飼料添加牛至精油對(duì)異育銀鯽生長、消化酶活性、腸道組織結(jié)構(gòu)及血液生化指標(biāo)的影響

王俊維，丁 旺，陳 凱，謝 駿，秦 婷，潘良坤，習(xí)丙文

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇無錫 214081；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214081)

異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)生長速度快、個(gè)體規(guī)格大、易養(yǎng)殖，是重要的大宗淡水養(yǎng)殖品種，目前已經(jīng)在江蘇、山東以及湖北等地大面積推廣養(yǎng)殖。近年來隨著養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，異育銀鯽養(yǎng)殖病害問題多發(fā)，如大紅鰓病、孢子蟲病、鰓出血病[1-3]等，給異育銀鯽養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大壓力。腸道是魚類最大的免疫器官之一，其發(fā)揮著多種作用，例如對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行消化和吸收、抵抗病原微生物和食物抗原對(duì)機(jī)體的影響等[4]。因此，如何通過飼料途徑維護(hù)養(yǎng)殖魚體生理健康、增強(qiáng)魚體抗病力已引起產(chǎn)業(yè)廣泛關(guān)注。

與傳統(tǒng)添加劑相比，中草藥及其天然產(chǎn)物易被吸收且無殘留、無污染，是一種綠色高效的水產(chǎn)飼料添加劑。已有研究表明，飼料中添加中草藥及其提取物能夠促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物生長，改善水產(chǎn)動(dòng)物消化酶活性，提高抗氧化、抗炎和抗病能力[5]。天然牛至精油是從中草藥牛至中提取出的一種揮發(fā)性精油，其多以香芹酚(香荊芹酚)、百里香酚、γ-萜品烯和p-異丙基甲苯等為主要成分[6]。牛至精油在水產(chǎn)養(yǎng)殖中在抗菌[7-8]、抗氧化[9]、免疫促進(jìn)[10]、促生長[11]、抗寄生蟲[12]等方面具有廣泛的應(yīng)用。ABDEL-LATIF等[13]研究表明，添加牛至精油可以改善鯉(Cyprinuscarpio)的腸道組織形態(tài)，保護(hù)肝臟功能，提高生長性能指標(biāo)和飼料利用參數(shù)。因此，為減少抗生素使用量，保障養(yǎng)殖品安全，在養(yǎng)殖過程中使用中草藥來改善腸道健康已逐漸得到廣泛關(guān)注并成為研究熱點(diǎn)。

本研究以異育銀鯽為對(duì)象，在基礎(chǔ)飼料中添加不同劑量的牛至精油，探討其對(duì)異育銀鯽生長、消化酶、腸道組織結(jié)構(gòu)、肝臟的影響，以期為牛至精油在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)用異育銀鯽苗種由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心試驗(yàn)基地提供。牛至精油(98%)購自上海源葉生物科技有限公司。以基礎(chǔ)飼料為空白對(duì)照組飼料，向基礎(chǔ)飼料中添加不同含量的牛至精油制作6組飼料，添加量分別為0(空白對(duì)照)、25、50、100、200、400和800 mg/kg，基礎(chǔ)飼料組成與營養(yǎng)水平如表1。

表1 基礎(chǔ)飼料組成與營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 飼養(yǎng)管理

實(shí)驗(yàn)開始前將異育銀鯽放入池塘網(wǎng)箱暫養(yǎng)，用基礎(chǔ)飼料馴化2周后，經(jīng)24 h饑餓處理后，選擇規(guī)格、體質(zhì)量[(37.18±0.26) g]基本一致的健康異育銀鯽630尾。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分為7組，每組90尾，每個(gè)組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾，養(yǎng)殖于室外2×666.7 m2池塘網(wǎng)箱。

投飼量為魚體質(zhì)量的2%～4%，每天投喂3次。實(shí)驗(yàn)期間水溫25～32 ℃，pH 6.8～7.5，溶氧5～8 mg/L，氨氮<0.01 mg/L，硫化氫<0.1 mg/L。每隔2周根據(jù)魚體質(zhì)量適當(dāng)調(diào)整投飼量，每日記錄循環(huán)養(yǎng)殖池塘的水溫及溶氧，觀察異育銀鯽的生長狀態(tài)，并記錄死亡情況，實(shí)驗(yàn)周期為8周。

1.3 樣品采集與測(cè)定

1.3.1 樣品采集

飼養(yǎng)結(jié)束后，停食24 h，對(duì)每個(gè)網(wǎng)箱中魚進(jìn)行稱重和計(jì)數(shù)；每個(gè)網(wǎng)箱隨機(jī)挑選10尾魚用20 mg/L的MS-222麻醉處理后測(cè)量其體重、體長；用抗凝劑潤洗的2 mL無菌注射器取尾靜脈血，隨即轉(zhuǎn)入抗凝管中，離心收集上清液(4 ℃，2 500 r/min，10 min)，分裝后-20 ℃保存?zhèn)溆?；解剖剪取前腸用預(yù)冷生理鹽水快速?zèng)_洗后用紙吸干水分，置于自封袋中-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；剪取后腸轉(zhuǎn)移至4%的多聚甲醛固定液中固定備用。

1.3.2 生長指標(biāo)測(cè)定

計(jì)算特定生長率(SGR)、增重率(WGR)、餌料系數(shù)(FCR)、肥滿度(CF)和存活率(SR)，計(jì)算公式如下：

WGR=(Wt-W0)×100%/W0

SGR=[(lnWt-nW0)/t]×100%

FCR=Wf/(Wt-W0)

CF=Wt(g)/[L(cm)]3×100

SR=Nt/N0×100%

式中：Wt為魚體末質(zhì)量(g)，W0為魚體初始質(zhì)量(g)，t為實(shí)驗(yàn)天數(shù)，Wf為投喂飼料總質(zhì)量(g)，L為魚體體長(cm)，Nt為終末尾數(shù)，N0為初始尾數(shù)。

1.3.3 腸道消化酶活測(cè)定

前腸組織用0.85%的生理鹽水進(jìn)行組織勻漿，于4 ℃下3 000 r/min離心10 min，取上清液用于測(cè)定消化酶活性。采用福林-酚法測(cè)定胰蛋白酶活性，采用甲基試鹵靈底物法測(cè)定脂肪酶活性，采用碘-淀粉比色法測(cè)定α-淀粉酶活性，具體操作按試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書進(jìn)行。胰蛋白酶以37 ℃條件下，每分鐘水解干酪素生成1 μg酪氨酸作為1個(gè)活性單位；α-淀粉酶以37 ℃條件下，每毫克組織與底物作用30 min，水解1 mg淀粉為1個(gè)活性單位；脂肪酶以37 ℃條件下，每毫克組織在反應(yīng)體系中與底物反應(yīng)1 min消耗1 μmol底物為1個(gè)活性單位。

1.3.4 腸道組織形態(tài)檢查

取出固定過夜的后腸組織，梯度酒精脫水，二甲苯透明，透蠟，包埋，切片，37 ℃過夜烘干。蘇木精-伊紅(HE)染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察腸道組織結(jié)構(gòu)，測(cè)定腸壁厚度、腸絨毛長度、腸絨毛寬度、杯狀細(xì)胞數(shù)量。

1.3.5 血液生化指標(biāo)檢測(cè)

總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、總膽紅素(TBIL)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)等相關(guān)指標(biāo)使用全自動(dòng)生化分析儀BS-400-2080檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏法多重比較，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 飼料添加牛至精油對(duì)異育銀鯽生長性能的影響

如表2所示，8周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，不同牛至精油飼料對(duì)異育銀鯽SR沒有顯著影響。隨著飼料中牛至精油添加量的增加，實(shí)驗(yàn)組的末均重、WGR、CP和SGR均呈上升趨勢(shì)，且400和800 mg/kg組的末均重、WGR、CF和SGR均顯著高于空白對(duì)照組。另外，800 mg/kg組的WGR、CF和SGR顯著高于25和50 mg/kg牛至精油組。盡管室外網(wǎng)箱養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)受到養(yǎng)殖期間的夏季高溫影響較大，造成WGR偏低和FCR普遍較高，但FCR隨著牛至精油添加量的增加呈下降趨勢(shì)，200、400和800 mg/kg組的FCR顯著低于空白對(duì)照組。各實(shí)驗(yàn)組間FCR不存在顯著性差異。

表2 飼料添加牛至精油對(duì)異育銀鯽生長性能的影響

2.2 飼料添加牛至精油對(duì)異育銀鯽消化酶活性的影響

由表3可知，隨著飼料中牛至精油添加量的增加，胰蛋白酶活性呈上升趨勢(shì)，且200、400和800 mg/kg組顯著高于空白對(duì)照組。α-淀粉酶與脂肪酶活性隨飼料牛至精油水平升高呈先升高再降低趨勢(shì)，且均在牛至精油水平為200 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值，并顯著高于0、25和800 mg/kg組，與100和400 mg/kg組無顯著差異。

表3 飼料添加牛至精油對(duì)異育銀鯽消化酶活性的影響

2.3 飼料添加牛至精油對(duì)異育銀鯽腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

飼料添加牛至精油對(duì)異育銀鯽腸道結(jié)構(gòu)的影響如表4和圖1所示。與空白對(duì)照組相比，200、400和800 mg/kg組魚體后腸的腸絨毛高度、絨毛寬度和腸壁厚度均顯著性增加。800 mg/kg組魚體后腸的腸絨毛高度和絨毛寬度顯著高于50和200 mg/kg組，與400 mg/kg組無顯著差異。與空白對(duì)照組相比，50和800 mg/kg組魚體后腸的杯狀細(xì)胞數(shù)量差異不顯著，200和400 mg/kg組杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著升高。

圖1 異育銀鯽后腸組織切片

表4 飼料添加牛至精油對(duì)異育銀鯽后腸組織結(jié)構(gòu)的影響

2.4 飼料添加牛至精油對(duì)異育銀鯽血液生化指標(biāo)的影響

由表5可知，TC、TBIL、TG和ALT在各實(shí)驗(yàn)組間差異不顯著；AST活性隨飼料牛至精油水平的增加而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且50、100、200、400和800 mg/kg組血液中AST含量均顯著低于空白對(duì)照組，而各實(shí)驗(yàn)組之間差異不顯著。

表5 飼料添加牛至精油對(duì)異育銀鯽血液生化指標(biāo)的影響

3 討論

3.1 不同牛至精油添加量對(duì)異育銀鯽生長性能的影響

目前，國內(nèi)外相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)飼料添加植物精油可以提高水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的生產(chǎn)性能[14]。其中，牛至精油可以從多個(gè)方面促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物的生長，包括提高動(dòng)物食欲、補(bǔ)充和完善餌料的營養(yǎng)水平、保持腸道菌群平衡、增強(qiáng)腸道上皮細(xì)胞對(duì)病原微生物的抵抗能力等[8,15]。本研究結(jié)果表明，飼料中添加牛至精油能夠改善異育銀鯽的生長性能。這可能歸因于牛至精油及其組分作用的影響。牛至精油本身具有獨(dú)特的香味，可以提高魚體的進(jìn)食欲望，從而提高飼料的攝入量和食物的適口性，改善魚體的FBW和WGR[16]。生長性能改善的另一個(gè)可能原因是香芹酚和百里香酚的影響，它們可能刺激消化酶的分泌和酶的活性，從而促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收[11,17]。WALEED等[18]研究發(fā)現(xiàn)在低或中等養(yǎng)殖密度條件下，飼料中添加1 mL/kg的牛至精油能夠明顯改善尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)的WGR、SGR和FCR。此外，DINARDO等[19]研究發(fā)現(xiàn)投喂添加含100 mg/L牛至精油的飼料后，歐洲鱸(Dicentrarchuslabrax)的最終體重、增重和比生長率與對(duì)照組相比均有顯著的正向影響，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

3.2 不同牛至精油添加量對(duì)異育銀鯽消化酶活性的影響

胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等是魚體重要的消化酶組分[20]。腸道消化酶活性對(duì)飼料消化、吸收、利用均有重要影響[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，添加200、400和800 mg/kg牛至精油顯著提高異育銀鯽的脂肪酶、α-淀粉酶和胰蛋白酶活性，從而促進(jìn)異育銀鯽腸道消化吸收且中劑量添加效果更優(yōu)。飼料中添加植物精油顯著提高了消化酶活性，其機(jī)理可能是魚體攝食精油后可刺激膽汁、消化道酶液分泌，提高消化酶活性，從而提高魚體對(duì)營養(yǎng)的消化吸收能力[22]。ZHANG等[10]研究表明，日糧中添加牛至精油可通過增加蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性水平來促進(jìn)鯉的消化功能；同樣，植物精油在尼羅羅非魚[23]和海鯛(Sparusaurata)[24]上也有相同發(fā)現(xiàn)。因此，本研究認(rèn)為在基礎(chǔ)飼料中添加牛至精油能夠顯著提高異育銀鯽腸道消化酶活性以及飼料消化、吸收、利用效率，進(jìn)而促進(jìn)異育銀鯽的生長。

3.3 不同牛至精油添加量對(duì)異育銀鯽腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

腸道是機(jī)體消化、營養(yǎng)物質(zhì)吸收的重要場(chǎng)所，機(jī)體的消化功能與腸道發(fā)育密切相關(guān)[25]。腸道絨毛形態(tài)被認(rèn)為是影響水生動(dòng)物吸收能力的標(biāo)志[26]。腸壁厚度的增加能夠增加腸道的柔韌性、促進(jìn)食物移動(dòng)，進(jìn)而促進(jìn)腸道內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[27]。本研究中，與對(duì)照組相比，添加200、400和800 mg/kg牛至精油顯著增加魚體后腸的腸絨毛長度、寬度和腸壁厚度。添加牛至精油的飼料通過增加腸壁厚度、腸道絨毛長度和腸道絨毛寬度來增加吸收表面積，從而改善魚類腸道對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。有研究發(fā)現(xiàn)從植物中提取的其他精油被證明也能增加尼羅羅非魚[28]以及非洲鯰(Clariasgariepinus)[29]的腸絨毛長度。ASMAA等[30]的研究表明，在尼羅羅非魚日糧中添加百里香酚后，其小腸絨毛長度顯著增加。ABDEL-LATIF等[13]研究發(fā)現(xiàn)日糧中添加牛至精油可以顯著增加腸絨毛長度和腸絨毛寬度，進(jìn)而提高鯉對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及消化食物的能力。牛至精油對(duì)腸道形態(tài)的改善與牛至精油的抗氧化性、抗菌性等有關(guān)[31]。有研究報(bào)道表明，牛至精油能夠促進(jìn)腸道有益菌如乳酸菌和雙歧桿菌的生長，降低有害菌和條件致病菌的數(shù)量，減少其對(duì)腸道黏膜的損傷及用于細(xì)胞周轉(zhuǎn)的能量消耗[32]。

3.4 不同牛至精油添加量對(duì)異育銀鯽血液指標(biāo)的影響

肝臟是機(jī)體膽固醇合成的主要場(chǎng)所，同時(shí)肝臟也有維持血液中膽固醇含量穩(wěn)定的作用[33]；血液中膽固醇的含量能夠在一定程度上反映機(jī)體肝臟的健康程度，當(dāng)機(jī)體肝臟損傷時(shí)血液中膽固醇的含量往往會(huì)升高。甘油三脂同樣是動(dòng)物體內(nèi)一種重要成分，機(jī)體能量増加通常伴隨著甘油三脂含量的增加，一般情況下，膽固醇升降往往伴隨甘油三脂升降[34]。此外，膽紅素屬于膽汁色素，總膽紅素是直接膽紅素與間接膽紅素的總稱[35]。肝細(xì)胞具有攝取膽紅素的能力，能夠清除血液中過多的膽紅素，若機(jī)體內(nèi)的膽紅素超過了肝細(xì)胞的處理能力，血液中總膽紅素含量便會(huì)隨之升高[36]。低溫脅迫會(huì)造成荷那龍羅非魚(Oreochromishornorum)的總膽紅素濃度上升，肝臟處理膽紅素能力明顯降低并產(chǎn)生代謝障礙[35]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)飼料添加牛至精油對(duì)異育銀鯽血液膽固醇、甘油三酯和總膽紅素影響不顯著，表明當(dāng)前添加牛至精油劑量不會(huì)對(duì)異育銀鯽肝臟造成損傷。

AST和ALT是細(xì)胞線粒體中重要的氨基轉(zhuǎn)移酶，廣泛存在于魚類的心臟、腎臟、肝臟、鰓等組織中[37-38]。正常情況下谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶主要存在于肝細(xì)胞的線粒體中，血液中二者含量較少；而組織受損或者功能減弱時(shí)，細(xì)胞膜滲透增大，致使血液中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶升高[39]。因此，血液中AST和ALT的含量可以作為評(píng)價(jià)魚類肝臟損傷程度重要指標(biāo)。SEYYED等[40]研究發(fā)現(xiàn)百里香酚能夠顯著降低虹鱒(Oncorhynchusmykiss)血液中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量，還能夠降低血糖含量，減少對(duì)肝臟功能的損傷。ABDEL-LATIF等[13]報(bào)道，鯉飼料中添加牛至精油對(duì)肝功能酶沒有顯著影響，表明魚類飼料中添加牛至精油對(duì)它們的肝組織沒有毒性作用。本實(shí)驗(yàn)中，飼料中添加牛至精油能夠顯著降低血清AST含量，表明牛至精油可在一定程度內(nèi)保護(hù)肝臟。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，飼料添加牛至精油對(duì)異育銀鯽生長性能、腸道酶活、腸道組織結(jié)構(gòu)和肝臟保護(hù)能力有明顯影響。綜合異育銀鯽生長性能、腸道組織結(jié)構(gòu)及消化酶活性和血清生化指標(biāo)，建議飼料牛至精油添加量為100～400 mg/kg。