Rh(D)初篩陰性孕婦妊娠史與抗D同種免疫的相關(guān)性分析*

周麗玲 李 艷

江蘇省徐州市紅十字血液中心 221006

胎兒與新生兒溶血病(Hemolytic Disease of the Fetus and Newborns,HDFN)是因胎母紅細(xì)胞血型不合而引發(fā)的嚴(yán)重疾病。迄今為止，ABO、Rh血型不合引起的 HDFN最為常見。如果Rh(D)陰性婦女初次妊娠Rh陽性胎兒，有1/6的可能產(chǎn)生初次免疫，如果再次妊娠Rh陽性胎兒就有可能發(fā)生HDFN，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為胎兒或新生兒水腫、貧血、核黃疸甚至死亡[1]。大部分學(xué)者認(rèn)為，造成HDFN的抗D效價(jià)臨界值為16，若孕婦抗D效價(jià)≥16時(shí)，則提示胎兒、新生兒可能發(fā)生嚴(yán)重HDFN，需采取適當(dāng)措施控制病情進(jìn)展，若孕婦抗D效價(jià)<16時(shí)，發(fā)生HDFN可能性很低[2]。對(duì)Rh(D)陰性孕婦進(jìn)行血型抗原及意外抗體的初步篩查、抗體特異性鑒定和抗體效價(jià)檢測，跟蹤監(jiān)測抗D效價(jià)的變化，可為抗D引起的HDFN的及時(shí)治療提供臨床實(shí)驗(yàn)證據(jù)。本文通過對(duì)初篩為Rh(D)陰性孕婦妊娠史進(jìn)行分類，研究妊娠史對(duì)抗D同種免疫的影響，以期為Rh(D)陰性孕婦產(chǎn)前監(jiān)測指導(dǎo)提供更充足的理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2010年5月—2021年10月在本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行抗體篩查檢測的Rh初篩陰性孕婦為研究對(duì)象，共計(jì)1 355例，去除重復(fù)檢測、無孕產(chǎn)史、注射免疫球蛋白及有輸血史孕婦，共計(jì)719例。最低年齡18歲，最高年齡44歲，中位數(shù)31歲。

1.2 主要試劑和儀器 抗D(IgM) 單克隆抗體(上海血液生物);3種IgG / IgM 混合型單克隆抗-D 試劑分別來自英國Millpore，加拿大Dominion，北京金豪;抗C(上海血液生物);抗c(上海血液生物);抗E(上海血液生物);抗e(上海血液生物);抗體篩選細(xì)胞(上海血液生物);譜細(xì)胞(上海血液生物);抗IgG,C3d(上海血液生物);血清學(xué)專用離心機(jī)(久保田，型號(hào):KA-2200);37℃恒溫水浴箱(上海比朗，型號(hào):HH-600)。所有試劑均在有效期內(nèi)。

1.3 RhD表型鑒定 (試管法) Rh血型初篩采用IgM 抗D檢測紅細(xì)胞表面D抗原，檢測結(jié)果為陰性的判定為Rh(D)初篩陰性；初篩為Rh(D)陰性的標(biāo)本，用抗人球蛋白實(shí)驗(yàn)進(jìn)行Rh(D)陰性確認(rèn)。用至少3種不同來源或批次的單克隆IgG抗-D血清分別與受血者紅細(xì)胞進(jìn)行間接抗人球蛋白試驗(yàn)(試管法)。對(duì)于3管間接抗人球蛋白試驗(yàn)均為陰性的結(jié)果，判定為Rh(D)陰性。試管鹽水介質(zhì)法對(duì)Rh(D)陰性進(jìn)行RhCE分型檢測。

1.4 抗體篩查、鑒定 對(duì)Rh(D)初篩陰性標(biāo)本，使用篩選細(xì)胞1#、2#、3#進(jìn)行間接抗人球蛋白實(shí)驗(yàn)(IAT)檢測血清(漿)中的意外抗體。對(duì)IAT陽性的標(biāo)本，進(jìn)一步使用譜細(xì)胞鑒定抗體特異性。具體實(shí)驗(yàn)操作按照操作規(guī)程[3]和試劑操作說明書進(jìn)行。

1.5 抗D抗體效價(jià)測定 取50μl待檢血清，進(jìn)行倍比稀釋，再每管加入濃度為3%的DccEE紅細(xì)胞，37℃孵育30min后，用生理鹽水洗滌3遍后，棄上清，加入抗IgG,C3d后，3 400r/min離心15s后看結(jié)果，以出現(xiàn)肉眼可見紅細(xì)胞凝集±最高稀釋度的倒數(shù)為抗D效價(jià)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理數(shù)據(jù)，分類變量資料采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗體篩查與鑒定 對(duì)719例初篩Rh(D)陰性孕婦進(jìn)行抗體篩查，其中檢出IgG型抗D共28例，其中2例合并抗C；IgG型抗E共1例；IgM型抗M共3例；未鑒定出特異性的低效價(jià)冷抗體共1例，其余抗體篩查結(jié)果均為陰性。詳見表1。

表1 初篩Rh(D)陰性孕婦產(chǎn)前抗體篩查結(jié)果

2.2 妊娠史與抗D同種免疫的相關(guān)性分析 719例初篩Rh(D)陰性孕婦中，懷孕史1～7次，生產(chǎn)史1～2次，以妊娠次數(shù)分為4組。G1P0和G1P1為孕1次組，共計(jì)177例，抗D陽性 0例；G2P0、G2P1和G2P2為孕2次組，共計(jì)284例，抗D陽性8例，陽性率2.82%；G3P0、G3P1和G3P2為孕3次組，共計(jì)156例，抗D陽性7例，陽性率4.49%；懷孕4次以上均歸為孕4次及以上組，共計(jì)102例，抗D陽性13例，陽性率12.7%。隨著妊娠次數(shù)的增加，抗D的陽性率相應(yīng)的上升。孕2次、孕3次、孕4次組分別與孕1次組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。(G:懷孕，P:生產(chǎn)，G1P0表示：孕1產(chǎn)0)

表2 Rh(D)陰性個(gè)體妊娠史與抗D同種免疫相關(guān)性分析

2.3 妊娠史與抗D效價(jià)的相關(guān)性分析 分別對(duì)孕2次組、孕3次組及孕4次及以上組的效價(jià)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)同一孕次在不同階段檢測的效價(jià)，以最后一次檢測為準(zhǔn)。其中5例在統(tǒng)計(jì)時(shí)間段里有2次妊娠史，按每次妊娠獨(dú)立統(tǒng)計(jì)效價(jià)，共計(jì)33例。將效價(jià)分為<16和≥16兩組孕3次、孕4次組分別與孕2次組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。詳見表3。

表3 妊娠史與抗體效價(jià)的相關(guān)性比較

3 討論

Rh血型系統(tǒng)與臨床密切相關(guān)且意義重大的有 D 、 C 、c 、 E 、 e 5 個(gè)抗原，其中，D抗原免疫原性最強(qiáng)。當(dāng)被D抗原致敏的Rh(D)陰性孕婦妊娠Rh(D)陽性胎兒時(shí)，胎兒紅細(xì)胞經(jīng)過胎盤滲入母體血液系統(tǒng)，刺激母體產(chǎn)生IgG性質(zhì)抗D；后者通過胎盤進(jìn)入胎兒血液系統(tǒng)，與胎兒紅細(xì)胞膜上的D抗原結(jié)合，使胎兒紅細(xì)胞發(fā)生溶血，引起HDFN。

產(chǎn)生抗D抗體是Rh(D)陰性孕婦發(fā)生HDFN的先兆。本研究共篩查1 355例Rh(D)陰性孕婦，去除注射免疫球蛋白、有輸血史、無孕產(chǎn)史及重復(fù)檢測個(gè)體，共計(jì)719例，檢出IgG型抗體29例，均屬于Rh血型系統(tǒng)，其中抗D 28例，2例合并抗C，1例抗E。本地區(qū)Rh(D)陰性孕產(chǎn)婦抗D同種免疫的比例為3.89%(28/719)，與南京地區(qū)報(bào)道的4.14%相近[4]，遠(yuǎn)低于山東地區(qū)報(bào)道的9.54%[5]。筆者推測原因?yàn)椋?1)山東地區(qū)的研究未將有輸血史的Rh(D)陰性孕產(chǎn)婦剔除，有一部分Rh(D)陰性孕產(chǎn)婦是由于輸血引起的抗D同種免疫，導(dǎo)致該地區(qū)孕產(chǎn)婦抗D同種免疫發(fā)生率高；(2)可能與地區(qū)間DEL血型的占比有關(guān)。DEL是一種極弱的D抗原表達(dá)型，其弱D抗原只能通過吸收放散試驗(yàn)才可檢出，目前常規(guī)定型無法將DEL型與真正Rh(D)陰性區(qū)分開來 。研究表明，“亞洲型”DEL血型個(gè)體紅細(xì)胞表面具有完整的D抗原表位，該抗原表位的存在可以使機(jī)體不會(huì)因外源性D抗原刺激而發(fā)生抗D同種免疫[6]。是否是由于本地區(qū)“亞洲型”DEL血型較山東地區(qū)高，導(dǎo)致Rh(D)陰性抗D同種免疫發(fā)生率低，還有待進(jìn)一步研究。

本研究1例Rh(D)陰性孕產(chǎn)婦檢出抗E，而未檢出抗D，其ABO血型為AB型，Rh分型為Ccee，孕4產(chǎn)1，胎兒父親的血型為O型Rh(D)陽性。筆者推測胎兒父親Rh分型含有E抗原，胎兒從父親那遺傳了E抗原，刺激胎母產(chǎn)生抗E抗體。E抗原的免疫原性較D抗原的低，推測這例Rh(D)陰性孕婦含有用常規(guī)方法檢測不出的完整的D抗原表位，即為“亞洲型”DEL型。是否為“亞洲型”DEL型還需要進(jìn)一步進(jìn)行基因分型檢測。

有文獻(xiàn)報(bào)道，自然狀態(tài)下，Rh(D)陰性孕婦的抗D同種免疫往往發(fā)生于第2胎及以后，這是因?yàn)樵诘?次妊娠時(shí)，胎兒紅細(xì)胞上的D抗原滲入母體的紅細(xì)胞造成母體初次免疫，下一次妊娠時(shí)，再次滲入母體的胎兒紅細(xì)胞上的D抗原會(huì)刺激母體免疫系統(tǒng)的回憶反應(yīng)，從而產(chǎn)生抗D[7]。本研究以不同的妊娠次數(shù)對(duì)719例標(biāo)本分為4組，若孕產(chǎn)婦不同孕次均有檢出抗D，則以首次產(chǎn)生抗D的孕次為準(zhǔn)。孕1次包括孕1和孕1產(chǎn)1，均無抗D同種免疫發(fā)生，進(jìn)一步說明抗D引起的HDFN不會(huì)發(fā)生在第1胎。隨著妊娠次數(shù)的增加，即Rh(D)陰性個(gè)體接受D抗原刺激次數(shù)增加，發(fā)生抗D同種免疫的概率逐漸增大。本研究將妊娠2次以上的Rh(D)陰性孕產(chǎn)婦分為三組對(duì)抗D同種免疫的發(fā)生率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)孕2次、孕3次及孕4次以上抗D同種免疫的發(fā)生率分布為2.82%、4.49%、12.7%。其中有1例產(chǎn)生抗D的Rh(D)陰性孕婦，其妊娠史為孕3產(chǎn)0，提示即使無生產(chǎn)史，多次流產(chǎn)史也能刺激Rh(D)陰性孕婦發(fā)生抗D同種免疫。

定期監(jiān)測效價(jià)是目前臨床常用于Rh(D)陰性血型孕婦孕期管理的檢測方法之一。本研究表明孕婦的妊娠次數(shù)與抗D效價(jià)高低并無明顯關(guān)聯(lián)性，原因可能是抗D效價(jià)的增長與Rh(D)陰性孕婦胎母出血量、母體免疫應(yīng)答能力等因素有關(guān)。但抗D效價(jià)高低致使HDFN發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)及溶血程度，則有待進(jìn)一步研究。

抗D抗體能引起嚴(yán)重的HDFN。為了降低抗D導(dǎo)致的HDFN的發(fā)生率，一方面，Rh(D)陰性孕產(chǎn)婦要減少流產(chǎn)的次數(shù)，以避免妊娠次數(shù)的增加導(dǎo)致抗D同種免疫的發(fā)生率增高；另一方面，加強(qiáng)Rh血型的檢測，對(duì)確定為Rh(D)陰性的孕產(chǎn)婦，特別是有2次及以上妊娠史的，要加強(qiáng)這類孕產(chǎn)婦的意外抗體篩查及效價(jià)動(dòng)態(tài)監(jiān)測，結(jié)合胎兒大腦中動(dòng)脈收縮期峰值流速等相關(guān)檢查，對(duì)于病情進(jìn)展快速的孕產(chǎn)婦，建議臨床采取提前分娩措施，降低胎兒宮內(nèi)溶血。