鼻咽癌組織中MCP-3基因、蛋白表達(dá)檢測(cè)及其與臨床特征的關(guān)系分析*

劉芳賢 朱 儉 韋淙寶 唐嘉晨 鄧西林

1 桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西桂林市 541001； 2 湖南省常德市第一人民醫(yī)院

鼻咽癌是臨床常見的惡性腫瘤，尤其在我國南方部分地區(qū)多發(fā)，對(duì)居民的健康產(chǎn)生了極大的威脅。近年來鼻咽癌的發(fā)病率逐年增長，約為1.65/10萬～5/10萬，死亡率也有所升高，目前累積死亡率約為0.14%，已引起該領(lǐng)域工作人員的高度重視[1]。大多鼻咽癌發(fā)病早期并無特異性臨床表現(xiàn)，而中晚期可出現(xiàn)鼻塞、涕中帶血、聽力下降、耳悶堵感等表現(xiàn)，常錯(cuò)過最佳的治療時(shí)機(jī)。研究指出[2]，鼻咽癌的發(fā)生和發(fā)展受多種因素的影響，其中細(xì)胞生物學(xué)行為調(diào)控基因和蛋白的異常表達(dá)是重要的基礎(chǔ)條件。單核細(xì)胞趨化蛋白-3(MCP-3)是一種重要的趨化因子，可活化和趨化免疫細(xì)胞，在惡性腫瘤免疫細(xì)胞浸潤病理改變過程中具有重要的作用[3]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)[4-6]，MCP-3可結(jié)合和活化多種趨化因子受體，從而調(diào)控細(xì)胞免疫，在大腸癌主動(dòng)免疫、喉鱗癌發(fā)生和發(fā)展中均有一定作用，且與腫瘤內(nèi)炎性微環(huán)境有關(guān)，從而可影響惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。但MCP-3在鼻咽癌組織中是否異常表達(dá)及其與臨床特征是否有緊密關(guān)系仍尚未可知。為此，本文對(duì)82例鼻咽癌活檢確診的石蠟存檔組織檢測(cè)MCP-3 mRNA、蛋白表達(dá)，并分析其與臨床特征的關(guān)系，以加深對(duì)鼻咽癌的認(rèn)識(shí)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取醫(yī)院2017年6月—2019年6月收治82例鼻咽癌患者的臨床資料進(jìn)行回顧。(1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①均采用組織活檢病理學(xué)檢查證實(shí)為鼻咽癌；②活檢組織均石蠟包埋存檔；③均有完整的臨床特征數(shù)據(jù)資料；④均經(jīng)本人或家屬同意；(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性鼻咽部惡性腫瘤者；②活檢確診前接受放化療等抗腫瘤治療者；③存在其他類型與MCP-3基因、蛋白異常表達(dá)有關(guān)的疾病者。本組患者中男46例、女36例，年齡38～76歲，平均年齡(55.83±10.06)歲，臨床表現(xiàn)：無明顯特異性臨床表現(xiàn)者22例、頸部淋巴結(jié)腫大48例、涕中帶血36例、耳悶堵感伴聽力下降32例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期61例、Ⅲ～Ⅳ期21例；病理類型：鱗狀細(xì)胞癌未分化2例、鱗狀細(xì)胞癌低分化80例。

1.2 方法 實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)MCP-3 mRNA表達(dá)：取癌組織、癌旁組織(距癌組織0.5cm)各1cm3。液氮冷凍研磨勻漿，加入1ml Trizol試劑，離心分離(14 000r/min，3cm，10min)。抽提RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。配置PCR反應(yīng)體系，其中MCP-3 上游引物：5’-CTGGCTCGATAGCTAGAGCTAGATCGAT-3’；下游引物：5’-CGCGCTAGATCGATATAGCTATAAGCGATCGA-3’，長度18bp、20bp；β-actin上游引物：5’-TCGATAGCTAGATAGGCTAGATCGATAGCAGAGCTAG-3’；下游引物：5’-CTAGATAGAGAGAAGCGAAGCGTAAGCTAGATCGAA-3’，長度均為20bp。實(shí)施擴(kuò)增反應(yīng)：95℃(30s)，35個(gè)循環(huán)：95℃(5s)、58℃(20s)、52℃(30s)，最后60℃(5min)。采用配套軟件計(jì)算MCP-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量，即2-△△Ct。

免疫組化法(SP)檢測(cè)MCP-3蛋白表達(dá)：同法取癌組織、癌旁組織。切片、烤片、消化并經(jīng)室溫孵育10min，滅活后加入鼠抗人MCP-3單克隆抗體(一抗，放大倍數(shù)1 000)，孵育(4℃、過夜)。磷酸鹽緩沖液沖洗(3次×5min)，加入兔抗鼠MCP-3多克隆抗體(二抗，以辣根過氧化物酶標(biāo)記，放大倍數(shù)5 000)，孵育(27℃、2h)。加入適量顯色液，蘇木素復(fù)返，鹽酸返藍(lán)，封固。光鏡下觀察陽性染色細(xì)胞(細(xì)胞漿或細(xì)胞膜呈淡黃色、棕黃色或棕褐色)，采用由 CMOS(日本 OLYMPUS 公司)及專用軟件(美國 Imaging 技術(shù)公司)組成的計(jì)算機(jī)圖像處理系統(tǒng)分析 MCP-3蛋白的表達(dá)，設(shè)定陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)：<1%、≥1%且<10%、≥10%且<50%、≥50%且<75%、≥75%且<100%分別記為0分、1分、2分、3分、4分；顯色強(qiáng)度：陰性、弱陽性、陽性、強(qiáng)陽性分別記為0分、1分、2分、3分。計(jì)算二者乘積，分別將0～3分、4～6分、7～9分、10～12分者記為陰性、弱陽性、陽性、強(qiáng)陽性表達(dá)。

1.3 觀察指標(biāo) (1)對(duì)比癌組織、癌旁組織MCP-3 mRNA表達(dá)；(2)對(duì)比癌組織、癌旁組織MCP-3 蛋白表達(dá)；(3)對(duì)比不同臨床特征患者癌組織MCP-3 mRNA、蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 癌組織、癌旁組織MCP-3 mRNA表達(dá)對(duì)比 癌組織MCP-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為1.02±0.20，高于癌旁組織的0.56±0.12(t=17.859，P=0.000<0.05)。

2.2 癌組織、癌旁組織MCP-3蛋白表達(dá)對(duì)比 癌組織、癌旁組織MCP-3蛋白表達(dá)分布對(duì)比差異顯著(P<0.05)，癌組織MCP-3蛋白陽性表達(dá)率高于癌旁組織(P<0.05)，見表1、圖1～2。

表1 癌組織、癌旁組織MCP-3蛋白表達(dá)對(duì)比[n(%)]

圖1 鼻咽癌組織MCP-3染色陽性 圖2 癌旁組織MCP-3染色陰性

2.3 不同臨床特征患者癌組織MCP-3 mRNA、蛋白表達(dá)對(duì)比 不同性別、年齡、病理類型患者癌組織MCP-3 mRNA、蛋白表達(dá)對(duì)比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Ⅲ～Ⅳ期患者癌組織MCP-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量、蛋白陽性表達(dá)率均高于Ⅰ～Ⅱ期患者(P<0.05)，見表2。

表2 不同臨床特征患者癌組織MCP-3 mRNA、蛋白表達(dá)對(duì)比

3 討論

鼻咽癌的發(fā)生與家族史、病毒感染、致癌物質(zhì)接觸等均有密切關(guān)聯(lián)，但目前人們對(duì)該病發(fā)生與發(fā)展的機(jī)制認(rèn)識(shí)尚淺。細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等行為失控與多種基因和蛋白均有密切關(guān)聯(lián)，是當(dāng)前國內(nèi)外研究的重點(diǎn)[7-9]。研究表明[10]，鼻咽癌往往由于解剖位置隱蔽、特殊，與重要組織器官毗鄰且容易侵犯周圍組織，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生率高，預(yù)后差。除鼻咽癌細(xì)胞癌基因的激活和抑癌基因的失活參與病變外，免疫微環(huán)境紊亂也是疾病發(fā)生與發(fā)展的重要條件，可導(dǎo)致惡性腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，為其異常增殖創(chuàng)造條件。而深入探討與免疫微環(huán)境紊亂有關(guān)的調(diào)控機(jī)制對(duì)加深鼻咽癌的認(rèn)識(shí)、研究新的治療方案均具有至關(guān)重要的意義。

趨化因子是惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展過程中的重要因子，與其免疫逃逸、增殖、遷移和侵襲等均密切相關(guān)，因此推測(cè)趨化因子的異常表達(dá)與鼻咽癌也有緊密關(guān)聯(lián)。本次研究中，癌組織MCP-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量、蛋白陽性表達(dá)率均高于癌旁組織，且癌組織與癌旁組織MCP-3蛋白表達(dá)分布對(duì)比差異顯著(P<0.05)，可知在鼻咽癌組織中MCP-3基因與蛋白均高表達(dá)。MCP-3是一類重要的趨化因子，不僅可促進(jìn)循環(huán)成血管細(xì)胞歸巢，還可刺激其遷移，加快體內(nèi)血管形成，而新血管的生成是鼻咽癌發(fā)生的重要條件[11]。有研究表明[12]，采用MCP-3基因轉(zhuǎn)染技術(shù)可提高肺癌干細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和成管能力，推測(cè)其高表達(dá)可能參與肺癌的發(fā)生和發(fā)展。MCP-3能夠激活大量淋巴細(xì)胞，且對(duì)中性粒細(xì)胞也有趨化作用，可增加腫瘤周圍組織內(nèi)的樹突細(xì)胞數(shù)量，提高嗜酸性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的含量，參與炎性微環(huán)境的形成和維持。有研究推測(cè)惡性腫瘤組織的炎性微環(huán)境中MCP-3含量顯著升高，可能參與淋巴細(xì)胞的招募與定位，是惡性腫瘤形成的必經(jīng)過程，還可參與巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的病變過程[13]。結(jié)合上述分析和本研究結(jié)果可知在鼻咽癌組織中MCP-3基因與蛋白均高表達(dá)，推測(cè)可參與該病的發(fā)生和發(fā)展。

MCP-3激活不僅可加快新血管的生成，還可導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境紊亂，使得大量促炎癥因子分泌，共同參與惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。本文中顯示，Ⅲ～Ⅳ期患者癌組織MCP-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量、蛋白陽性表達(dá)率均高于Ⅰ～Ⅱ期患者，可知晚期鼻咽癌患者癌組織MCP-3 mRNA及蛋白表達(dá)均顯著高于早中期患者，MCP-3異常高表達(dá)很可能與鼻咽癌患者的臨床分期有相關(guān)性。MCP-3表達(dá)上調(diào)，可增加其效應(yīng)細(xì)胞分泌的因子，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，從而推動(dòng)鼻咽癌患者的病情發(fā)展[14]。既往研究顯示[15]，在喉癌組織中MCP-3表達(dá)水平較高，且臨床分期越高其表達(dá)水平越高，推測(cè)MCP-3的激活可參與喉癌的發(fā)生和發(fā)展。另有報(bào)道證實(shí)[16]，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者癌組織中MCP-3基因與蛋白的表達(dá)水平更高，與本研究結(jié)果相符，證實(shí)MCP-3激活很可能與鼻咽癌的臨床分期呈相關(guān)性。

綜上所述，在鼻咽癌組織中MCP-3 mRNA及蛋白表達(dá)明顯高于癌旁組織，且臨床分期Ⅲ～Ⅳ期患者癌組織中MCP-3 mRNA及蛋白表達(dá)水平均更高，推測(cè)MCP-3的激活是鼻咽癌發(fā)生和發(fā)展的重要條件，在腫瘤靶向治療方向顯示出良好的挖掘前景，但MCP-3激活對(duì)鼻咽癌發(fā)生和發(fā)展的具體調(diào)控機(jī)制仍需要研究和探討，應(yīng)成為后續(xù)工作的重點(diǎn)。