光聲光譜在細(xì)菌性肺炎患者病原菌鑒定中的應(yīng)用價(jià)值

劉靜莎，張健鵬

（1.北京市順義區(qū)醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，北京 101300；2.中國人民解放軍總醫(yī)院第三醫(yī)學(xué)中心呼吸科，北京 100039）

人體呼出氣主要由氮?dú)?、氧氣、二氧化碳、水和其他氣體組成；同時(shí)在呼出氣中存在一些濃度范圍在ppbv ～pptv 的揮發(fā)性有機(jī)物（痕跡氣體）[1]。揮發(fā)性有機(jī)化合物（volatile organic compounds，VOCs）主要指的是在常溫的狀態(tài)下飽和蒸汽壓力超過133.32 Pa，且在常溫狀態(tài)下沸點(diǎn)處于50 ～260℃之間的有機(jī)化合物[2]。人體內(nèi)的VOCs 是在人體組織的正常生理過程和與疾病相關(guān)的病理過程中產(chǎn)生的[3]。所有的細(xì)胞都會(huì)在一定程度上產(chǎn)生一些VOCs，其相對(duì)豐度和反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致呼出氣中的VOCs 譜發(fā)生特定條件下的變化[4]。人體新陳代謝的部分產(chǎn)物可經(jīng)血液運(yùn)送至肺部，通過氣體交換進(jìn)入肺泡而出現(xiàn)在呼出氣中。當(dāng)人體處于炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激等狀態(tài)時(shí)，體內(nèi)代謝發(fā)生改變，其中一些揮發(fā)性物質(zhì)會(huì)進(jìn)入血液循環(huán)，并在血液流經(jīng)肺泡進(jìn)行氣體交換時(shí)通過呼出氣排出體外[5]。呼出氣體中VOCs 成分和量的不同，可反映人體不同的病理生理狀態(tài)。因呼出氣可揮發(fā)性有機(jī)物成分檢測(cè)具有無創(chuàng)、操作便捷、高靈敏度及高特異性等特點(diǎn)，近年來其被認(rèn)為可能成為一種安全便捷的疾病早期診斷方法[6]。但目前的相關(guān)研究多采用氣相色譜、質(zhì)譜等技術(shù)，這些檢測(cè)技術(shù)均存在著操作方法極其復(fù)雜、重復(fù)性差、檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和方法不統(tǒng)一、對(duì)操作人員要求高等缺點(diǎn)，與相關(guān)實(shí)際臨床應(yīng)用尚存在較大的距離。光聲光譜氣體檢測(cè)技術(shù)是利用光聲效應(yīng)實(shí)現(xiàn)痕量氣體檢測(cè)的一項(xiàng)重要技術(shù), 具有高靈敏度、高選擇性、零背景信號(hào)、可實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn), 在環(huán)境監(jiān)測(cè)、采礦冶金、能源電力、醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[7]。本研究擬采用光聲光譜技術(shù)（Photoacoustic spectroscopy, PAS）進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，同時(shí)觀察比較了細(xì)菌性肺炎患者的呼出氣與健康對(duì)照組的呼出氣中VOCs 光聲光譜檢測(cè)之間的差異，以期對(duì)細(xì)菌性肺炎的病原菌進(jìn)行早期識(shí)別。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

隨機(jī)選擇在某三甲醫(yī)院住院的痰細(xì)菌培養(yǎng)陽性的肺炎患者12 例（其中大腸桿菌肺炎4 例，肺炎克雷伯桿菌肺炎8 例）、醫(yī)院健康工作人員6 例作為觀察對(duì)象。肺炎患者作為肺炎組、健康工作人員作為健康對(duì)照組。肺炎組：（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18 ～80歲，性別不限；②確診細(xì)菌性肺炎；③連續(xù)三次痰細(xì)菌培養(yǎng)出同一種且單一的致病菌；④無吸煙史，無循環(huán)系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)疾病、糖尿病、腎功能不全等基礎(chǔ)疾??；⑤知情同意參與研究。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他系統(tǒng)疾??；②需要進(jìn)行有創(chuàng)或無創(chuàng)通氣的患者；③通氣或換氣功能障礙者；④無法配合正確收集呼出氣體的患者。健康對(duì)照組：（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18 ～80 歲，性別不限；②無吸煙史，無呼吸、循環(huán)、消化、泌尿及血液系統(tǒng)疾病；③近兩周內(nèi)未發(fā)生急性呼吸系統(tǒng)感染；④知情同意參與研究。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：①近兩周內(nèi)發(fā)生過急性呼吸系統(tǒng)感染者；②存在其他系統(tǒng)疾病者。

1.2 實(shí)驗(yàn)器材

1.2.1 Tedlar 氣體采樣袋及外接一次性吹嘴 Tedlar 氣體采樣袋及外接一次性吹嘴由大連德霖氣體包裝有限公司提供( 見圖1.1)。Tedlar 氣體采樣袋容量為300 mL。反復(fù)利用時(shí)需用純氧氣進(jìn)行反復(fù)充氣和抽氣，并在60℃條件下老化4 h（經(jīng)過老化后的采樣袋能有效降低背景值，可以再次使用）。

圖1.1 Tedlar 氣體采樣袋

1.2.2 光聲光譜分析儀（PASTA-1001）PASTA-1001光聲光譜分析儀由中國航天科技集團(tuán)北京某研究所研發(fā)( 見圖1.2)。主要參數(shù)：氣體采樣容積為30 mL；檢測(cè)時(shí)間30 min；檢測(cè)精度PPb 級(jí)；在0 ～40℃的工作條件下，其測(cè)量結(jié)果不會(huì)因環(huán)境溫度和氣壓的變化而產(chǎn)生漂移。

圖1.2 PASTA-1001 光聲光譜分析儀

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 受試者呼出氣的采集（1）第一次使用Tedlar采樣袋時(shí)，將其用蒸餾水清洗干凈，烘干，去除殘留物。之后重復(fù)使用時(shí)用純氧氣進(jìn)行反復(fù)充氣和抽氣3次，以置換殘留氣體備用。（2）受試者晨起后保持空腹安靜狀態(tài)，在通風(fēng)良好的室內(nèi)平靜呼吸0.5 h，用清水進(jìn)行口腔清潔后待測(cè)。（3）連接一次性吹嘴，打開夾子，囑患者向Tedlar 采樣袋中吹氣，反復(fù)呼吸數(shù)次，盡量使袋內(nèi)氣體接近肺泡氣體濃度。（4）關(guān)閉夾子，于10 min 內(nèi)連接光聲光譜儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2 氣樣的光聲光譜測(cè)量（1）將PASTA-1001 光聲光譜檢測(cè)儀開機(jī)預(yù)熱至池溫達(dá)到45℃（此狀態(tài)下機(jī)器性能較穩(wěn)定）。（2）將Tedlar 采樣袋的出口端（夾閉狀態(tài)）用橡膠管連接到PASTA-1001 進(jìn)氣閥管上，然后運(yùn)行機(jī)器抽氣1 min 形成管道負(fù)壓（池壓為233 mBar）。（3）打開橡膠管抽氣，使儀器顯示壓力平衡后運(yùn)行機(jī)器檢測(cè)，分別獲得初始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和初始光譜曲線（X 值表示波數(shù) cm-1，Y 值表示幅值au）。本試驗(yàn)選擇檢測(cè)波數(shù)范圍為1000 ～1250 cm-1，因?yàn)榇瞬〝?shù)段可涵蓋絕大部分的VOCs 和部分無機(jī)揮發(fā)性化合物，其中幅值與所測(cè)揮發(fā)性化合物的濃度成正比。（4）重復(fù)采用上述方法檢測(cè)其他標(biāo)本。

1.4 數(shù)據(jù)分析

將各組光聲光譜圖分析結(jié)果采用Originpro 8.5 繪圖軟件處理后得到光聲光譜圖（X 值表示波數(shù) cm-1，Y 值表示幅值au）。本試驗(yàn)選擇檢測(cè)波數(shù)范圍為1000 ～1250 cm-1，因?yàn)榇瞬〝?shù)段可涵蓋絕大部分的VOCs 和部分無機(jī)揮發(fā)性化合物，其中幅值與所測(cè)揮發(fā)性化合物的濃度成正比。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌性肺炎患者呼出氣與健康對(duì)照組呼出氣的光聲光譜檢測(cè)

為尋找大腸桿菌肺炎患者的特異性波峰，將大腸桿菌肺炎患者呼出氣與健康對(duì)照組呼出氣的光聲光譜測(cè)量結(jié)果進(jìn)行逐一對(duì)比（見圖2.1）。得出大腸桿菌肺炎患者在1120 ～1126 波數(shù)段、1228 ～1232 波數(shù)段及1236 ～1238 波數(shù)段處出現(xiàn)區(qū)別于健康對(duì)照組的波峰（圖2.1 A1、A2 為局部放大圖），而在其他波數(shù)段則未見明顯區(qū)別。

圖2.1 大腸桿菌肺炎患者與健康對(duì)照組呼出氣的光聲光譜檢測(cè)（圖2.1 A1、A2 為局部放大圖）

進(jìn)一步將4 例大腸桿菌肺炎患者和6 例健康對(duì)照組人員進(jìn)行一一對(duì)比（見圖2.2），我們發(fā)現(xiàn)4 例大腸桿菌肺炎患者的特征峰如下：（1）1236 ～1238 波數(shù)段：4 例大腸桿菌肺炎患者均有出現(xiàn)，出現(xiàn)頻率均為100%（見圖2.2 a2）；（2）1228 ～1232 波數(shù)段：4 例大腸桿菌肺炎患者均有出現(xiàn)，出現(xiàn)頻率均為100%（見圖2.2 a2）；（3）1120 ～1126 波數(shù)段：有2 例表現(xiàn)為上述的單峰，另外2 例表現(xiàn)為雙峰，該波數(shù)段的波峰在大腸桿菌肺炎患者中的出現(xiàn)頻率為50%（見圖2.2 a1）。

圖2.2 4 例大腸桿菌肺炎患者的光聲光譜檢測(cè)結(jié)果

在1120 ～1126 波數(shù)段，6 例健康對(duì)照組人員均出現(xiàn)與大腸桿菌肺炎患者不同的雙峰（見圖2.3 D1）。因此，大腸桿菌肺炎患者在1120 ～1126 波數(shù)段出現(xiàn)的單峰可初步將其與健康對(duì)照組相鑒別。而在1224 ～1228 波數(shù)段及1236 ～1238 波數(shù)段，6 例健康對(duì)照組人員中有4 例出現(xiàn)了與大腸桿菌肺炎相同的波峰（見圖2.3 D2）?？梢?，這兩個(gè)波峰對(duì)于區(qū)分大腸桿菌肺炎患者及健康對(duì)照組無特異性。因此，大腸桿菌肺炎患者在1120 ～1126 波數(shù)段出現(xiàn)的單峰，可作為大腸桿菌肺炎的特異性波峰（我們命名為E 峰），用于早期鑒別大腸桿菌肺炎。

圖2.3 健康對(duì)照組在與大腸桿菌肺炎相應(yīng)部位出現(xiàn)波峰情況的放大圖

2.2 肺炎克雷伯桿菌肺炎患者與健康對(duì)照組呼出氣光聲光譜檢測(cè)結(jié)果的比較

與上組比較相同，對(duì)肺炎克雷伯桿菌肺炎患者呼出氣與健康對(duì)照組呼出氣的光聲光譜測(cè)定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。從圖2.4 可以看出：肺炎克雷伯桿菌肺炎患者在1236 ～1238 波數(shù)段及1240 ～1242 波數(shù)段處出現(xiàn)區(qū)別于健康對(duì)照組的波峰（圖2.4 B6 為局部放大圖），在其他波數(shù)段未見明顯區(qū)別。

圖2.4 肺炎克雷伯桿菌肺炎患者與健康對(duì)照組呼出氣的光聲光譜檢測(cè)結(jié)果

將6 例肺炎克雷伯桿菌肺炎患者逐一與健康對(duì)照組對(duì)比發(fā)現(xiàn)，6 例肺炎克雷伯桿菌肺炎患者在不同波數(shù)段出現(xiàn)區(qū)別于健康對(duì)照組波峰的情況如下：（1）1236 ～1238 波數(shù)段：有3 例出現(xiàn)區(qū)別于健康對(duì)照組的波峰（見圖2.5 b1）；（2）1240 ～1242 波數(shù)段：有3 例出現(xiàn)區(qū)別于健康對(duì)照組的波峰（見圖2.5 b1）。

6 例健康對(duì)照組人員在不同波數(shù)段出現(xiàn)與肺炎克雷伯桿菌肺炎相似波峰的情況如下：（1）1236 ～1238 波數(shù)段：有5 例出現(xiàn)與肺炎克雷伯桿菌肺炎相似的波峰；（2）1240 ～1242 波數(shù)段：均未出現(xiàn)與肺炎克雷伯桿菌肺炎相似的波峰（見圖2.5 D3）。因此，通過光聲光譜檢測(cè)結(jié)果中1240 ～1242 波數(shù)段波峰的存在與否可將肺炎克雷伯桿菌肺炎患者與健康對(duì)照組相區(qū)別。1240 ～1242 波數(shù)段波峰可作為肺炎克雷伯桿菌肺炎的特異性波峰（我們命名為K 峰）。

圖2.5 6 例肺炎克雷伯桿菌肺炎患者及6 例健康對(duì)照組人員在相應(yīng)波數(shù)段出現(xiàn)波峰的情況

綜上所述，大腸桿菌肺炎患者及肺炎克雷伯桿菌肺炎患者可分別依據(jù)1120 ～1126 波數(shù)段（靈敏度為50%，特異度為100%）及1240 ～1242 波數(shù)段（靈敏度為50%，特異度為100%）與健康對(duì)照組初步相鑒別。

3 討論

PAS 是分子光譜學(xué)的一個(gè)重要分支，是基于光聲效應(yīng)的一種微量氣體檢測(cè)方法。用一定頻率調(diào)制的光源照射物質(zhì)分子吸收一定的光能后，在由受激態(tài)通過非輻射過程躍遷到低能態(tài)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生同頻的聲波（光聲信號(hào)），這一現(xiàn)象稱為光聲效應(yīng)[8]。PAS 主要是根據(jù)目標(biāo)氣體的光聲信號(hào)隨著入射光的波長變化形成譜線，從而做到對(duì)目標(biāo)氣體的即時(shí)識(shí)別。與傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)相比，其具有高靈敏度、高選擇性、高穩(wěn)定性、樣品無需進(jìn)行預(yù)處理、不消耗氣樣、可動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)、光譜范圍較廣及檢測(cè)快速等諸多優(yōu)點(diǎn)。因此其受到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。

與傳統(tǒng)光譜分析方法不同, PAS 主要是監(jiān)測(cè)物體吸收光能后產(chǎn)生的熱能中以聲壓形式表現(xiàn)出來的能量部分，即使在高反射弱吸收的情況下，吸收能也可被微音器檢測(cè)到[9]。紅外光譜由原子振動(dòng)和分子轉(zhuǎn)動(dòng)產(chǎn)生, 故又稱為分子的振- 轉(zhuǎn)光譜。紅外光譜有三個(gè)分區(qū)：（1）近紅外區(qū)，指波長為780 nm ～2.5 μm 的波數(shù)段；（2）中紅外區(qū)，指波長為2.5 μm ～25 μm的波數(shù)段；（3）遠(yuǎn)紅外區(qū)，指波長為25 μm ～1000 μm的波數(shù)段[10]。氣體分子在紅外光譜區(qū)的吸收是由于分子振動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng)的狀態(tài)變化或者分子振動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng)狀態(tài)在不同能級(jí)間的躍遷而產(chǎn)生的[11]。

細(xì)菌的代謝較之人體代謝來說，具有代謝更加旺盛、代謝類型更加多樣的特點(diǎn)。不同的細(xì)菌含有的酶不完全相同，對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的分解能力亦不一致，因而其代謝產(chǎn)物有區(qū)別，所產(chǎn)生的VOCs 種類有差異。根據(jù)此特點(diǎn)，可利用生物化學(xué)方法來鑒別不同細(xì)菌[12]。嚴(yán)冰[13]通過用細(xì)菌感染體外肺組織建立模型，檢測(cè)其產(chǎn)生的VOCs 發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌感染組存在十二烷、間-(1,1- 二甲基- 乙基)- 苯、十六醇三種特征性氣體成分，銅綠假單胞菌感染組則存在十二烷、間-(1,1-二甲基- 乙基)- 苯、2,4,6- 三(1,1- 二甲基- 乙基)-苯酸三種特征性成分。細(xì)菌感染人體后會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的代謝產(chǎn)物，進(jìn)而會(huì)出現(xiàn)在人的呼出氣中，而不同的氣體分子在用光聲光譜技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)會(huì)在不同的波段產(chǎn)生不同形態(tài)及幅度的波峰。

本研究應(yīng)用光聲光譜技術(shù)檢測(cè)細(xì)菌性肺炎患者及健康人的呼出氣并分析對(duì)比兩組的指紋圖譜發(fā)現(xiàn)：大腸桿菌肺炎患者呼出氣在1120 ～1126 波數(shù)段出現(xiàn)區(qū)別于健康對(duì)照組的特異性波峰（靈敏度為50%，特異度為100%），暫將其命名為E 峰（E 為Esherichia Coli 首字母）；肺炎克雷伯桿菌肺炎患者呼出氣在1240 ～1242 波數(shù)段出現(xiàn)區(qū)別于健康對(duì)照組的特異性波峰（靈敏度為50%，特異度為100%），暫稱其為K 峰（K 為Kleosiella Pneumoniaez 首字母）；但是這些特異性波峰所代表氣態(tài)物質(zhì)的具體成分目前并不清楚，尚需進(jìn)一步研究闡明。

人體新陳代謝的部分產(chǎn)物會(huì)隨血液流經(jīng)肺部，并通過氣體交換進(jìn)入肺泡，然后隨呼出氣呼出。當(dāng)人體受到外界病原體入侵或本身代謝狀態(tài)改變，如發(fā)生炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激等狀態(tài)時(shí)，體內(nèi)代謝發(fā)生改變，隨之呼出氣中的代謝產(chǎn)物也會(huì)有所不同，在光聲光譜檢測(cè)時(shí)便體現(xiàn)為波峰形態(tài)及位置的不同；依靠這些不同的波峰我們可以將肺炎患者及健康對(duì)照組初步區(qū)分。

綜上所述，將光聲光譜技術(shù)應(yīng)用于細(xì)菌性肺炎病原菌的識(shí)別檢測(cè)，是對(duì)細(xì)菌性肺炎診斷的一次新的嘗試。目前可供參考的相關(guān)文獻(xiàn)及方法有限，本研究還存在一定的不完善和不足之處，比如因入選標(biāo)準(zhǔn)比較嚴(yán)格，本研究樣本量較小，結(jié)果的代表性不足；加之細(xì)菌產(chǎn)生的VOCs 在人體呼出氣中含量甚微，同時(shí)人體在細(xì)菌入侵引起的感染狀態(tài)時(shí)發(fā)生氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的VOCs 對(duì)細(xì)菌代謝物檢測(cè)也存在一定干擾。因此，在后續(xù)的研究中仍需擴(kuò)大樣本量、改進(jìn)研究方法，進(jìn)而讓光聲光譜這一靈敏、即時(shí)、高效的檢測(cè)技術(shù)能夠盡早廣泛地應(yīng)用于相關(guān)臨床早期診斷。