四種不同食性魚類的消化酶活性及腸道組織形態(tài)學(xué)比較研究

榮 華，張 雷，王曉雯，武祥偉，王金浩，胡 青，畢保良，孔令富，豆騰飛

(1．襄陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北襄陽 441050；2．云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；3．云南華衡檢測技術(shù)有限公司，昆明 650201)

食性是魚類在進(jìn)化過程中，依其生存環(huán)境和餌料生物來源逐漸形成的食物偏好習(xí)性[1-2]。魚類食性以進(jìn)食方式和食物內(nèi)容劃分為植物食性、動(dòng)物食性、雜食性及濾食性[3]。魚類的食性受到諸多因素的影響，不僅與內(nèi)在遺傳和生理因素如食欲、攝食器官、消化道結(jié)構(gòu)、消化酶活性有關(guān)，還與外在的餌料生物、環(huán)境及消化道微生物等有關(guān)[4]。許多魚類從幼魚生長至成魚，都會發(fā)生一定的食性轉(zhuǎn)變，如草魚幼魚期食性經(jīng)歷三個(gè)階段：浮游動(dòng)物食性階段、食性轉(zhuǎn)變階段和草食性階段[5]，諸多因素的存在增加了魚類食性界定難度。而判定魚類食性是研究魚類營養(yǎng)學(xué)的基礎(chǔ)，對研制魚類飼料和科學(xué)投喂具有重要意義。

魚類食性與其腸道消化酶活性密切相關(guān)，如HIDALGO等[6]研究發(fā)現(xiàn)鰻鱺(Anguillajaponica) 的淀粉酶活性比虹鱒(Oncorhynchusmykiss)的高；草食性和雜食性魚類的淀粉酶活性要高于肉食性魚類[7]。魚類的食性也與消化器官的發(fā)育及機(jī)能、腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[8-9]。本實(shí)驗(yàn)選取草魚(Ctenopharyngodonidellus)、鱖(Sinipercachuatsi)、滇池高背鯽(Carassiusauratus)、昆明裂腹魚(Shizothoraxgrahami)分別作為草食、肉食、雜食和濾食性魚類代表，通過分析魚類食性與腸道結(jié)構(gòu)和消化酶活性的關(guān)系，評價(jià)不同食性魚類對各類營養(yǎng)物質(zhì)的消化利用潛力，為合理配置飼料、科學(xué)投喂提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及樣品采集

本實(shí)驗(yàn)所采用的草魚(1 323.6±40.20) g、鱖(841.3±34.54) g、滇池高背鯽(350.4±25.98) g、昆明裂腹魚(471.1±23.94) g,均捕撈于云南滇池及附近水域，并運(yùn)至云南農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)，所有魚在水泥池暫養(yǎng)12 d，期間投喂實(shí)驗(yàn)室自備暫養(yǎng)飼料，飼料配方見表1，每種魚隨機(jī)選擇10尾，將新鮮活魚經(jīng)麻醉劑(40 mg/L丁香酚)浸泡后，每個(gè)品種隨機(jī)挑選3尾魚存于4 ℃冰箱中，用于后續(xù)體成分分析；再隨機(jī)挑選3尾魚用于血液樣本的采集，利用尾靜脈采血法抽取血液后，靜置低溫離心(3 000 r/min，10 min，4 ℃)，分離取上層淡黃色液體即為血清，分離的血清樣品置于-20 ℃冰箱中保存，直至后續(xù)檢測；最后選取3尾魚進(jìn)行解剖，取肝胰腺及腸道組織樣品，保存于-20 ℃冰箱用于消化道酶活測定；剩下的1尾魚，解剖取小腸用于組織切片觀察，盡量剔除小腸外壁脂肪，取出前腸(幽門盲囊后0.5 cm處)，分成小塊(1cm×1cm)固定于Bouin′s(波恩氏)液中。

表1 實(shí)驗(yàn)飼料配方和營養(yǎng)組成(干物質(zhì)基礎(chǔ))

2)維生素預(yù)混劑(mg/kg)：維生素A，12；維生素B12，0.1；維生素C，150；維生素D3，5，維生素E，80；維生素K3，10；肌醇，80；泛酸，30；煙酸，100；葉酸，12；生物素，0.8；乙氧喹，80。

1.2 近似成分分析

全魚干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分含量依照Association of Official Analytical Chemists(AOAC，1995)建立的方法進(jìn)行測定[10]。簡要敘述如下：水分在干燥后用重量法測定，樣品置于烘箱(FUMA DGX-8053B，上海)中105 ℃烘至恒重；粗蛋白利用凱氏定氮法測定，使用凱氏定氮自動(dòng)取樣系統(tǒng)1035分析儀(Hoganas，Sweden)測定蛋白(N=6.25)；采用脂肪提取系統(tǒng)SZF-06A(上海新家儀器有限公司)，用石油醚萃取法測定粗脂肪含量。粗灰分利用燃燒法測定，將樣品置于馬弗爐(Carbolite CWF 11/5，Hope Valley，UK)內(nèi)550 ℃燃燒12 h以上，直至燃燒完全成白色粉末。

1.3 血液生化指標(biāo)測定

本實(shí)驗(yàn)涉及的所有血清生化指標(biāo)，包括谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、堿性磷酸酶(ALP)、白蛋白(AIB)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(T-CH)和總蛋白(TP)，使用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒(試劑盒貨號分別為：C010-2、C009-2、A028-2、C009-2、A110-1、A110-1、A045-4)，參考說明書依步驟對樣品進(jìn)行前處理，然后在全波段掃描酶標(biāo)儀(Tecon，Australia)上測定吸光度(OD值)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線或計(jì)算公式得到各指標(biāo)的濃度。

1.4 消化酶活性測定

實(shí)驗(yàn)魚肝胰腺及腸道中的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶及粗酶液中的總蛋白的測定使用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒(試劑盒貨號分別為：A080-2、A054-1、C016-2、A045-2)，參考說明書依步驟對樣品進(jìn)行前處理，然后在紫外分光光度計(jì)UV-5200(上海元儀器有限公司，中國)上測定蛋白酶樣品的吸光度(OD值)，在可見分光光度計(jì)V-5000H(上海元儀器有限公司，中國)上測定脂肪酶和淀粉酶。檢測樣品反應(yīng)液的顏色深淺與樣品中消化酶活性呈正相關(guān)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計(jì)算出對應(yīng)的樣品濃度。利用試劑盒說明書用考馬斯亮藍(lán)法測定粗酶液中的總蛋白濃度。

1.5 腸道組織形態(tài)

經(jīng)過波恩氏液固定后的腸道樣品依次通過脫水—透明—浸蠟—包埋—切片—烤干等步驟，制成組織切片，然后經(jīng)過HE染色，主要用蘇木素染細(xì)胞核，伊紅染細(xì)胞質(zhì)，最后脫水封片，利用電子生物顯微鏡KOPPACE 40X-1600X(科普艾斯科技有限公司，深圳)觀察，染色后細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)紅色。利用Case Viewer 軟件對前腸組織褶皺高度、褶皺寬度和肌層厚度分別進(jìn)行測定。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用分析軟件SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；利用單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗(yàn)食性操縱的主效應(yīng)，通過Tukey多重比較確定各實(shí)驗(yàn)組間的差異顯著水平，P<0.05為差異顯著；用Origin 75 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 四種不同食性魚類體近似成分比較分析

本實(shí)驗(yàn)分析計(jì)算出草魚、昆明裂腹魚、鱖和滇池高背鯽四種魚的體近似成分(表2)。結(jié)果顯示，肉食性鱖魚體水分含量最低，而蛋白含量最高，并達(dá)到顯著水平；濾食性昆明裂腹魚魚體粗脂肪含量要顯著高于其他三種魚類，而灰分含量顯著低于其他三種魚類；雜食性滇池高背鯽魚體粗蛋白和粗脂肪含量最低，而水分和灰分含量最高?？偟膩碚f，魚體近似成分受到魚類品種(食性)的顯著影響。

表2 四種魚類的近似成分比較分析

2.2 四種不同食性魚類血液生化指標(biāo)比較分析

血液生化指標(biāo)是反映機(jī)體代謝水平和健康狀況的內(nèi)在“指示劑”，本研究測定分析了四種魚類血液生化指標(biāo)的差異。如表3所示，血液生化指標(biāo)中GOT、AIB、TG、TCH受品種(食性)的影響顯著。其中，肉食性鱖的GOT、TG、TCH顯著高于其他三種魚類；草食性魚類AIB最高，顯著高于其他三種魚類。另外，血液中GPT、ALP、TP水平較為穩(wěn)定，基本不受品種(食性)的影響。

表3 四種魚類的部分血液生化參數(shù)比較分析

2.3 四種不同食性魚類消化酶比較分析

由圖1可見，鱖的胰蛋白酶和胰脂肪酶活性最高，鱖的胰淀粉酶活性最低，顯著高于(低于)其他三種魚。草魚與滇池高背鯽的胰蛋白酶和胰脂肪酶活性顯著低于鱖和昆明裂腹魚，而草魚和昆明裂腹魚胰淀粉酶活性顯著高于鱖和滇池高背鯽。由圖2可見，鱖的腸蛋白酶活性最高，腸淀粉酶活性最低，顯著高于(低于)其他三種魚類。昆明裂腹魚腸脂肪酶活性最低，顯著低于其他三種魚類。草魚和滇池高背鯽的腸脂肪酶和腸淀粉酶顯著高于昆明裂腹魚和鱖。

圖1 四種魚類肝胰腺消化酶活性

2.4 四種不同食性魚類腸道形態(tài)學(xué)比較分析

四種魚類腸道組織形態(tài)學(xué)觀察見圖3和表4，由圖3可知，四種魚的絨毛高度、絨毛寬度和肌層厚度均存在顯著差異。考慮到四種魚的體型、體重存在較大差異，我們利用絨毛高度指數(shù)、絨毛寬度指數(shù)和肌層厚度指數(shù)削弱體重對腸道形態(tài)的影響(表4)，結(jié)果表明：絨毛高度指數(shù)、絨毛寬度指數(shù)和肌層厚度指數(shù)在四種魚之間仍然差異顯著，具體表現(xiàn)為絨毛高度指數(shù)：草魚>鱖>昆明裂腹魚>滇池高背鯽魚；絨毛寬度指數(shù)和肌層厚度指數(shù)：鱖>草魚>滇池高背鯽魚>昆明裂腹魚。另外，由圖3可見，四種魚腸道形態(tài)各具特點(diǎn)，差異較大。如鱖腸道微絨毛分支較多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，如按微絨毛復(fù)雜程度排序可為：鱖>草魚>昆明裂腹魚>滇池高背鯽魚。

表4 四種魚類的腸絨毛高度、絨毛寬度和肌層厚度的比較分析

圖3 四種魚類腸道組織形態(tài)

3 討論

魚類的食性直接影響其食物組成，而通過分析食物組成也成為判定魚類食性最直接有效的方法[11]。魚體組織中的近似成分分析直接反映了其餌料組成[12]，因此對魚類食性的判定具有一定的輔助作用。目前關(guān)于昆明裂腹魚的研究相對較少，對其食性一直沒有準(zhǔn)確的判定。李國治等[13]報(bào)道魚體大小及發(fā)育階段對昆明裂腹魚食性影響較大，如在幼魚和稚魚期以浮游動(dòng)物為主，其食性為雜食偏動(dòng)物食性，而成魚階段屬于雜食偏植物食性，主要以浮游植物和藻類為主，特別是裂腹魚下顎前緣有銳利的角質(zhì)，利于舔刮石塊上固著的藻類。本研究發(fā)現(xiàn)鱖中粗蛋白含量顯著高于其他三種魚類，這也間接印證了鱖的食肉特性。而昆明裂腹魚和滇池高背鯽中粗蛋白含量介于草魚和鱖之間，間接判定昆明裂腹魚和滇池高背鯽屬于雜食性魚類。另外，昆明裂腹魚食性受季節(jié)和環(huán)境中餌料生物的組成影響也較大，諸多因素都導(dǎo)致明裂腹魚食性比較復(fù)雜，較難鑒定，需要結(jié)合更多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合分析[14-15]。血液生化參數(shù)是反映動(dòng)物機(jī)體新陳代謝及其健康狀況的重要指標(biāo)，也是動(dòng)物對營養(yǎng)吸收利用最直接的指示[16-17]，還是不同食性魚類利用營養(yǎng)物質(zhì)潛力的間接反映。本研究對四種魚類血液生化指標(biāo)進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)血液生化指標(biāo)中GOT、AIB、TG、TCH受到品種(食性)的顯著影響。GOT在機(jī)體蛋白質(zhì)代謝中起重要作用，測定血清GOT活性可以反映機(jī)體蛋白質(zhì)代謝水平和肝細(xì)胞的功能狀況[17]。本研究發(fā)現(xiàn)血清GOT活性在四種魚中從高到低依次為：鱖、滇池高背鯽、昆明裂腹魚、草魚。TG由3分子脂肪酸和1分子甘油酯化而成，又稱中性脂肪，在體內(nèi)主要起供能作用；血清TCH包含血液所有的游離膽固醇和膽固醇酯，血清TG和TCH是脂代謝的重要指標(biāo)[18]。本研究中鱖血清TG和TCH均顯著高于其他三種魚，昆明裂腹魚和滇池高背鯽依次介于其中，而草魚血清中TG和TCH含量最低，表明鱖脂質(zhì)代謝水平最旺盛，而草魚相對較弱。綜上表明血液生化指標(biāo)與魚類食性相適應(yīng)，如鱖屬肉食性特性，草魚植物食性，所以鱖脂質(zhì)代謝較草魚旺盛。血液生化指標(biāo)雖然能反映魚類營養(yǎng)吸收及生理狀況，對魚類食性的鑒定具有很好的輔助作用，但血液生化指標(biāo)會受到諸多因素的影響，如環(huán)境，應(yīng)激，性別及魚類發(fā)育階段等[19-20]，因此還需要借助一些更有效、更直接的手段幫助鑒定魚類食性。

魚類的食性是與其消化器官的組織結(jié)構(gòu)和消化機(jī)能相適應(yīng)的，如潘黔生等[21]對6種有胃真骨魚類消化系統(tǒng)進(jìn)行了比較解剖研究，口裂大小、咽齒的發(fā)達(dá)與否，胃的存在與否以及腸道的長短等均與食性有密切的關(guān)系。鱖是有胃魚的代表，草魚和滇池高背鯽屬于典型的無胃魚，昆明裂腹魚食道與腸道之間有一個(gè)膨大狀的囊腔，具有分泌消化液，行使胃的部分功能。魚類食性與消化酶活性也是有一定相關(guān)性的，食性不同，消化器官組織結(jié)構(gòu)，其消化機(jī)能明顯不一樣，導(dǎo)致消化酶活性也有明顯差異[22-23]。如不同食性魚類對飼料中碳水化合物的利用不用，雜食性魚類較肉食性魚類可利用更高水平的碳水化合物[24]。本研究發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶、腸蛋白酶和胰脂肪酶活性大致表現(xiàn)為肉食性>雜食性>草食性。一些學(xué)者也報(bào)道了相似結(jié)果，劉運(yùn)正等[25]報(bào)道蛋白酶活性與食性有關(guān)，肉食性魚類的蛋白酶活性顯著高于雜食性和草食性。PARRIZAS等[26]指出，一般肉食性魚類的脂肪酶活性要高于草食性和雜食性魚類。本實(shí)驗(yàn)中草魚和滇池高背鯽的腸脂肪酶活性高于鱖和昆明裂腹魚，可能因?yàn)榍罢邔儆跓o胃魚，因此腸道需要行使部分胃的功能，所以導(dǎo)致腸脂肪酶活性較高。李向松等[27]比較了草魚、異育銀鯽和青魚淀粉酶的差異后指出，草食性草魚和肉食性青魚對玉米淀粉的利用要優(yōu)于雜食性異育銀鯽。劉泓宇等[28]報(bào)道了雜食性魚類的淀粉酶活性要高于肉食性魚類。本研究也發(fā)現(xiàn)了相同的結(jié)果，草魚的胰淀粉酶和腸淀粉酶活性最高，而鱖的最低。另外，腸道是魚類機(jī)體營養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的主要器官，特別是對一些無胃魚，其消化作用更加突出。不同食性魚類腸道各部形態(tài)結(jié)構(gòu)上各具特點(diǎn)，如肉食性魚類腸道較短，雜食性魚類腸道較長，草食性魚類介于之間[23]。劉懷如等[29]對南方胡子鲇的消化系統(tǒng)進(jìn)行解剖觀測，其消化系統(tǒng)的形態(tài)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出與食性相適應(yīng)的特點(diǎn)。本研究也發(fā)現(xiàn)四種食性魚類腸道組織形態(tài)各異，腸絨毛高度、絨毛寬度和肌層厚度在四種魚類之間均存在顯著差異。鱖腸道微絨毛分支較多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，按微絨毛復(fù)雜程度(絨毛長度和絨毛寬度)排序可為：肉食性>草食性>雜食性。肌層厚度也與腸道微絨毛復(fù)雜程度一致，肉食性>草食性>雜食性。腸道的特殊結(jié)構(gòu)決定了腸道是魚體容納食物、運(yùn)輸食物以及消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要場所，腸微絨毛高度、寬度及其復(fù)雜程度直接影響腸道的容納性及對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[30]。腸道壁肌肉層由平滑肌組成，通過節(jié)律性舒張和收縮來推動(dòng)食物在腸道內(nèi)移動(dòng)，肌層厚度直接反映腸道的收縮蠕動(dòng)能力，加強(qiáng)腸道收縮蠕動(dòng)是增加食物消化和降低食糜流通的有效手段[31]。肉食性魚類腸道較短，通過增加腸道結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，可以降低食糜的流通速度，增強(qiáng)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。因此，腸道結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性與腸道長度呈現(xiàn)相反的結(jié)果，并與魚類食性相適應(yīng)，達(dá)到對營養(yǎng)物質(zhì)充分吸收的目的。

綜上所述，魚體組成、血液生化指標(biāo)、腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)及消化道酶活受食性的顯著影響，且各指標(biāo)與魚類食性相適應(yīng)。如肉食性魚類腸道雖短，但其形態(tài)結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，且其蛋白酶、脂肪酶活性相對較高，草食性魚類剛好相反，分析這些規(guī)律對魚類的食性鑒定具有很好的輔助作用。與畜禽相比，魚類的機(jī)械消化能力很差，特別是一部分無胃魚，消化功能的強(qiáng)弱很大程度上取決于消化酶活性。因此，研究魚類不同食性及其獨(dú)特的消化生理，根據(jù)魚類食性特點(diǎn)合理配制飼料，對提高飼料利用促進(jìn)魚類生長具有重要意義。