用含有1%Tween-20的Tris緩沖鹽溶液沖洗3遍膜,在二抗(1∶10 000)中室溫孵育2 h。使用ECL試劑盒顯色在凝膠分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測,使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值,計算目的蛋白相對表達(dá)量。

    2.10 統(tǒng)計學(xué)分析

    所有數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組均數(shù)比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用配對t檢驗,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 重樓皂苷Ⅱ?qū)谏亓鯞16F10細(xì)胞的抑制作用

    MTT結(jié)果表明,與空白組比較,B16F10細(xì)胞存活率隨著重樓皂苷Ⅱ作用劑量的增大和時間的延長而降低(P<0.01,見圖1)。重樓皂苷Ⅱ作用于黑色素瘤細(xì)胞B16F10 24 h和48 h后的IC50值分別為(1.568±0.219)、(1.293±0.199)μmol·L-1,綜合考慮以1、2、4 μmol·L-1為后續(xù)實(shí)驗重樓皂苷Ⅱ的低、中、高劑量。

    圖1 重樓皂苷Ⅱ?qū)16F10細(xì)胞活力的影響Fig 1 Effect of polyphyllinⅡ on the viability of B16F10 cells

    3.2 重樓皂苷Ⅱ?qū)谏亓鯞16F10細(xì)胞中線粒體結(jié)構(gòu)的影響

    透射電鏡觀察B16F10 細(xì)胞線粒體的形態(tài)和微觀結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),空白組細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)完整,細(xì)胞核膜明顯,線粒體結(jié)構(gòu)清晰;重樓皂苷Ⅱ(2 μmol·L-1)作用細(xì)胞后,細(xì)胞核形態(tài)不完整,細(xì)胞核的核膜破裂,線粒體明顯皺縮變小,線粒體的膜密度明顯增加(見圖2),這些都是細(xì)胞發(fā)生鐵死亡的重要特征。

    圖2 透射電鏡下B16F10細(xì)胞線粒體的結(jié)構(gòu)(×4000)Fig 2 Structure of mitochondria in B16F10 cells observed under transmission electron microscope(×4000)

    3.3 重樓皂苷Ⅱ?qū)谏亓鯞16F10細(xì)胞ROS的影響

    結(jié)果顯示,ROS隨著重樓皂苷Ⅱ給藥濃度的增加在B16F10細(xì)胞中不斷積累,與空白組相比,ROS的含量顯著上升,且具有劑量依賴性(見圖3)。

    圖3 重樓皂苷Ⅱ?qū)16F10細(xì)胞ROS含量的影響Fig 3 Effect of polyphyllinⅡ on the ROS content of B16F10 cells

    3.4 重樓皂苷Ⅱ?qū)谏亓鯞16F10細(xì)胞MDA、SOD、GSH和Fe含量的影響

    結(jié)果顯示MDA和Fe的含量隨著重樓皂苷Ⅱ給藥濃度的增大而升高,與空白組比較,中、高劑量組差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01);SOD和GSH的含量隨著重樓皂苷Ⅱ給藥濃度的增大而顯著降低,與空白組比較,中、高劑量組差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)(見圖4)。

    圖4 重樓皂苷Ⅱ?qū)16F10細(xì)胞中MDA、SOD、GSH和Fe含量的影響Fig 4 Effect of polyphyllinⅡ on the content of MDA,SOD,GSH and Fe in B16F10 cells

    3.5 重樓皂苷Ⅱ?qū)谏亓鯞16F10細(xì)胞鐵死亡相關(guān)蛋白的影響

    與空白組比較,鐵死亡標(biāo)志性蛋白GPX4、FTH-1、SLC7A11在重樓皂苷Ⅱ作用于B16F10細(xì)胞后的表達(dá)水平呈下降趨勢(P<0.05,P<0.01),且呈現(xiàn)劑量依賴性;而P53和ACSL4在中、高劑量重樓皂苷Ⅱ作用于B16F10細(xì)胞后的表達(dá)水平呈上升趨勢(P<0.01)(見圖5)。

    圖5 重樓皂苷Ⅱ?qū)16F10細(xì)胞中鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig 5 Effect of polyphyllinⅡ on the expression of ferroptosis-related proteins in B16F10 cells

    4 討論

    黑色素瘤是一種來源于皮膚表皮層中黑色素細(xì)胞的皮膚惡性腫瘤[15],作為一種侵襲性皮膚癌,皮膚惡性黑素瘤導(dǎo)致的相關(guān)死亡在所有皮膚癌中占75%[3],目前治療黑色素瘤主要以手術(shù)切除為主,輔助放化療和免疫治療,但治療效果有限,亟待開發(fā)新的有效治療手段[16]。鐵死亡是Dixon在2012年首次提出的一種新的細(xì)胞死亡方式[17]。研究表明,鐵死亡可能是由人類和動物的多種生理條件和病理應(yīng)激引起的[18]。目前鐵死亡已經(jīng)逐漸成為消除惡性細(xì)胞的關(guān)鍵特征之一,它通過去除環(huán)境中缺乏關(guān)鍵營養(yǎng)素或因感染或環(huán)境應(yīng)激而受損的細(xì)胞,在抑制腫瘤發(fā)生中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[19]。重樓皂苷Ⅱ是中藥重樓的有效成分之一,具有抑制多種腫瘤的作用[20-22]。本實(shí)驗通過重樓皂苷Ⅱ作用于黑色素瘤細(xì)胞B16F10,從體外研究發(fā)現(xiàn)重樓皂苷Ⅱ可以通過誘導(dǎo)B16F10細(xì)胞發(fā)生鐵死亡從而抑制細(xì)胞增殖生長。

    鐵死亡是一種由GPX4活性喪失和隨后產(chǎn)生的ROS積累引起細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)形式,主要依賴鐵和ROS的調(diào)控[23]。SOD和GSH是維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的重要核心組成部分,任何使GSH和SOD減少的因素都會引起細(xì)胞內(nèi) ROS 水平的升高。MDA可能由于脂質(zhì)氧化而受到大量自由基的影響而增加,是一種脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志物,可以直接反映細(xì)胞氧化應(yīng)激水平[24]。此外,鐵作為一種催化劑,將過氧化物轉(zhuǎn)化為自由基,發(fā)生芬頓反應(yīng),這可能是鐵死亡誘導(dǎo)細(xì)胞死亡發(fā)生所起到的作用[23]。重樓皂苷Ⅱ可以在B16F10細(xì)胞內(nèi)增加MDA 含量,降低SOD和GSH的含量從而引起的大量ROS積累。表明重樓皂苷Ⅱ可以引起B(yǎng)16F10細(xì)胞中ROS和鐵的積累從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。

    抑癌蛋白P53可以引起腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯、衰老、凋亡等,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的作用。P53還可調(diào)節(jié)大量不同的細(xì)胞功能,如代謝調(diào)節(jié)、ROS應(yīng)激反應(yīng)和鐵死亡,這些新出現(xiàn)的功能在P53介導(dǎo)的腫瘤抑制中發(fā)揮關(guān)鍵作用[25]。P53由于其可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡,所以仍然發(fā)揮抑制腫瘤增殖的能力[19]。研究表明SLC7A11基因是P53介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制的一個靶點(diǎn)[26],SLC7A11是胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體的一個組成部分,通過介導(dǎo)胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)促進(jìn)GSH的合成,而GSH是主要的細(xì)胞抗氧化劑,可以抑制ROS的累積,對ROS誘導(dǎo)的鐵死亡至關(guān)重要[7]。P53的激活可以抑制SLC7A11的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而減少了胱氨酸的攝取,這反過來又限制了細(xì)胞內(nèi) GSH的產(chǎn)生。因此,ROS誘導(dǎo)的鐵死亡在P53激活的細(xì)胞中明顯增加[27]。實(shí)驗結(jié)果表明重樓皂苷Ⅱ可以通過促進(jìn)P53 的表達(dá)、抑制SLC7A11 的表達(dá),從而促進(jìn)細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生。

    GPX4可以作為判斷細(xì)胞鐵死亡的指標(biāo)之一,GPX4將GSH轉(zhuǎn)化為氧化型谷胱甘肽(GSSG),同時將脂質(zhì)氫過氧化物轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醇或游離過氧化氫轉(zhuǎn)化為水[7]。FTH-1是鐵蛋白重鏈1,在鐵蛋白結(jié)構(gòu)中起到關(guān)鍵作用,也是鐵死亡發(fā)生的標(biāo)志性蛋白。ACSL4可以通過參與易被氧化的膜磷脂合成過程而成為鐵死亡發(fā)生的必需分子[28]。GPX4、FTH-1蛋白的表達(dá)隨著重樓皂苷Ⅱ的濃度的增加而下降,而ACSL4蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢。這些重要蛋白分子表達(dá)水平的變化顯示重樓皂苷Ⅱ?qū)16F10細(xì)胞的抑制作用可能與鐵死亡相關(guān)。

    綜上所述,本研究初步證明了鐵死亡是重樓皂苷Ⅱ誘導(dǎo)黑色素細(xì)胞B16F10細(xì)胞發(fā)生死亡的重要途徑,但是發(fā)生鐵死亡的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步實(shí)驗研究驗證。

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