斑馬魚用于醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的可行性分析與探討*

劉延英 陳文靜 龍騰騰 崔 晴 張志剛 高 垚 初文昌 趙靖文 單筠睿 梁美英 岳 旺

青島黃海學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教研室，山東省青島市 266427

醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)是促進(jìn)醫(yī)學(xué)生基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)理論知識(shí)與實(shí)踐相結(jié)合，開發(fā)醫(yī)學(xué)生學(xué)習(xí)潛力、啟發(fā)創(chuàng)新性思維，提高未來臨床實(shí)踐能力，培養(yǎng)復(fù)合型醫(yī)學(xué)人才的一門重要學(xué)科，是醫(yī)學(xué)生學(xué)習(xí)過程中不可缺少的一部分。傳統(tǒng)的醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)，例如醫(yī)學(xué)機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)，多采用哺乳類動(dòng)物如小鼠、大鼠、家兔或狗等為動(dòng)物模型來完成教學(xué)。但是，這些模式生物本身都存在缺陷包括動(dòng)物價(jià)格昂貴、飼養(yǎng)周期長、動(dòng)物具有攻擊性、操作復(fù)雜和實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性差等方面的問題。因此，尋找一種安全可靠、簡單經(jīng)濟(jì)易操作的理想模式生物代替?zhèn)鹘y(tǒng)的哺乳動(dòng)物完成實(shí)驗(yàn)教學(xué)，已成為醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)研究中的一項(xiàng)重要內(nèi)容。

斑馬魚是一種原產(chǎn)于南亞，印度東部、巴基斯坦、緬甸、尼泊爾等地的熱帶淡水硬骨魚。在20世紀(jì)70 年代, 美國俄勒岡大學(xué)著名遺傳學(xué)家 George Streisinger的研究小組對(duì)斑馬魚進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，為斑馬魚成為一種模式生物奠定了基礎(chǔ)。在隨后的幾十年中，斑馬魚因?yàn)槠浔旧愍?dú)特的生理解剖結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和作為模式生物不同于其他動(dòng)物的優(yōu)勢(shì)被廣泛用于遺傳發(fā)育生物學(xué)[1-2]、人類疾病[3-4]、環(huán)境毒理學(xué)[5]和藥理學(xué)[6-7]等領(lǐng)域的研究。在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，斑馬魚能否發(fā)揮其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，替代部分傳統(tǒng)的哺乳動(dòng)物完成實(shí)驗(yàn)教學(xué)是一個(gè)值得探討的問題。本研究采用醫(yī)學(xué)機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)經(jīng)典的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)中的呼吸興奮劑尼可剎米(Nikethamide)分別處理斑馬魚和小鼠，觀察溶于水中的尼可剎米對(duì)斑馬魚游泳行為的影響和致驚厥量的尼可剎米導(dǎo)致小鼠驚厥反應(yīng)表現(xiàn)，探討和分析斑馬魚作為醫(yī)學(xué)教學(xué)用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的潛在價(jià)值和可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、儀器和藥品 成年斑馬魚(購自山東一溪月生物科技有限公司)，雌雄不限，體長(35±5)mm，體重(180±50)mg，于水族箱中飼養(yǎng)，晝夜自然照明。室溫與水溫控制在(24±3)℃，水質(zhì)接近中性，pH值保持在6.5～7.5，每3～4d換水1次。正常喂食，2次/d。適應(yīng)性馴養(yǎng)5d后，取斑馬魚30條，禁食12h后用于實(shí)驗(yàn)。

成年雄性昆明種小鼠20只(由青島市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體重(23±5)g。室溫控制在(22±3)℃，晝夜自然照明。正常飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，于實(shí)驗(yàn)前禁食12h。

圓柱形水族箱，直徑20cm，高15cm，市場(chǎng)購得；滅菌注射用水(500ml/瓶，陜西圣奧動(dòng)物藥業(yè)有限公司)；無菌生理鹽水(100ml/瓶，山東科倫藥業(yè)股份有限公司);1ml無菌注射器(濰坊市華星醫(yī)療器械有限公司)；電子天平(JA2003,上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；玻璃燒杯(50～100ml)和量筒(Bomex,50ml,北京博美玻璃有限公司)；尼可剎米(1.5ml,0.375g/支，天津金耀藥業(yè)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 測(cè)試尼可剎米對(duì)斑馬魚的作用：將用于實(shí)驗(yàn)的30條斑馬魚被隨機(jī)分為對(duì)照組、低劑量組和高劑量組，每組10條。以無菌注射用水配制不同濃度的尼可剎米。低劑量組的配制比例(體積比)是無菌注射用水∶尼可剎米=250∶1，尼可剎米最終濃度為1mg/ml；高劑量組的配制比例(體積比)是無菌注射用水∶尼可剎米=66.67∶1，尼可剎米最終濃度為3.75mg/ml；對(duì)照組斑馬魚的測(cè)試水中僅加入無菌注射用水。主要操作步驟：首先取100ml量筒，將無菌注射用水和尼可剎米按照上述不同的比例進(jìn)行混勻，其次將配制好的不同濃度的尼可剎米分別倒入潔凈的100ml燒杯中，靜置2～3min，然后將各組斑馬魚依次投放入水，最后觀察斑馬魚在水中游泳的狀態(tài)，記錄魚的主要游泳行為改變及死亡情況。

1.2.2 檢測(cè)尼可剎米對(duì)小鼠的致驚厥作用：將用于實(shí)驗(yàn)的20只昆明小鼠被隨機(jī)分成對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組10只。小鼠被抓取固定后，腹部向上，腹部皮膚經(jīng)75%酒精消毒后，用1ml注射器進(jìn)行腹腔注射。實(shí)驗(yàn)組的小鼠注射300mg/kg尼可剎米；對(duì)照組的小鼠腹腔注射等體積的無菌生理鹽水。觀察尼可剎米對(duì)小鼠的作用，觀察時(shí)間為10min，記錄小鼠的反應(yīng)、興奮驚厥發(fā)生時(shí)間和死亡時(shí)間。

2 結(jié)果

2.1 尼可剎米導(dǎo)致斑馬魚興奮驚厥 將斑馬魚投入含有不同濃度尼可剎米的水中，觀察斑馬魚游泳行為的改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，溶于水中的尼可剎米可以引起斑馬魚不同程度的興奮。與對(duì)照組相比，低劑量組(1.0mg/ml)，斑馬魚表現(xiàn)為輕度興奮狀態(tài)，僅出現(xiàn)游泳速度加快，偶爾有頭部撞擊燒杯壁，擺尾幅度加大，除一條斑馬魚出現(xiàn)側(cè)翻和死亡外，其余的斑馬魚均能存活。高劑量(3.75mg/ml)尼可剎米處理組的斑馬魚，與對(duì)照組相比，則表現(xiàn)極強(qiáng)的興奮作用(見表1和圖1)。在高濃度的尼克剎米作用下，斑馬魚最初表現(xiàn)為快速游動(dòng)，頭部連續(xù)撞擊燒杯壁，身體扭曲，劇烈擺尾、躥跳等表現(xiàn)，幾分鐘后出現(xiàn)身體側(cè)翻，打轉(zhuǎn)、腹部向上飄浮，隨后出現(xiàn)游動(dòng)弛緩。飄浮一段時(shí)間后，斑馬魚可重復(fù)出現(xiàn)持續(xù)2～3s快速游動(dòng)后，又迅速發(fā)生身體側(cè)翻、腹部向上的懸浮漂游狀態(tài)，最后呼吸停止，死亡。

表1 尼克剎米對(duì)斑馬魚游泳行為的影響(n=10)

圖1 尼可剎米引起斑馬魚興奮驚厥

1：斑馬魚興奮：斑馬魚游泳速度加快、頭部撞擊燒杯壁、擺尾幅度增加(a)，繼而變?yōu)樯舷聛y竄、極度興奮(b)；2：游動(dòng)弛緩：斑馬魚由極度興奮狀態(tài)轉(zhuǎn)為游動(dòng)弛緩，游泳速度變慢、身體側(cè)翻、腹部向上，呼吸急促(c)；3：死亡：斑馬魚重復(fù)幾次短暫快速游動(dòng)、側(cè)翻飄浮后、呼吸停止，死亡(d)

2.2 尼可剎米誘導(dǎo)小鼠驚厥反應(yīng) 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠分別經(jīng)腹腔注射生理鹽水或致驚厥量的尼可剎米后，對(duì)照組小鼠表現(xiàn)為正常活動(dòng)，無異常表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)組小鼠在注射尼可剎米約0.5min出現(xiàn)倒退、豎尾、轉(zhuǎn)圈等興奮表現(xiàn)，大約1min，小鼠表現(xiàn)為上躥下跳，全身劇烈抽搐、痙攣、肢體伸直、艱難貼壁走，部分小鼠出現(xiàn)口吐鮮血、隨后倒地、呼吸困難、大小便失禁。大部分小鼠在6.5min左右死亡(見表2)，僅有1只小鼠存活時(shí)間超過10min，然后死亡。

表2 尼克剎米對(duì)小鼠的致驚厥作用(n=10)

3 討論

醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)的開展推動(dòng)著醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，對(duì)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)科學(xué)的建立和發(fā)展起決定性作用。醫(yī)學(xué)機(jī)能實(shí)驗(yàn)學(xué)是通過融合生理學(xué)、病理生理學(xué)、藥理學(xué)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法，研究生物體的正常生理機(jī)能、疾病的發(fā)病機(jī)制和藥物相互作用規(guī)律的一門科學(xué)。它是醫(yī)學(xué)生對(duì)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)理論知識(shí)掌握和理解的主要途徑，是促進(jìn)理論與實(shí)踐相結(jié)合，培養(yǎng)合格醫(yī)學(xué)生的基礎(chǔ)。在醫(yī)學(xué)機(jī)能學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中，大部分實(shí)驗(yàn)包括部分在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，離體器官、組織功能研究，電生理實(shí)驗(yàn)和病理模型的制備等方面的教學(xué)是通過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來完成。它是將抽象的理論形象化、具體化和客觀化，幫助學(xué)生對(duì)所學(xué)基礎(chǔ)理論知識(shí)的進(jìn)一步理解和鞏固；在驗(yàn)證經(jīng)典理論的同時(shí)，為學(xué)生提供開發(fā)創(chuàng)新性思維的空間和平臺(tái)。因此，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)科學(xué)合理、操作簡便、實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠和實(shí)驗(yàn)的趣味性等因素均影響實(shí)驗(yàn)教學(xué)的質(zhì)量。為了提高教學(xué)質(zhì)量，盡管在教學(xué)方法上不斷改進(jìn)，例如不同的新教學(xué)方法包括基于問題的學(xué)習(xí)(Problem-based learning，PBL)教學(xué)方法[8]和對(duì)通過內(nèi)在動(dòng)機(jī)和學(xué)習(xí)注意力優(yōu)化績效(Optimizing Performance Through Intrinsic Motivation and Attention for Learning, OPTIMAL)理論[9]的研究已被應(yīng)用于醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，在一定程度上提高了醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的教學(xué)質(zhì)量，但是，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的不可或缺的部分，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇對(duì)高質(zhì)量完成醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)具有重要的意義。因此，選擇合適的模式生物也是醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的重要研究內(nèi)容之一。

斑馬魚是一種與人類基因相似度達(dá)87%的模式生物。它屬于脊椎動(dòng)物，與其他脊椎動(dòng)物(如小鼠、大鼠) 相比，斑馬魚具有體積小、價(jià)格低廉、易飼養(yǎng)、對(duì)水質(zhì)和環(huán)境的要求不高、繁殖及生長速度快、生命周期短、實(shí)驗(yàn)費(fèi)用低、操作簡單、對(duì)操作者無潛在的攻擊危險(xiǎn)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。它已成為醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)研究領(lǐng)域的一種重要模式生物[10-12]。因?yàn)榘唏R魚對(duì)水環(huán)境的變化反應(yīng)十分敏感，當(dāng)水中的藥物或毒物達(dá)到一定濃度時(shí)，斑馬魚就會(huì)產(chǎn)生一系列反應(yīng),包括魚的行為改變、生理功能異常、組織細(xì)胞變性直至死亡，所以在古代，魚類毒性試驗(yàn)是常用作檢測(cè)水體污染的有效方法之一。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，斑馬魚已被廣泛用于水源、空氣、食品和環(huán)境等毒理的研究中[13]。中國對(duì)斑馬魚的研究始于20世紀(jì)90年代，真正被世界認(rèn)可的是21世紀(jì)后的研究成果[14]，包括在胚胎發(fā)育、造血系統(tǒng)及相關(guān)疾病的調(diào)控及其他系統(tǒng)疾病和生態(tài)毒理學(xué)方面的研究推動(dòng)了中國現(xiàn)代科技的進(jìn)步[15-16]。

在高校醫(yī)學(xué)機(jī)能學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中，藥物毒性測(cè)定是藥理學(xué)必修實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。該實(shí)驗(yàn)多選用的哺乳動(dòng)物包括小鼠、大鼠、家兔等，但是這些哺乳類動(dòng)物存在實(shí)驗(yàn)周期長、用藥劑量大、飼養(yǎng)成本及費(fèi)用高、操作復(fù)雜和潛在動(dòng)物攻擊危險(xiǎn)等問題及動(dòng)物福利的實(shí)施和倫理學(xué)沖突等現(xiàn)實(shí)矛盾。因此，在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，有必要尋找一種像斑馬魚這樣成本低廉、操作簡單、測(cè)試周期較短、重復(fù)性好的模式生物來代替?zhèn)鹘y(tǒng)哺乳動(dòng)物，完成藥物毒性檢測(cè)和評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)。

尼可剎米是一種作用機(jī)理明確的臨床常用呼吸興奮劑，劑量過大可導(dǎo)致驚厥。本研究中，分別測(cè)定斑馬魚對(duì)不同濃度尼可剎米的反應(yīng)，并與驚厥量的尼可剎米導(dǎo)致小鼠驚厥反應(yīng)的結(jié)果比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明尼可剎米溶于水中可改變斑馬魚的游泳行為，引起斑馬魚的興奮驚厥；此種驚厥反應(yīng)與高劑量的尼可剎米導(dǎo)致小鼠驚厥反應(yīng)基本相似。這些研究結(jié)果證明斑馬魚已經(jīng)具備成為醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基本條件。將來在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，有替代哺乳類動(dòng)物完成教學(xué)實(shí)驗(yàn)的可行性。斑馬魚在教學(xué)中的應(yīng)用，除了用于驗(yàn)證經(jīng)典的醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，加深學(xué)生對(duì)醫(yī)學(xué)知識(shí)理論的理解外，它還可推廣到綜合性實(shí)驗(yàn)和創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)層次，例如斑馬魚體積小，易攜帶，為研發(fā)便攜式毒性檢測(cè)裝置奠定了基礎(chǔ)?？傊?，在未來醫(yī)學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中，斑馬魚模式生物的應(yīng)用將增加基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)課的趣味性，防止學(xué)生面對(duì)哺乳動(dòng)物時(shí)恐懼心理的產(chǎn)生，激發(fā)其學(xué)習(xí)興趣和熱情，提高教學(xué)質(zhì)量，適合用于醫(yī)學(xué)生部分醫(yī)學(xué)機(jī)能實(shí)驗(yàn)課程的開發(fā)和推廣，為實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革提供了新思路。