干旱脅迫對(duì)大鱗副泥鰍免疫指標(biāo)的影響

黃 梅，吳夢(mèng)曉，商澤昊，尤 昆，米 笛，王光毅，張?jiān)讫?/p>

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036)

環(huán)境脅迫會(huì)打破水生動(dòng)物與環(huán)境之間的平衡與協(xié)調(diào)，影響機(jī)體正常的生理生化和免疫功能，導(dǎo)致水生動(dòng)物生長(zhǎng)減慢[1]、免疫抑制[2]、氧化應(yīng)激[3,4]和細(xì)胞凋亡[5]等生理?yè)p傷，甚至可能會(huì)對(duì)水生動(dòng)物產(chǎn)生致死性的傷害。免疫系統(tǒng)是魚類維持機(jī)體平衡的重要防御機(jī)制，由于魚類的特異性免疫系統(tǒng)還不完善，所以當(dāng)受到外界應(yīng)激源的刺激時(shí)，魚體組織常會(huì)分泌抗菌蛋白(如溶菌酶、補(bǔ)體蛋白)、抗體(如免疫球蛋白)、免疫細(xì)胞因子(如腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素)和熱休克蛋白等非特異性免疫因子，以減輕應(yīng)激造成的機(jī)體損害[6]。

魚類在現(xiàn)代集約化養(yǎng)殖、拉網(wǎng)和運(yùn)輸過(guò)程中常受到各種理化應(yīng)激，對(duì)多數(shù)魚類而言，空氣暴露是一種極端的干旱環(huán)境脅迫。然而，泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)[7]、黃鱔(Monopterusalbus)[8]和大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)[9]等氣呼吸型魚類常養(yǎng)殖于水量較少的稻田中，易遭遇周期性干旱[10]；在成魚捕撈過(guò)程中，養(yǎng)殖戶常采用排干池水的方法捕撈。此外，為了降低成本，商業(yè)化的氣呼吸型魚類在短途運(yùn)輸中廣泛采用半干法，僅潑灑少量水保持皮膚濕潤(rùn)，這些都意味著氣呼吸型魚類經(jīng)常會(huì)遭遇干旱脅迫。作為一種環(huán)境因子，干旱會(huì)對(duì)魚類先天免疫系統(tǒng)造成影響，并增加機(jī)體對(duì)病原的易感性；以往關(guān)于魚類在干旱條件下的研究大多集中在抗氧化方面[11-13]；關(guān)于免疫反應(yīng)，特別是免疫相關(guān)指標(biāo)的變化方面的研究仍然十分匱乏。

大鱗副泥鰍(P.dabryanus)是東亞地區(qū)重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一。據(jù)《2021中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》統(tǒng)計(jì)，2020年我國(guó)泥鰍(包括泥鰍和大鱗副泥鰍)的養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)36.74萬(wàn)噸[14]。作為一種典型的氣呼吸型魚類，大鱗副泥鰍除了可以用鰓呼吸以外，還能在缺氧條件下通過(guò)皮膚和腸道進(jìn)行呼吸，因此比其他魚類具備更高的耐旱能力[15]。魚類，特別是氣呼吸型魚類在養(yǎng)殖與運(yùn)輸過(guò)程中常不可避免會(huì)遭遇短時(shí)干旱脅迫，但干旱條件下的魚類的生理機(jī)理和免疫反應(yīng)仍知之甚少。本研究以空氣暴露模擬大鱗副泥鰍所經(jīng)歷的干旱脅迫，檢測(cè)其血清與肝臟免疫因子的變化趨勢(shì)，旨在研究干旱脅迫對(duì)魚類免疫相關(guān)因子的影響與適應(yīng)機(jī)制，為魚類無(wú)水運(yùn)輸和養(yǎng)殖策略提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚類與材料

實(shí)驗(yàn)用大鱗副泥鰍[(20.1±3.2) g，(15.3±2.9) cm)]購(gòu)于合肥的水產(chǎn)市場(chǎng)。實(shí)驗(yàn)開始前將魚轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室中，暫養(yǎng)于5個(gè)60 L的養(yǎng)殖箱中，每個(gè)暫養(yǎng)箱盛水50 L，養(yǎng)殖30～50尾，放置3個(gè)充氣石。養(yǎng)殖用水是經(jīng)過(guò)曝氣24 h以上的自來(lái)水，水溫保持在(23.0±1.0) ℃。在暫養(yǎng)7 d期間，每日換水30%，投喂2次配合飼料(粗蛋白35%，粗脂肪7%)。實(shí)驗(yàn)前24 h停止投喂，且實(shí)驗(yàn)期間不投喂。

總蛋白(TP)測(cè)定試劑盒(A045-2-2)、白蛋白(ALB)測(cè)定試劑盒(A028-1-1)、溶菌酶(LZM)測(cè)試盒(A050-1-1)、免疫球蛋白M(IgM)測(cè)試盒(H109-1-1)、補(bǔ)體C3測(cè)試盒(H186-1-2)、補(bǔ)體C4測(cè)試盒(H186-2-2)、熱休克蛋白70(HSP70)測(cè)試盒(H264-2)、熱休克蛋白90(HSP90)測(cè)試盒(H264-3)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)測(cè)試盒(H052-1)、白介素-1β(IL-1β)測(cè)試盒(H002)、白介素-6(IL-6)測(cè)試盒(H007-1-1)、白介素-12(IL-12)測(cè)試盒(H010)，均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.2 空氣暴露實(shí)驗(yàn)

隨機(jī)挑選4尾規(guī)格相近的魚放置于圓形塑料盆(直徑35.5 cm，高度15.5 cm)中，盆中加一層很薄的蒸餾水(100 mL)，保持室內(nèi)溫度(25.0±1.0) ℃(空調(diào)控溫)，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為12、24、48、72和96 h。盆中的蒸餾水每8 h完全更換一次，以確保整個(gè)暴露期間的恒定濕度。以實(shí)驗(yàn)開始時(shí)的魚(0 h)作為基礎(chǔ)水平的指標(biāo)，以養(yǎng)殖在10 L曝氣自來(lái)水中的魚作為對(duì)照組。每個(gè)組(空氣暴露組和對(duì)照組)每個(gè)暴露時(shí)間點(diǎn)各設(shè)置3組平行，每個(gè)平行4尾實(shí)驗(yàn)魚，共72尾。

1.3 樣品采集

每個(gè)暴露時(shí)間(12、24、48、72和96 h)結(jié)束后進(jìn)行樣品采集，使用MS-222對(duì)實(shí)驗(yàn)魚進(jìn)行麻醉，并通過(guò)尾靜脈迅速取血，然后在4 ℃下，4 000g下離心30 min，以收集血清。解剖收集肝臟，以玻璃勻漿器勻漿后，按照體積質(zhì)量比9 ∶1加入預(yù)冷(4 ℃)的生理鹽水，并在4 ℃下，10 000g離心20 min，得到上清液用于后續(xù)的生化分析。所有樣品均由平行組的4尾實(shí)驗(yàn)魚合并而來(lái)，并保存于-80 ℃的冰箱中待測(cè)。

1.4 生化分析

根據(jù)ROBINSON等[16]的方法，使用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)血清中的總蛋白含量進(jìn)行定量。以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定肝臟樣品中的可溶性蛋白含量[17]。通過(guò)溴甲酚綠方法測(cè)定血清白蛋白水平[18]。血清球蛋白濃度按下式計(jì)算:球蛋白=總蛋白-白蛋白。溶菌酶活性[19]通過(guò)比濁法測(cè)定。免疫球蛋白M(IgM)、補(bǔ)體C3(C3)、補(bǔ)體C4(C4)、熱休克蛋白70(HSP70)、熱休克蛋白90(HSP90)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素6(IL-6)和白細(xì)胞介素12(IL-12)通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)方法測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。先進(jìn)行正態(tài)性和Levene′s方差同質(zhì)性檢驗(yàn)，隨后進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)和LSD多重比較檢測(cè)結(jié)果的顯著性水平，顯著性水平α=0.05。t檢驗(yàn)分析比較同一時(shí)間的空氣暴露和對(duì)照之間的差異顯著性。使用SPSS軟件(SPSS Inc.Chicago,IL,USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

空氣暴露后大鱗副泥鰍血清總蛋白、白蛋白和球蛋白含量都呈先增后降的趨勢(shì)，并均在暴露48 h時(shí)達(dá)到峰值(圖1)。血清白蛋白含量增加速度較快，暴露24 h和48 h時(shí)顯著高于對(duì)照組(圖1B)。血清總蛋白(圖1A)和球蛋白(圖1C)含量在48 h顯著高于對(duì)照組。血清IgM實(shí)驗(yàn)期間始終與對(duì)照組差異不顯著(圖1D)。

圖1 空氣暴露對(duì)大鱗副泥鰍血清總蛋白(A)、白蛋白(B)、球蛋白(C)和免疫球蛋白M(D)含量的影響

空氣暴露對(duì)大鱗副泥鰍血清與肝臟溶菌酶活性、IgM、補(bǔ)體C3和C4含量的影響見圖2、圖3。實(shí)驗(yàn)期間血清與肝臟溶菌酶活性均無(wú)顯著性變化(圖2A，圖3A)。血清C3和C4含量于暴露48 h時(shí)達(dá)到峰值；其中，補(bǔ)體C3變化幅度較小，與對(duì)照組始終差異不顯著(圖2B)。與補(bǔ)體C3相比，C4增殖速度更快，48 h與對(duì)照組差異顯著(圖2C)。與對(duì)照組相比，空氣暴露12 h肝臟中IgM、C3和C4含量就出現(xiàn)了顯著的上升，并在24 h迅速下降。在整個(gè)暴露期間，肝臟與血清當(dāng)中補(bǔ)體C3和C4含量的變化呈相反的趨勢(shì)，當(dāng)肝臟補(bǔ)體C3和C4在實(shí)驗(yàn)48 h達(dá)到最低值時(shí)，血清中的補(bǔ)體C3和C4上升至最高值。

圖2 空氣暴露對(duì)大鱗副泥鰍血清總?cè)芫?A)活性、補(bǔ)體C3(B)和補(bǔ)體C4(C)含量的影響

圖3 空氣暴露對(duì)大鱗副泥鰍肝臟溶菌酶(A)活性、IgM(B)、補(bǔ)體C3(C)和補(bǔ)體C4(D)含量的影響

比較空氣暴露后大鱗副泥鰍血清和肝臟HSP70和HSP90含量的變化(圖4、圖5)。空氣暴露48 h，血清HSP70和HSP90顯著升高到最大值，分別達(dá)到基礎(chǔ)水平的3.3倍和2.0倍。48 h后兩者都開始下降，但血清HSP70回歸速度較HSP90慢。相較于血清，大鱗副泥鰍肝臟HSP70和HSP90含量變化更加迅速，僅空氣暴露12 h就達(dá)到了峰值，且顯著高于對(duì)照組。在實(shí)驗(yàn)中后期(24～96 h)，血清HSP70和HSP90呈高于對(duì)照組的趨勢(shì)，而肝臟HSP70和HSP90則低于對(duì)照組。

圖4 空氣暴露對(duì)大鱗副泥鰍血清HSP70(A)和HSP90(B)含量的影響

圖5 不同空氣暴露時(shí)間對(duì)大鱗副泥鰍肝臟HSP70(A)和HSP90(B)含量的影響

大鱗副泥鰍血清和肝臟中TNF-α、IL-1β、IL-6、和IL-12含量受空氣暴露的影響見圖6和圖7。所有測(cè)定的血清炎癥細(xì)胞因子都呈現(xiàn)相似的變化模式，先顯著升高后降低，所有峰值均出現(xiàn)在空氣暴露48 h，并且明顯高于對(duì)照組(IL-1β除外)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)炎癥細(xì)胞因子指標(biāo)均已回歸至正常水平?？諝獗┞?2 h，肝臟炎癥細(xì)胞因子達(dá)到峰值，TNF-α和IL-1β增加至基礎(chǔ)水平的1.4倍；IL-6和IL-12增加至基礎(chǔ)水平的1.5倍，均顯著高于對(duì)照組(圖7)。

圖6 空氣暴露對(duì)大鱗副泥鰍血清TNF-α(A)、IL-1β(B)、IL-6(C)、和IL-12(D)含量的影響

圖7 不同時(shí)期空氣暴露對(duì)大鱗副泥鰍肝臟TNF-α(A)、IL-1β(B)、IL-6(C)和IL-12(D)含量的影響

3 討論

血清生化參數(shù)是評(píng)估魚類機(jī)體健康狀況的常用指標(biāo)[4]，當(dāng)水產(chǎn)動(dòng)物受到惡劣環(huán)境因子脅迫時(shí)，血清生化參數(shù)通常會(huì)出現(xiàn)不同程度的波動(dòng)。暴露于火電廠廢水中的翠鱧(Channapunctatus)，其血清總蛋白和白蛋白含量出現(xiàn)急劇增加，但球蛋白含量減少[20]。經(jīng)過(guò)銅和鎳處理后的鯉(Cyprinuscarpio)血清總蛋白和球蛋白含量顯著增加，血清白蛋白則有所下降[21]。本研究中，空氣暴露條件下大鱗副泥鰍血清總蛋白、白蛋白和球蛋白含量顯著增加。其中，球蛋白水平的顯著上升可能是大鱗副泥鰍為了減輕機(jī)體在應(yīng)激條件下的病原易感性而做出的免疫調(diào)節(jié)策略。然而，腹腔注射醋酸銨會(huì)顯著降低鯽(Carassiusauratus)[9]和黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[4]血清總蛋白、白蛋白和球蛋白含量。這種結(jié)果的差異可能是由于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不同而造成的，魚類普遍難以耐受高氨毒性，醋酸銨導(dǎo)致的嚴(yán)重氨中毒使得魚體免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)失衡，進(jìn)一步導(dǎo)致了免疫蛋白的減產(chǎn)；而短時(shí)間的空氣暴露則激發(fā)了大鱗副泥鰍的免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)了相關(guān)蛋白的增殖。除此之外，實(shí)驗(yàn)期間，黃顙魚每天投喂兩次而大鱗副泥鰍在此期間不投喂，對(duì)能量的需求大大高于黃顙魚；由于魚類在受到環(huán)境應(yīng)激時(shí)的能量需求增加，大鱗副泥鰍白蛋白和總蛋白含量增加也可能是作為干旱脅迫期間的能量來(lái)源。

當(dāng)受到抗原刺激時(shí)，硬骨魚B細(xì)胞會(huì)釋放出大量IgM，并通過(guò)激活補(bǔ)體系統(tǒng)，發(fā)揮溶菌、殺菌及中和病毒等免疫作用[22]。CUESTA等[23]對(duì)大西洋鯛(Sparusaurata)進(jìn)行短時(shí)間(2 min)的空氣暴露后血清IgM水平無(wú)顯著影響；但隨著脅迫持續(xù)至6 h時(shí)，大西洋鯛鰓、腸道和皮膚組織中IgM水平均出現(xiàn)顯著增加[24]。肝臟是魚類蛋白質(zhì)代謝和免疫因子合成的重要器官，大鱗副泥鰍肝臟中IgM含量在實(shí)驗(yàn)的第一個(gè)時(shí)間段(12 h)就出現(xiàn)了顯著性增加；但在下一時(shí)間段(24 h)就迅速下降至基礎(chǔ)水平；上述大西洋鯛多個(gè)組織的IgM水平同樣在空氣暴露24 h出現(xiàn)驟降[24]。IgM水平的急劇增減和其特性有關(guān)，作為機(jī)體接觸外源性抗原后產(chǎn)生的第一抗體，IgM通常在應(yīng)激的早期就會(huì)出現(xiàn)大量累積；但由于半衰期短，所以在體內(nèi)維持時(shí)間短，消失快。

溶菌酶能夠破壞革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁中的肽聚糖層，從而溶解入侵的致病菌；除此之外其還具有增強(qiáng)補(bǔ)體活性、強(qiáng)化免疫應(yīng)答、抗腫瘤等作用，廣泛參與了各種防御機(jī)制[24]。在空氣暴露期間，大鱗副泥鰍血清和肝臟中溶菌酶活性并無(wú)明顯變化。沈凡等[25]的研究表明低氧脅迫下黃顙魚血清溶菌酶活力變化也不顯著。而虹鱒(Oncorhynchusmykiss)和大西洋鯛在經(jīng)歷同樣的干旱脅迫后皮膚表面溶菌酶卻有顯著上升的現(xiàn)象[23]。這可能是溶菌酶在魚體組織中的差異性分布造成的，作為魚類先天性免疫系統(tǒng)的第一道防線，溶菌酶主要分布在魚類體表黏液和腎臟中，而血清和肝臟中溶菌酶含量較少[26,27]。另外，本實(shí)驗(yàn)中其他免疫因子的協(xié)同作用也可能是大鱗副泥鰍溶菌酶無(wú)顯著變化的原因。急性干旱脅迫已被證明對(duì)大西洋鯛和斑馬魚(Daniorerio)肝臟的先天免疫因子的激活具有刺激作用，能夠使補(bǔ)體蛋白水平增加[28]。補(bǔ)體是魚類先天性免疫中的輔助系統(tǒng)，活化后具有酶活性、可介導(dǎo)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)?？諝獗┞逗?，大鱗副泥鰍血清中的補(bǔ)體含量達(dá)到峰值時(shí)，肝臟補(bǔ)體達(dá)到最低值。肝臟補(bǔ)體含量的下降或是因?yàn)轶w液循環(huán)將其運(yùn)輸?shù)窖汉推渌M織當(dāng)中。本研究中，補(bǔ)體C3和補(bǔ)體C4含量的增加是對(duì)惡劣環(huán)境的一種適應(yīng)性策略，表明了大鱗副泥鰍補(bǔ)體系統(tǒng)的激活。

熱休克蛋白(HSPs)又稱應(yīng)激蛋白，在高溫、缺氧、病原體感染、有機(jī)污染物和氧化等應(yīng)激條件下，HSPs的合成速度會(huì)迅速增加[29]。其中，HSP70和HSP90在魚類先天性免疫和適應(yīng)性免疫中起關(guān)鍵作用，包括激活先天免疫系統(tǒng)細(xì)胞[30]、介導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)[31]以及作為膜結(jié)合配體來(lái)激活免疫系統(tǒng)[32]等。干旱條件下擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)[33]和黃金鱸(Percaflavescens)[12]體內(nèi)HSP70和HSP90的含量有所增加。海參(Apostichopusjaponicus)[13]與大鱗副泥鰍中HSP90和HSP70在干旱脅迫過(guò)程中都呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)。其中大鱗副泥鰍血清中HSP70相較于HSP90具備增殖速度快，作用時(shí)間長(zhǎng)的免疫應(yīng)答特點(diǎn)；說(shuō)明了HSP70在提高大鱗副泥鰍的抗應(yīng)激能力和增強(qiáng)機(jī)體免疫中發(fā)揮著更大的作用。然而，由于HSPs誘導(dǎo)的樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活化會(huì)促進(jìn)組織相容性復(fù)合體(MHC)的成熟，所以HSPs的過(guò)度增值會(huì)對(duì)魚類機(jī)體產(chǎn)生損害作用[34]。另外，羅東林等[35]指出，動(dòng)物應(yīng)激后高表達(dá)的HSP70可能會(huì)影響糖皮質(zhì)激素發(fā)揮抗炎功能，從而導(dǎo)致創(chuàng)傷后繼發(fā)性肝損傷。也就是說(shuō)氣呼吸型魚類可能會(huì)以免疫抑制來(lái)保護(hù)自身免于干旱脅迫的應(yīng)激作用。本研究中，空氣暴露48 h后，機(jī)體HSP70和HSP90含量的下降也進(jìn)一步支持了這一觀點(diǎn)。

作為魚類免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，炎癥或環(huán)境污染物均可引起炎癥細(xì)胞因子的變化[36]。在本研究中，不同時(shí)間的空氣暴露后，大鱗副泥鰍血清和肝臟中炎癥細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12)水平均呈現(xiàn)顯著升高的趨勢(shì)。大西洋鯛和斑馬魚空氣暴露后，肝臟當(dāng)中TNF-α、IL-1β和IL-10等炎癥因子也呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)[37]。在氨脅迫下，暗紋東方鲀[38]和黃顙魚[4]中也發(fā)現(xiàn)了TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8和IL-12轉(zhuǎn)錄水平的顯著增加，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。此外，前期研究還發(fā)現(xiàn)HSPs的合成會(huì)導(dǎo)致TNF-α、IL-1β和IL-12轉(zhuǎn)錄水平的明顯上調(diào)[28,39]。干旱脅迫后，肝臟中各炎癥細(xì)胞因子指標(biāo)的上升和回歸速度都十分迅速。這與肝臟炎癥細(xì)胞因子的雙重效應(yīng)關(guān)系密切，一方面，TNF和IL作為肝細(xì)胞刺激因子，在發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)以及其它情況的急性炎癥反應(yīng)過(guò)程中可快速生成，并可誘導(dǎo)急性期反應(yīng)蛋白的合成以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、提高機(jī)體抗病力。另一方面，炎癥細(xì)胞因子也是肝臟壞死的重要因素，多項(xiàng)研究表明TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12等可誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞的凋亡[40-42]。因此，肝臟中炎癥細(xì)胞因子的快速清除可能是大鱗副泥鰍為了保護(hù)肝臟免受損傷做出的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，是機(jī)體為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定做出的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。

4 結(jié)論

綜上所述，空氣暴露顯著誘導(dǎo)了大鱗副泥鰍血清和肝臟總蛋白、白蛋白、球蛋白、IgM、補(bǔ)體成分、熱休克蛋白和炎癥細(xì)胞因子等免疫因子的增殖。肝臟作為魚類蛋白代謝和合成場(chǎng)所，其免疫因子通常在實(shí)驗(yàn)早期就出現(xiàn)大量累積，反應(yīng)速度較血清快。本實(shí)驗(yàn)早期(0～48 h)大鱗副泥鰍的各項(xiàng)免疫指標(biāo)均呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明短時(shí)間的空氣暴露刺激了魚體的免疫應(yīng)答。實(shí)驗(yàn)后期(48～96 h)多數(shù)上升的免疫指標(biāo)逐漸下降，表明干旱和缺氧誘導(dǎo)的免疫刺激已開始轉(zhuǎn)變?yōu)槊庖咭种谱饔谩?/p>