基于鏡檢和高通量測(cè)序技術(shù)的銅銹環(huán)棱螺胃含物分析

張燦燦，張丹丹，王志強(qiáng)，羅福廣，文衍紅，蔣 明，李艷和

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/水產(chǎn)養(yǎng)殖國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，武漢 430070；2.廣西柳州市漁業(yè)技術(shù)推廣站，廣西柳州 545006；3.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，武漢 430223)

銅銹環(huán)棱螺(Bellamyaaeruginosa)是我國(guó)主要的土著淡水螺類(lèi)群體之一，屬于軟體動(dòng)物門(mén)腹足綱前鰓亞綱中腹足目田螺科環(huán)棱螺屬[1]。據(jù)研究，新鮮螺肉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，含有人體所必需的7種氨基酸、多種礦物元素及維生素等[2]，具有天然保健功能，使其在多種行業(yè)及水生態(tài)保護(hù)修復(fù)中都具有重要作用與突出價(jià)值[1]。銅銹環(huán)棱螺的市場(chǎng)需求量逐年增大，但其人工養(yǎng)殖技術(shù)的發(fā)展卻較為滯后，目前主要依靠人工捕撈，供應(yīng)量遠(yuǎn)小于其市場(chǎng)需求量。因此，深入開(kāi)展銅銹環(huán)棱螺的人工養(yǎng)殖、營(yíng)養(yǎng)需求、餌料投喂和繁育特性等研究顯得尤為重要。而動(dòng)物的食性研究是營(yíng)養(yǎng)生態(tài)位研究的重要組成部分[3]，可以為動(dòng)物的食物選擇性、物質(zhì)代謝、繁育特性以及人工養(yǎng)殖等研究提供有價(jià)值的參考資料和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)[4]。

高通量測(cè)序具有較高靈敏性和準(zhǔn)確性，能檢出降解和頻次較低的DNA序列，通過(guò)比對(duì)捕獲的DNA，可將物種精確分類(lèi)到種級(jí)別分類(lèi)單元，基于DNA序列數(shù)，還可判斷動(dòng)物對(duì)食物取食的相對(duì)量和偏好[5]。顯微鏡鏡檢分析一直是動(dòng)物食性研究中的傳統(tǒng)方法[6,7]，是一種檢驗(yàn)動(dòng)物短期內(nèi)攝食的直接手段，該方法使用顯微鏡觀察并分析腸胃內(nèi)含物中未被消化的食物種類(lèi)和數(shù)量，可以反映動(dòng)物在近期內(nèi)的攝食情況。然而，大量的研究表明每一種食性研究方法在實(shí)際應(yīng)用中均存在局限性。將鏡檢分析這種傳統(tǒng)的食性研究方法與高通量測(cè)序這種新興方法相結(jié)合，可以突破單種方法的局限性，提高對(duì)生物食性研究的可靠性[8]。

目前有關(guān)螺類(lèi)的食性已有較多研究，屈銘志等[9]通過(guò)模擬水庫(kù)現(xiàn)場(chǎng)，直接觀察銅銹環(huán)棱螺的攝食行為。段曉姣[10]、劉學(xué)勤[11]基于鏡檢分析法，分別對(duì)梨形環(huán)棱螺(Bellamyapurificata)、長(zhǎng)角涵螺(Alocinmalongicornis)、大沼螺(Parafossaruluseximius)和紋沼螺(Parafossarulusstriatulus)的腸道內(nèi)含物進(jìn)行鑒定，分析了其食性。而將高通量測(cè)序技術(shù)和鏡檢鑒定結(jié)合起來(lái)，分析銅銹環(huán)棱螺胃和后腸內(nèi)容物組成的研究較少。本研究選取真核生物18S可變區(qū)V4區(qū)、細(xì)菌16S V3V4(a)和真菌ITS1(a)作為標(biāo)記基因，結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)和鏡檢鑒別結(jié)果，對(duì)銅銹環(huán)棱螺的食性進(jìn)行研究，以期為開(kāi)展環(huán)棱螺人工養(yǎng)殖、營(yíng)養(yǎng)需求、餌料投喂和繁育特性研究提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2021年4月2日，在廣西柳州里高鎮(zhèn)螺螄養(yǎng)殖基地某銅銹環(huán)棱螺高產(chǎn)水田隨機(jī)采集銅銹環(huán)棱螺樣本若干(60個(gè)以上)。采樣后將螺樣放入清水中進(jìn)行沖洗，去除表面的底泥，用吸水紙吸干表面水分，測(cè)量其體高、體重及殼寬。

1.2 顯微鏡鏡檢

將每個(gè)螺的胃和后腸移入盛有10～20 μL生理鹽水的培養(yǎng)皿中充分洗滌后制成鏡檢樣品。利用顯微鏡鏡檢法鑒別全部鏡檢樣品。藻類(lèi)及浮游動(dòng)物參照文獻(xiàn)[12-15]鑒定到屬。

1.3 高通量測(cè)序

隨機(jī)選取30個(gè)銅銹環(huán)棱螺用無(wú)菌鑷子將胃分離，每10個(gè)一組，參照文獻(xiàn)[16]中的SDS法對(duì)環(huán)棱螺胃含物的基因組DNA進(jìn)行提取。采用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)法檢測(cè)DNA質(zhì)量與濃度。DNA檢測(cè)合格后，分別選用針對(duì)真核生物18S可變區(qū)V4區(qū)、細(xì)菌16S V3V4(a)和真菌ITS1(a)區(qū)設(shè)計(jì)的三對(duì)特異性引物(表1)對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、濃度檢測(cè)合格后，使用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)定量和檢測(cè)，利用NovaSeq 6000 SP Reagent Kit(500 cycles)進(jìn)行2×250 bp的雙端測(cè)序。測(cè)序工作在上海派森諾生物科技股份有限公司完成。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

1.4.1 攝食強(qiáng)度分析

參照文獻(xiàn)[17]的判斷方法，對(duì)銅銹環(huán)棱螺腸道充塞度進(jìn)行分級(jí)(0～5級(jí))。

1.4.2 食物組成分析

分別計(jì)算銅銹環(huán)棱螺的攝食率(FR)、食物出現(xiàn)率(F)、數(shù)量百分比(N)、重量百分比(W)和相對(duì)重要性指數(shù)百分比(IRI)，評(píng)估銅銹環(huán)棱螺胃和后腸的食物組成情況，計(jì)算方法如下：

FR=(含有食物的腸道數(shù)量÷解剖的總腸道數(shù)量)×100%

F=(包含某食物的腸道數(shù)量÷解剖的總腸道數(shù)量)×100%

N=(某食物成分的數(shù)量÷全部食物的數(shù)量)×100%

W=(某食物成分的重量÷全部食物的重量)×100%

相對(duì)重要性指數(shù)=F×(個(gè)數(shù)百分比N%+重量百分比W%)

IRI=(相對(duì)重要性指數(shù)÷相對(duì)重要性指數(shù)總和)×100%

1.4.3 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

首先對(duì)測(cè)序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控、去噪、拼接、去嵌合體。對(duì)每個(gè)OTU的代表序列，在QIIME2軟件中使用默認(rèn)參數(shù)，使用Naive Bayes分類(lèi)器進(jìn)行物種分類(lèi)注釋。比對(duì)Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)[18]，統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本的胃含物在界、門(mén)、綱、目、科、屬、種分類(lèi)水平的組成。

2 結(jié)果

2.1 銅銹環(huán)棱螺的攝食強(qiáng)度

共分析30只銅銹環(huán)棱螺，體高分布范圍為13.48～22.41 mm，體質(zhì)量分布范圍為0.44～2.27 g，結(jié)果表明取樣隨機(jī)，大小均有，可以反映養(yǎng)殖階段銅銹環(huán)棱螺胃含物組成的共性。其中，26個(gè)腸道含食物，4個(gè)腸道完全無(wú)食物，攝食率為86.87%。由圖1可看出，銅銹環(huán)棱螺的充塞度主要集中在1級(jí)，即食物占腸管的1/4，其次主要是2級(jí)，食物占腸管的1/2，而充塞度為5級(jí)的最少為0。

圖1 銅銹環(huán)棱螺腸道充塞度情況

2.2 鏡檢分析銅銹環(huán)棱螺胃和后腸中食物組成情況

總共有30個(gè)樣本用于食物組成分析，殼寬在8.89～15.09 mm之間。由表2可以看出，從銅銹環(huán)棱螺胃中檢出藻類(lèi)8門(mén)33屬，解剖發(fā)現(xiàn)銅銹環(huán)棱螺的胃腸道里主要食物是浮游植物，如裸藻、顫藻、扁裸藻、黃絲藻等(圖2)，還有較多的泥沙和有機(jī)碎屑，以及少量的水生植物碎屑。

圖2 顯微鏡視野下的銅銹環(huán)棱螺胃內(nèi)部分食物種類(lèi)

從出現(xiàn)率來(lái)看，胃中小球藻最高為63.33%，其次黃絲藻為46.67%；后腸隱藻最高為43.33%，其次小球藻和黃絲藻均為33.33%，顫藻為30%，席藻、柵藻、雙菱藻、羽紋藻、實(shí)球藻、卵囊藻、小環(huán)藻、黃管藻和三毛金藻最低為3.33%。從數(shù)量百分比來(lái)看，胃中小球藻最高為34.42%，席藻、蹄形藻最低為0.05%；后腸顫藻最高為21.85%，席藻、柵藻、雙菱藻和羽紋藻最低為0.18%。除去泥沙，從重量百分比來(lái)看，胃中裸藻門(mén)為46.16%，綠藻門(mén)為35.70%，藍(lán)藻門(mén)為6.68%，硅藻門(mén)為6.19%，隱藻門(mén)為5.27%，其中裸藻最高為46.16%，其次為衣藻22.74%；后腸藍(lán)藻門(mén)為39.96%，隱藻門(mén)為18.19%，綠藻門(mén)為16.76%，裸藻門(mén)為15.59%，硅藻門(mén)為9.49%，其中顫藻最高為39.96%，其次隱藻為18.19%。從相對(duì)重要指數(shù)百分比來(lái)看，胃中小球藻最高為37.66%，其次衣藻為23.09%；后腸中顫藻最高為35.74%，其次隱藻為25.58%(表2)。

表2 銅銹環(huán)棱螺的食物組成

續(xù)表2

續(xù)表2

從表3可看出，鏡檢結(jié)果顯示銅銹環(huán)棱螺的胃含物中小球藻的F、N和IRI最高，裸藻的W最高，而后腸內(nèi)容物中顫藻的N、W和IRI居首，隱藻的F較其他藻類(lèi)更大，表明銅銹環(huán)棱螺胃內(nèi)主要的食物成分是小球藻和裸藻，后腸中則以隱藻和顫藻為主。

表3 銅銹環(huán)棱螺胃和后腸的食物百分比

2.3 高通量分析銅銹環(huán)棱螺胃內(nèi)食物組成情況

2.3.1 細(xì)菌成分分析

采用Illumina測(cè)序平臺(tái)對(duì)3組樣品的16S rRNA基因V3-V4區(qū)進(jìn)行測(cè)序，共得到有效序列249 343條，鑒定出23門(mén)37綱55目85科88屬39種。高通量測(cè)序分析表明銅銹環(huán)棱螺的胃內(nèi)細(xì)菌菌群主要由變形菌門(mén)(Proteobacteria)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)等23門(mén)(圖3)和鹽單胞菌屬(Halomonas)、乳球菌屬(Lactococcus)、肉桿菌屬(Carnobacterium)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)及節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、鏈霉菌屬(Streptomyces)等88屬組成(圖4)。

圖3 基于門(mén)水平的銅銹環(huán)棱螺胃中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)

圖4 基于屬水平的銅銹環(huán)棱螺胃中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)

2.3.2 真核生物成分分析

通過(guò)對(duì)Reads進(jìn)行剪切過(guò)濾，平均每個(gè)樣品測(cè)得143 663條Reads，通過(guò)質(zhì)控，平均得到135 756條有效數(shù)據(jù)，質(zhì)控有效率達(dá)94.50%。以97%的一致性將序列聚類(lèi)成為OTUs，共得到51個(gè)OTUs，然后與Silva132、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋?zhuān)?jīng)過(guò)篩選之后一共獲得16門(mén)29綱32目36科38屬。

測(cè)序結(jié)果表明：本次共檢測(cè)到了包括軟體動(dòng)物門(mén)(Mollusca)、領(lǐng)鞭毛蟲(chóng)門(mén)(Choanoflagellata)、脊索動(dòng)物門(mén)(Chordata)、擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)、節(jié)肢動(dòng)物門(mén)(Arthropoda)、纖毛門(mén)(Ciliophora)、綠藻門(mén)(Chlorophyta)、金藻綱(Chrysophyceae)、甲藻綱(Dinophyceae)、Streptophyta、真眼點(diǎn)藻綱(Eustigmatophyceae)、Discosea、絲足蟲(chóng)類(lèi)(Cercozoa)、隱藻綱(Cryptophyceae)、腹毛綱(Gastrotricha)等在內(nèi)的16門(mén)(圖5)。在屬水平上共檢測(cè)到了棕鞭藻屬(Ochromonas)、微芒藻(Micractinium)、小球藻屬(Chlorella)、Dolicholatirus、Phymorhynchus、Polyoeca、斑紋海豚屬(Lagenorhynchus)、跗線螨屬AD1063(Tarsonemidaegen.sp.AD1063)、內(nèi)生真菌屬(Gloeotinia)、Jaminaea、微擬球藻屬(Nannochloropsis)等在內(nèi)的38屬(圖6)。

圖5 銅銹環(huán)棱螺胃含物基于門(mén)分類(lèi)水平的真核生物分布

圖6 銅銹環(huán)棱螺胃含物基于屬分類(lèi)水平的真核生物分布

2.3.3 真菌成分分析

在對(duì)銅銹環(huán)棱螺胃內(nèi)真菌菌群組成分析中，主要選擇最具有代表性的門(mén)和屬兩個(gè)相對(duì)豐度水平對(duì)真菌菌群組成進(jìn)行分析。從真菌門(mén)水平分析，三十個(gè)環(huán)棱螺胃含物中可注釋到門(mén)水平的有子囊菌門(mén)(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)、被孢霉(Mortierellomycota)、毛霉門(mén)(Mucoromycota)、壺菌門(mén)(Chytridiomycota)共5個(gè)門(mén)，其中子囊菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)為主要優(yōu)勢(shì)菌門(mén)(圖7)。

圖7 銅銹環(huán)棱螺胃含物基于門(mén)分類(lèi)水平的真菌結(jié)構(gòu)

樣品在屬水平上共注釋到50個(gè)屬，平均豐度占比均低于1%，分別是馬拉色氏霉菌屬(Malassezia)、曲霉菌屬(Aspergillus)、被孢霉屬(Mortierella)、紅菇屬(Russula)、炭團(tuán)菌屬(Hypoxylon)、蠟殼菌屬(Sebacina)、嗜熱真菌屬(Thermomyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、擬棘殼孢屬(Pyrenochaetopsis)、鑲刀菌屬(Fusarium)、畢赤酵母屬(Pichia)、支頂孢屬(Acremonium)、Solicoccozyma等(圖8)。

圖8 銅銹環(huán)棱螺胃含物基于屬分類(lèi)水平的真菌結(jié)構(gòu)

3 討論

本研究運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)和鏡檢方法對(duì)螺螄養(yǎng)殖高產(chǎn)水田里的銅銹環(huán)棱螺胃含物進(jìn)行了分析，經(jīng)鑒定，胃含物中包含細(xì)菌18門(mén)88屬，真核生物16門(mén)38屬，真菌5門(mén)50屬。至于養(yǎng)殖銅銹環(huán)棱螺與非養(yǎng)殖銅銹環(huán)棱螺的食性是否存在不同則需要進(jìn)一步的研究。從本次的采樣情況來(lái)看，30個(gè)銅銹環(huán)棱螺中有4個(gè)腸道不含食物，攝食率為86.87%，空腸率為13.13%。在本次采樣解剖時(shí)發(fā)現(xiàn)部分銅銹環(huán)棱螺體內(nèi)含有仔螺，一方面猜測(cè)采樣時(shí)處于環(huán)棱螺的繁殖期，在繁殖季節(jié)環(huán)棱螺會(huì)減少攝食，導(dǎo)致空腸率偏高。另一方面可能是采樣時(shí)間為春天，而有研究表明梨形環(huán)棱螺因攝食強(qiáng)度不同，在春季空腸率較大[10]。因此，在銅銹環(huán)棱螺繁殖季節(jié)，根據(jù)其胃含物分析結(jié)果表明，在養(yǎng)殖中此階段需注意不宜過(guò)多投喂飼料造成不必要的浪費(fèi)，而以肥水和培養(yǎng)藻類(lèi)為主則較好。

高等動(dòng)物都會(huì)與豐富多樣的微生物群落有聯(lián)系，絕大部分的微生物又主要存在于胃腸道內(nèi)[19]。本次測(cè)序發(fā)現(xiàn)，銅銹環(huán)棱螺胃含物中變形菌門(mén)的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他菌門(mén)，為銅銹環(huán)棱螺胃腸道中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌，其次主要是放線菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)。這與齒紋蜒螺[19]、玫瑰高原鰍[20]等的腸道菌群組成類(lèi)似，只是比例不同。變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)普遍存在于動(dòng)物胃腸道[21]，其中變形菌門(mén)是細(xì)菌中最大的一門(mén)，對(duì)宿主的營(yíng)養(yǎng)代謝十分重要[22]。擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)都可以促進(jìn)宿主的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收，擬桿菌門(mén)主要參與宿主免疫系統(tǒng)的發(fā)育，而厚壁菌門(mén)可以產(chǎn)生多種消化酶幫助宿主分解各種物質(zhì)[23,24]。在屬水平上優(yōu)勢(shì)菌群主要有乳球菌屬、肉桿菌屬、曲霉菌屬、被孢霉屬及畢赤酵母屬等。其中乳球菌和肉桿菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的益生菌，可提高機(jī)體的免疫力，抑制消化道有害菌生長(zhǎng)[25]。曲霉屬和被孢霉屬菌株可產(chǎn)專(zhuān)一性催化水解殼聚糖的殼聚糖酶，也有助于宿主清除體內(nèi)垃圾、預(yù)防疾病[26]。畢赤酵母屬則能生產(chǎn)植酸酶，對(duì)改善動(dòng)物的生產(chǎn)性能和減少環(huán)境污染具有十分重要的意義[27]。

本研究發(fā)現(xiàn)銅銹環(huán)棱螺的胃含物以浮游植物和碎屑為主，其中藻類(lèi)是最主要的食物，有機(jī)碎屑次之，原生動(dòng)物含量較低，這與段曉姣[10]對(duì)生態(tài)溝渠中梨形環(huán)棱螺的食性研究相似，而與劉學(xué)勤[11]對(duì)湖泊底棲動(dòng)物食物組成的研究有一定的差異，其調(diào)查結(jié)果為環(huán)棱螺的主要食物是有機(jī)碎屑，造成這種現(xiàn)象的原因推測(cè)一方面是采樣位置的不同；另一方面是研究方法的差異，劉學(xué)勤采用的是傳統(tǒng)的鏡檢技術(shù)，而光學(xué)顯微鏡很難對(duì)粒徑較小的浮游植物分類(lèi)鑒定[28]。

在本研究中，利用高通量測(cè)序方法對(duì)30個(gè)銅銹環(huán)棱螺樣品的胃含物分別進(jìn)行16S、18S、ITS測(cè)序，鑒定出細(xì)菌18門(mén)88屬、真核生物16門(mén)38屬、真菌5門(mén)50屬；采用顯微鏡鏡檢技術(shù)對(duì)30個(gè)銅銹環(huán)棱螺的胃含物和后腸內(nèi)容物進(jìn)行鑒定，在胃中觀察到藻類(lèi)8門(mén)33屬和原生動(dòng)物如無(wú)節(jié)幼體、表殼蟲(chóng)、砂殼蟲(chóng)，在后腸中則發(fā)現(xiàn)藻類(lèi)7門(mén)25屬，其中銅銹環(huán)棱螺胃內(nèi)主要的食物成分是小球藻、裸藻和衣藻，后腸中則主要是隱藻和顫藻，推測(cè)銅銹環(huán)棱螺可能更喜食小球藻、裸藻和衣藻，而對(duì)隱藻和顫藻表現(xiàn)出較低選擇性。結(jié)果顯示高通量測(cè)序和顯微鏡鏡檢食性研究?jī)煞N方法都鑒定出的食物成分只有綠藻門(mén)的小球藻屬，充分證明了銅銹環(huán)棱螺對(duì)小球藻的選擇性。

本研究和其他研究都可以表明高通量測(cè)序可以檢出主要的食物成分以及肉眼無(wú)法鑒定的成分[29,30]。鏡檢分析法可直接檢驗(yàn)動(dòng)物短期內(nèi)攝食情況，但其在很大程度上取決于觀察者的鑒定方法和食物的消化程度。高通量測(cè)序技術(shù)雖能克服這些問(wèn)題，卻無(wú)法根據(jù)檢測(cè)到的食物成分DNA分析出食物的體積和重量，只能進(jìn)行多樣性分析。關(guān)于這一點(diǎn)本研究結(jié)合高通量測(cè)序和顯微鏡鏡檢法，從銅銹環(huán)棱螺胃內(nèi)菌群到胃和后腸內(nèi)含物組成進(jìn)行分析，了解了其食物組成和攝食強(qiáng)度[31]，極大增強(qiáng)了描述環(huán)棱螺食性的能力，可為開(kāi)展環(huán)棱螺人工養(yǎng)殖、營(yíng)養(yǎng)需求、餌料投喂和繁育特性提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和資料。

致謝

感謝華中農(nóng)業(yè)大學(xué)石瑞雪、肖作銘和田子楷在實(shí)驗(yàn)器材的使用以及實(shí)驗(yàn)技術(shù)方面的指導(dǎo)！