山藥塊莖膨大期淀粉積累及淀粉合成相關(guān)基因表達分析

索寧寧，張艷芳，高圓麗，趙令敏，葛明然，劉杰才，霍秀文

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝與植物保護學(xué)院 呼和浩特 010019）

山 藥（Dioscorea oppositaThunb.）是 薯 蕷 科（Dioscoreaceae）薯蕷屬（DioscoreaL.）一年生或多年生纏繞性草質(zhì)藤本，為單子葉植物[1]。山藥塊莖中含有豐富的淀粉（70%）、蛋白質(zhì)（9%）、還富含礦物質(zhì)、尿囊素、皂苷等活性物質(zhì)，并且與其他作物如馬鈴薯、木薯和甘薯相比，山藥有著更好的感官特性，因此，近年來對山藥的需求量逐年增多[2]。

淀粉是山藥塊莖中最豐富的碳水化合物，含量約占塊莖干質(zhì)量的80%左右。淀粉積累不僅影響塊莖膨大，對山藥直接經(jīng)濟效益的產(chǎn)生和品質(zhì)形成也具有重要作用。前人通過對馬鈴薯塊莖的研究發(fā)現(xiàn)，葉片光合作用產(chǎn)生的同化物以蔗糖的形式通過韌皮部輸送到塊莖內(nèi)，然后經(jīng)由ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（glucose-1-phosphate adenylyltransferase，AGPase）、可 溶 性 淀 粉 合 成 酶（starch synthase，SSS）、束縛態(tài)淀粉合成酶（granule bound starch synthase，GBSS）、淀粉分支酶（starch-branching enzyme，SBE）等淀粉合成關(guān)鍵酶的協(xié)同作用催化淀粉的合成[3]。AGPase 催化形成淀粉合成的底物ADPG，是途徑中的關(guān)鍵酶和限速酶。據(jù)前人報道，利用Patatin 啟動子驅(qū)動馬鈴薯AGPase表達，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的淀粉含量較野生型提高了35%[4]。利用基因沉默抑制AGPase表達，馬鈴薯淀粉含量比對照低4%～35%[5]。馬鈴薯塊莖中AGPase的下調(diào)會引起GBSSI的表達[6]。GBSS 主要負(fù)責(zé)直鏈淀粉的合成，還未有其他合酶可以取代該功能。Kitahara等[7]利用RNAi 技術(shù)抑制GBSSI表達，發(fā)現(xiàn)GBSS不僅有助于直鏈淀粉的積累，而且還參與支鏈淀粉長鏈的合成。根據(jù)氨基酸序列的相似性，SSS 被分成多種異構(gòu)體，在塊莖作物中主要是指SSⅡ和SSⅢ，其在支鏈淀粉的合成中起重要作用[8-9]。擬南芥SSⅡ的缺失不會影響葉片生長速度和淀粉的含量，但抑制了中等長度支鏈淀粉的合成，這在馬鈴薯塊莖的研究中也得到了類似的結(jié)果[10-11]。SSⅢ的過表達會使細(xì)胞中產(chǎn)生大量的小淀粉粒，中心位置通常有裂紋[10]。SBE 主要包含兩類同工酶SBEⅠ和SBEⅡ；主要影響支鏈淀粉的分支[12]。抑制SBEⅡ的表達，馬鈴薯淀粉粒結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，支鏈淀粉和直鏈淀粉的含量增加；抑制SBEⅠ的表達對直鏈淀粉含量的影響不顯著；而同時下調(diào)SBEⅠ和SBEⅡ，馬鈴薯中直鏈淀粉含量增加75%[13-14]。異淀粉酶、普魯蘭酶（pullulanase，PUL）及蔗糖合成酶（sucrose synthase，SUS）也參與了淀粉合成。增強轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中SUS 的活性，塊莖的淀粉含量和產(chǎn)量也得到提高[15]。此外，一些代謝物如3-磷酸甘油酸、焦磷酸鹽等可以激活或抑制淀粉合成相關(guān)酶的活性進而影響淀粉積累[16]。近年來，基于山藥塊莖的生長分析、營養(yǎng)成分分析、細(xì)胞學(xué)特征分析或分子水平評價等對山藥的淀粉積累特性和淀粉代謝調(diào)控方面的研究逐漸變多[17-19]。然而，迄今關(guān)于山藥塊莖淀粉合成關(guān)鍵酶與其編碼基因表達量的綜合性分析卻鮮有研究，諸多未知點有待進一步挖掘。

為此，筆者以田間條件下內(nèi)蒙古主栽山藥品種大和長芋為試驗材料，研究塊莖膨大期淀粉的積累及相關(guān)淀粉合成關(guān)鍵酶的基因表達和活性變化；分析淀粉積累與相關(guān)淀粉合成關(guān)鍵酶活性和基因表達的相關(guān)性；通過通徑分析進一步探索其對各類淀粉積累的影響。這不僅有助于揭示山藥塊莖淀粉合成的分子機制，而且對旨在獲得高淀粉含量、高品質(zhì)性狀的山藥育種目標(biāo)具有實踐指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

山藥品種為大和長芋山藥（Dioscorea opposita‘Dahechangyu’），為筆者所在課題組上一年收獲的自留種，于2021 年5 月初至10 月末種植在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)山藥種質(zhì)資源圃。試驗選取15 cm 左右晾曬好的的山藥栽子播種，采用搭架栽培、雙行種植的方式，行距60 cm，株距20 cm，于5 月7 日人工種植，常規(guī)田間管理。

1.2 方法

內(nèi)蒙古地區(qū)大和長芋山藥約在種植后75 d 塊莖開始膨大，165 d 截止。試驗于種植后的90、105、120、135、150、165 d 取樣，每個時期設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)，每次重復(fù)隨機挖取3 株長勢一致的山藥進行地下塊莖采樣。去除殘留土壤后，從塊莖中部稱取2 g，3 株等量混樣，用錫紙包裹并標(biāo)記，液氮速凍，-80 ℃凍存。

1.3 項目測定

1.3.1 山藥塊莖形態(tài)指標(biāo)的測定 用游標(biāo)卡尺和軟尺測量清洗干凈后塊莖的直徑和長度，電子秤稱取塊莖質(zhì)量。

1.3.2 淀粉含量的測定 參照崔晉[20]等利用雙波長法測定塊莖淀粉含量。支鏈淀粉含量測定以538 nm 為測定波長，758 nm 為參比波長；直鏈淀粉含量測定以624 nm 為測定波長，410 nm 為參比波長。總淀粉含量/%=直鏈淀粉含量（%）+支鏈淀粉含量（%）。

1.3.3 淀粉形成關(guān)鍵酶活性的測定 稱取約1.0 g左右的塊莖，在預(yù)冷的研缽中磨成粉末，加入5 mL提取液［含100 mmol·L-1pH 7.5 的HEPES-NaOH，2 mmol·L-1EDTA，8 mmol·L-1MgCl2，12.5%甘油；50 mmol·L-1β-巰基乙醇，1% PVP-40］，再次研磨后，在4 ℃10 000 r·min-1離心15 min，上清液作為測定AGPase、SSS 和SBE 活性的粗酶液。沉淀中再次加入5 mL 提取液，振蕩懸浮均勻后作為測定GBSS 活性的粗酶液。參考程方民等[21]的方法測定AGPase、SSS 和GBSS 活性。SBE 活性測定參照李太貴等[22]和趙法茂等[23]的方法。

1.3.4 淀粉形成關(guān)鍵酶的基因表達量 從-80 ℃凍存的塊莖樣品中提取總RNA。吸取2 μg 提取出的總RNA 利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit）合成單鏈cDNA。從筆者課題組前期山藥轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中獲得AGPase、SSII、SSIII、GBSSI、SBEI、SBEII的基因序列，使用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計用于實時熒光定量PCR（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）的引物（表1）。以合成的cDNA 為模板，山藥的18S為內(nèi)參基因，利用TagSYBR?Green qPCR Kit（Bio- Rad）試 劑 盒 進 行qRT-PCR。擴增反應(yīng)結(jié)束后，繪制熔解曲線以確保引物的特異性。每個基因分析設(shè)置3 次重復(fù)，2?ΔΔCT法計算基因的相對表達量。

表1 用于qRT-PCR 的引物序列

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2021 進行試驗數(shù)據(jù)分析及制圖，采用SPSS v27.0 軟件進行方差分析、相關(guān)性分析及通徑分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 山藥塊莖形態(tài)指標(biāo)的變化

由圖1 可知，整體來看，塊莖質(zhì)量、直徑和長度的生長曲線呈“S”形變化。隨著塊莖的膨大，其質(zhì)量、長度和直徑不斷增加，種植后90～150 d 是其快速增長期，完成整個膨大期質(zhì)量、長度和直徑增長的80%左右，150 d 后其生長速度放緩，進入平臺期。

圖1 山藥塊莖形態(tài)指標(biāo)的變化

2.2 山藥塊莖中淀粉含量的變化

由圖2-A 可知，塊莖總淀粉含量隨時間推進呈升高趨勢，且90、105、120 d 間差異顯著，這段時期淀粉積累迅速，而135 d 以后淀粉積累基本進入平臺期。直鏈淀粉在整個膨大期含量較低，最高時（135 d）約占總淀粉含量的10%（圖2-B）。支鏈淀粉含量變化的總體趨勢與總淀粉含量相似，種植后135～165 d 差異不顯著（圖2-C）。山藥種植后90 d 淀粉直/支比為0.253，而150 d 時直/支比減少為0.132（圖2-D）；150 d 時，支鏈淀粉的積累達到峰值，占總淀粉含量的88.35%。因此，山藥塊莖總淀粉含量的增加主要是由于支鏈淀粉的積累。

圖2 山藥塊莖中淀粉含量的變化

2.3 山藥塊莖中淀粉形成關(guān)鍵酶活性的變化

隨著種植時間的推移，山藥塊莖中淀粉形成 關(guān) 鍵 酶AGPase、SSS、GBSS 和SBE 活 性 變化基本一致，均在90～135 d 酶活性提高，并且都在135 d 時達到峰值，135～165 d 又顯著降低（圖3）。

圖3 山藥塊莖中淀粉形成關(guān)鍵酶活性的變化

2.4 山藥塊莖中淀粉合成關(guān)鍵酶的基因表達量

為進一步了解塊莖中淀粉合成關(guān)鍵酶相關(guān)基因的表達及其在塊莖發(fā)育中的作用，采用qRT-PCR對6 個基因的轉(zhuǎn)錄水平進行了研究。AGPase的表達量在135 d 之前顯著增加，然后在150 d 后顯著下降到120 d 前的水平（圖4-A）。SSⅡ在塊莖中的表達量基本穩(wěn)定，135 d 時有顯著高表達（圖4-B）。SSⅢ在90～105 d 的表達量較低，且無顯著差異；120 d 后SSⅢ的表達量顯著升高，135 d 達到最大值后又顯著降低（圖4-C）。GBSSⅠ在塊莖中的表達量呈“升-降-升-降”波浪變化趨勢，且在105 d 的表達量顯著高于其他時期（圖4-D）。SBEⅠ基因從105 d顯著升高后一直保持在恒定的高表達量水平，然后在165 d 顯著降低（圖4-E）。SBEⅡ與SSⅡ的表達模式相似，在整個膨大期保持恒定的高表達量水平（圖4-F）。

圖4 山藥塊莖中淀粉合成關(guān)鍵酶的基因表達變化

2.5 山藥塊莖淀粉積累的相關(guān)性分析

筆者的研究中，塊莖淀粉含量與淀粉合成關(guān)鍵酶活性及其基因表達呈正相關(guān)（表2）。塊莖總淀粉含量與AGPase、SBE 活性呈極顯著正相關(guān)。支鏈淀粉含量與AGPase、SBE 活性也呈極顯著正相關(guān)，與SSS 活性呈正相關(guān)。直鏈淀粉含量與4 種淀粉合成關(guān)鍵酶活性均呈正相關(guān)。說明AGPase、SSS、GBSS、SBE 等活性在塊莖淀粉合成中發(fā)揮了重要作用。因此，在一定范圍內(nèi)，當(dāng)參與山藥塊莖淀粉合成的這些酶的活性越高，越有利于淀粉的積累。塊莖總淀粉含量與AGPase、SSⅡ、SSⅢ、SBEⅡ等基因的表達量呈極顯著正相關(guān)，與SBEⅠ基因的表達量呈顯著正相關(guān)。與總淀粉含量一致，支鏈淀粉含量與AGPase、SSⅡ、SSⅢ、SBEⅡ等基因的表達量也呈極顯著正相關(guān)，與SBEⅠ基因的表達量呈顯著正相關(guān)。直鏈淀粉含量與淀粉合成關(guān)鍵酶基因的表達量均為顯著或極顯著正相關(guān)，表明這些編碼淀粉合成關(guān)鍵酶的基因表達量與山藥塊莖淀粉的積累有密切的聯(lián)系。

表2 塊莖淀粉積累的相關(guān)性分析

2.6 山藥塊莖淀粉積累的通徑分析

借助通徑分析進一步研究淀粉合成關(guān)鍵酶及其相對基因表達量對總淀粉、支鏈淀粉和直鏈淀粉積累的影響（表3）。直接通徑系數(shù)表明，SBE（S4）是對總淀粉和支鏈淀粉積累唯一表現(xiàn)為直接正效應(yīng)（0.897，0.874）的淀粉合成關(guān)鍵酶；通過SBE 的間接影響，AGPase（S1）、SSS（S2）、GBSS（S3）對總淀粉和支鏈淀粉積累又表現(xiàn)了一定的間接正效應(yīng)（0.785、0.634、0.421；0.765、0.618、0.410）。AGPase、SSS 雖然對支鏈淀粉積累表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)（-0.329，-0.234），但其通過GBSS、SBE 等其他因子對支鏈淀粉積累產(chǎn)生了間接正效應(yīng)（合計0.920，0.435），抵消了它們的直接負(fù)效應(yīng)。AGPase 和GBSS 對直鏈淀粉積累直接貢獻作用僅次于SBE。

表3 塊莖淀粉積累的通經(jīng)分析

AGPase（S5）、SSⅡ（S6）、SSⅢ（S7）、GBSSⅠ（S8）、SBEⅠ（S9）、SBEⅡ（S10）對塊莖總淀粉和支鏈淀粉積累的影響均為間接通徑系數(shù)大于直接通徑系數(shù)，說明這些作用因子都通過其剩余因子的間接作用來調(diào)控淀粉積累。AGPase和GBSSⅠ兩類基因的表達量對支鏈淀粉積累表現(xiàn)為直接負(fù)效應(yīng)（-0.023，-0.212）。GBSSⅠ和SBEⅡ?qū)χ辨湹矸鄯e累表現(xiàn)了一定的直接正效應(yīng)（0.246，0.458），又表現(xiàn)了間接正效應(yīng)（0.298，0.336）。

3 討論與結(jié)論

淀粉是植物體內(nèi)主要的碳水化合物儲存庫，廣泛存在于光合組織以及非光合組織中，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)研究的重點[9]。在山藥塊莖中，淀粉是含量最豐富的碳水化合物，種植后90～150 d 是其快速增長期，與此同時，塊莖也在快速膨大，所以，塊莖的膨大與淀粉的積累密切相關(guān)，淀粉是山藥塊莖質(zhì)量、長度、粗度變化的重要貢獻因子[17]。然而，目前關(guān)于山藥塊莖淀粉生物合成的機制尚不明晰。淀粉有直鏈淀粉和支鏈淀粉兩種存在形式，通過直鏈淀粉與支鏈淀粉含量的比值能夠快速評判糧食作物食味品質(zhì)的優(yōu)劣[24]。成熟山藥塊莖中支鏈淀粉約占總淀粉含量的80%，直鏈淀粉占20%左右[20]。支鏈淀粉含量高的淀粉往往黏性也較高，口感柔軟；糯玉米淀粉主要由支鏈淀粉組成，直鏈淀粉很少[25]。在筆者的試驗中，塊莖膨大期間直/支比呈逐漸下降的趨勢，支鏈淀粉含量變化的總體趨勢與總淀粉含量相似，總淀粉含量的增加主要是支鏈淀粉含量的增加，這與柳強娟等[3]在馬鈴薯上的研究結(jié)果一致；甘薯塊莖膨大期淀粉直/支比呈現(xiàn)波浪狀曲線的變化趨勢，與筆者研究中直/支比呈顯著下降的趨勢略有不同，這可能是與物種、氣候條件差異有關(guān)；但柳強娟等[3]發(fā)現(xiàn)在甘薯種植后80～110 d 直/支比顯著下降，有可能是這段時期直鏈淀粉積累速率明顯小于支鏈淀粉的緣故，這與筆者的研究結(jié)果一致[26]。

淀粉合成開始于1-磷酸葡萄糖和ATP 在AGPase 的催化下合成ADPG，該反應(yīng)是淀粉合成的中樞限速步驟，催化淀粉底物的合成，決定著淀粉合成和積累的速率[27]。SBE基因的表達模式和活性對支鏈淀粉的合成有重要影響，對最終淀粉積累及貯藏器官的生長發(fā)育有關(guān)鍵作用[28]。據(jù)報道，同時抑制SBEⅠ和SBEⅡ小麥直鏈淀粉含量從25.5%提高到70.0%[29]；而SBE的過表達可使轉(zhuǎn)基因水稻支鏈淀粉分支數(shù)增加[30]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，淀粉形成關(guān)鍵酶AGPase、SSS、SBE 在山藥塊莖淀粉積累過程中活性變化基本一致，呈先不斷升高后顯著降低的趨勢，種植后135 d 時活性都達到最大值，AGPase、SBE 與支鏈淀粉的積累呈極顯著正相關(guān)，這與馬鈴薯[3]、葛根[31]等的試驗結(jié)果相符。前人研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯塊莖形成過程中淀粉合成關(guān)鍵酶基因AGPase、SSⅡ、SSⅢ、SBEⅡ的相對表達量均呈不斷上升的趨勢[32]。筆者研究中AGPase、SSⅡ、SSⅢ、SBEⅡ基因的相對表達水平在135 d 前持續(xù)增高，并與支鏈淀粉含量呈極顯著正相關(guān)，這與蘇旺等[32]的研究結(jié)果一致。

已有前人研究指出支鏈淀粉的合成需要淀粉合成相關(guān)酶之間一定程度的協(xié)調(diào)配合來實現(xiàn)[33]。對小麥胚乳支鏈淀粉的試驗表明，支鏈淀粉合成中一些關(guān)鍵酶的磷酸化使其形成蛋白異聚復(fù)合物。前人對玉米淀粉體的研究表明，SSⅠ、SSⅡ和SBEⅡ之間存在蛋白-蛋白相互作用，復(fù)合物的形成依賴于蛋白質(zhì) 磷 酸 化[34]。SSI-SBEIIa、SSI-SBEIIb 和SSIIa-SBEIIb 蛋白質(zhì)的相互作用在小麥、玉米、水稻中很常見[33]。水稻中還報道了SBEⅠ與PUL 的相互作用[35]。山藥作為一種具有雙子葉植物特征的單子葉植物，淀粉的積累主要在地下塊莖中進行而不是玉米、小麥、水稻等作物的胚乳，這可能導(dǎo)致與其相比，淀粉合成和積累的功能機制不同。筆者研究中參與淀粉積累的關(guān)鍵酶都同時表達；SBE 是對支鏈淀粉和總淀粉積累表現(xiàn)為直接正效應(yīng)的淀粉合成關(guān)鍵酶，而通過SBE 的間接影響，AGPase、SSS、GBSS 對支鏈淀粉積累又表現(xiàn)出一定的間接正效應(yīng)，SBE 與支鏈淀粉的積累呈極顯著正相關(guān)也印證了這一點，推測SBE 可能是通過與其他酶的協(xié)同作用促進塊莖中支鏈淀粉的積累，具體機制還有待進一步研究。

綜上所述，大和長芋山藥塊莖中總淀粉含量的增加主要是由于支鏈淀粉的積累，直鏈淀粉含量較少，種植后135 d 淀粉積累基本進入平臺期；AGPase、SSS、SBE 對山藥塊莖淀粉的積累是必要的，AGPase、SBE 可能是直接參與支鏈淀粉積累的重要功能酶；AGPase、SSⅡ、SSⅢ、SBEⅡ基因正向調(diào)控塊莖支鏈淀粉的積累。另外，SBE 對各類淀粉積累均表現(xiàn)為直接正效應(yīng)，AGPase、GBSS 對直鏈淀粉積累的直接貢獻也較大。