宏基因組二代測序技術(shù)在鑒別兒童腸道病原菌與耐藥菌中的應(yīng)用研究

李小梅

（郴州市第一人民醫(yī)院兒童感染科，湖南 郴州 423000）

兒童腹瀉是一種由多因素引起的常見病，臨床癥狀表現(xiàn)為大便次數(shù)增加或者大便性狀改變。該疾病是僅次于兒童呼吸道感染的第二大兒童常見病及多發(fā)病，嚴(yán)重威脅兒童的健康成長[1]。盡早確診并采用有效的抗菌藥物治療是減少此病患兒大便次數(shù)，改善其大便性狀的關(guān)鍵。有研究表明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的相關(guān)細(xì)菌、病毒與耐藥菌約有300 種。在發(fā)展中國家，大多數(shù)患兒的腹瀉是由大腸桿菌、志賀菌以及沙門桿菌等引起的[2]。宏基因組學(xué)作為新興組學(xué)，被廣泛應(yīng)用于新物種的發(fā)現(xiàn)、流行病學(xué)診斷、病原菌溯源、微生物與人體健康研究以及篩選重要微生物菌種中。與傳統(tǒng)微生物檢測方法相比，宏基因組測序技術(shù)解決了大部分微生物不能培養(yǎng)、痕量菌無法檢測等問題[3]。宏基因組二代測序是宏基因組學(xué)研究中的主要測序方法，具有測序速度快、準(zhǔn)確性高以及成本低等特點(diǎn)。本文主要是分析宏基因組二代測序技術(shù)在鑒別兒童腸道病原菌與耐藥菌中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020 年10 月至2022 年5 月我院收治的600 例腹瀉患兒作為研究對(duì)象。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究對(duì)象的納入標(biāo)準(zhǔn)

（1）患兒首次確診感染性腹瀉；（2）患兒家長知情并同意讓患兒參與研究；（3）患兒的臨床資料完整。

1.3 研究對(duì)象的排除標(biāo)準(zhǔn)

（1）合并免疫系統(tǒng)疾病、先天性疾病的患兒；（2）存在由飲食不當(dāng)、病毒等因素導(dǎo)致的腹瀉；（3）心、腦、腎等重要器官功能不全者。

1.4 檢測方法

1.4.1 病原菌檢測方法 所有患兒入院后均采用宏基因組二代測序技術(shù)進(jìn)行病原菌檢測。自患兒住院第一天起連續(xù)采集其腹瀉標(biāo)本直至其出院。標(biāo)本應(yīng)選取有膿血、黏液的新鮮糞便，在37℃甘油無菌水溶液中保存18 ～24 h，以便于進(jìn)行后期的細(xì)菌分離培養(yǎng)。將標(biāo)本放在無菌容器中保存，用于核酸提取，提取試劑盒購自QIAgen 公司。標(biāo)本采集后盡快分別接種于麥康凱平板和血平板中進(jìn)行臨床常見腹瀉病原菌的分離培養(yǎng)，然后外送華大基因公司進(jìn)行宏基因組二代測序技術(shù)檢測。

1.4.2 藥敏試驗(yàn) 將分離出來的主要革蘭陽性菌和革蘭陰性菌采用K-B 紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，藥物包括萬古霉素、慶大霉素、頭孢哌酮、利奈唑胺、復(fù)方磺胺甲噁唑、氨芐西林、舒巴坦等，K-B 紙片購自英國OXOID 公司，質(zhì)控菌相關(guān)處理按衛(wèi)生部的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料采用（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用[例（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病原菌檢測分析

600 例腹瀉患兒的糞便標(biāo)本中共分離出病原菌52株，檢出率8.67%（52/600）。其中包括革蘭陰性菌49 株，革蘭陽性菌3 株。49 株革蘭陰性菌中包括志賀菌屬8 株，大腸埃希菌6 株，沙門菌屬6 株，腸球菌屬6 株，變形桿菌屬6 株，福氏志賀菌4 株，弧菌屬3 株，鼠傷寒沙門菌2 株，副溶血弧菌2 株，嗜水氣單胞菌1 株，氣單胞菌屬、宋內(nèi)志賀菌、非0-1 群霍亂弧菌、河弧菌、類志賀鄰單胞菌各1 株。3 株革蘭陽性菌均為金黃色葡萄球菌。詳見表1。

表1 600 例腹瀉患兒糞便標(biāo)本病原菌的檢出情況及分布

2.2 主要病原菌檢出者發(fā)病季節(jié)的分布

主要病原菌檢出者的發(fā)病季節(jié)多為夏秋季節(jié)，即4 ～9 月。詳見表2。

表2 主要病原菌檢出者發(fā)病季節(jié)的分布[例（%）]

2.3 主要病原菌檢出者發(fā)病年齡的分布

主要病原菌檢出者的發(fā)病年齡多為1 ～5 歲，詳見表3。

表3 主要病原菌檢出者發(fā)病年齡的分布[例（%）]

2.4 主要病原菌的耐藥性分析

藥敏試驗(yàn)顯示，引發(fā)腹瀉的5 種主要病原菌對(duì)亞胺培南的耐藥性最低，其次是頭孢哌酮、哌拉西林他唑巴坦。詳見表4。

表4 主要病原菌的耐藥性分析[例（%）]

3 討論

通過檢測病原微生物了解腹瀉患兒的腸道菌群情況對(duì)于改善其預(yù)后而言極為重要[4]。研究顯示，年齡小于5 歲的兒童易發(fā)生細(xì)菌性腹瀉病[5]。調(diào)查研究指出，細(xì)菌感染是兒童腹瀉的主要原因之一，可引起細(xì)菌性腹瀉的病原菌有很多，主要病原菌為志賀菌。該病原菌入侵機(jī)體后，會(huì)不斷繁衍，引起不同程度的炎癥反應(yīng)[6]。由于腹瀉患兒的年齡通常較小，自身抵抗力弱，因此盡早確定導(dǎo)致其出現(xiàn)腹瀉的病因，并給予其針對(duì)性治療是極為重要的。近年來，隨著基因測序技術(shù)的不斷發(fā)展與完善，宏基因組二代測序技術(shù)因具有高效、病原菌檢出率高等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于相關(guān)臨床檢測。有研究結(jié)果顯示，在致病性大腸桿菌或志賀菌所致腹瀉患兒的腸道菌群中觀察到了某些病原菌與耐藥菌占比的明顯升高，同時(shí)也觀察到了腸道正常菌群占比的下降。本研究的結(jié)果顯示，600 例感染性腹瀉患兒病原菌的檢出率為8.67%，兒童腹瀉的主要病原菌有志賀菌屬、大腸埃希菌、沙門菌屬、變形桿菌屬、腸球菌屬。藥敏試驗(yàn)顯示，以上5 種主要病原菌對(duì)亞胺培南的耐藥性最低，其次是頭孢哌酮、哌拉西林他唑巴坦。上述結(jié)果說明在細(xì)菌感染性腹瀉患兒中，大多數(shù)患兒為革蘭陰性菌感染。臨床應(yīng)結(jié)合患兒的臨床特征、實(shí)驗(yàn)室血清檢查、糞便常規(guī)進(jìn)行綜合判斷，以便為相關(guān)臨床治療提供可靠依據(jù)。

綜上所述，宏基因組二代測序技術(shù)在鑒別兒童腸道病原菌中具有較高的應(yīng)用價(jià)值，可以準(zhǔn)確檢測出導(dǎo)致患兒出現(xiàn)細(xì)菌感染性腹瀉的主要病原菌。根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果合理選擇抗菌藥物，可保證相關(guān)治療的有效性。