miR-34a/SIRT1通路在七氟醚麻醉致老年大鼠神經(jīng)損傷中的作用

李洪影 祁向雯 毛珊珊 龐紅利

河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)科，河南省開封市 475000

七氟醚是臨床常用的主要吸入性麻醉藥之一，具有脂溶性溶解度低、對氣道損傷微弱、麻醉后蘇醒快等特點，因此被臨床廣泛使用。但有研究顯示，七氟醚可對大腦海馬組織產(chǎn)生一定毒性，導(dǎo)致神經(jīng)損傷，引起學(xué)習(xí)及認(rèn)知功能障礙[1]。但其相關(guān)作用機(jī)制尚未明確。miRNA是一種小的非編碼RNA，通過與靶基因結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，參與機(jī)體多種生理病理過程。miRNA-34a是一種廣泛存在多種真核細(xì)胞的miRNA，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，如腫瘤等[2]。研究顯示，miRNA-34a在哺乳動物大腦組織中高度表達(dá)，與神經(jīng)發(fā)育及其病理改變有關(guān)[3]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Silent information regulator 1，SIRT1)是一種多功能蛋白，可參與細(xì)胞凋亡、衰老以及腫瘤等生物學(xué)過程[4]，研究指出其在神經(jīng)保護(hù)方面起到關(guān)鍵作用[5]。且現(xiàn)研究已證實SIRT1是miRNA-34a重要靶基因之一，miRNA-34a可通過下調(diào)SIRT1水平參與大腦神經(jīng)功能損傷過程等[6]。生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫Starbase (https://starbase.sysu.edu.cn/index.php)分析結(jié)果顯示，miRNA-34a與SIRT1的3’UTR端存在結(jié)合位點，明確提示二者之間存在靶向關(guān)系。但miRNA-34a/SIRT1通路在七氟醚所致神經(jīng)損傷中的作用目前鮮有報道，因此，本研究通過構(gòu)建七氟醚麻醉大鼠模型，探討miRNA-34a/SIRT1通路對神經(jīng)損傷的影響。

1 資料與方法

1.1 主要藥品與試劑 吸入性七氟醚(上海恒瑞醫(yī)藥有限公司，規(guī)格120ml，國藥準(zhǔn)字號：H20173007)、miR-34a抑制劑(antagomiR)、miR-34a 抑制劑陰性對照(廣州銳博生物科技有限公司)；SIRT1(ab189494)、p53(ab183544)；caspase-3(ab184787)，Bax(ab32503)，Bcl-2(ab182858)一抗(英國Abcam)，山羊抗兔二抗(武漢三鷹)。

1.2 動物分組及藥物處理 24只健康老年(20月齡)雄性SD大鼠[上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號(滬)2017-0008]，體重 500～600g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為對照組、模型組、antagomiR組、antagomiR-NC組，每組6只；造模前，antagomiR組、antagomiR-NC組分別尾靜脈注射20μmol/L的miR-34a antagomiR或miR-34a antagomiR-NC，注射體積為5ml/kg；對照組和模型組則注射等體積的生理鹽水，連續(xù)注射5d后開始造模。本研究已經(jīng)河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.3 神經(jīng)損傷大鼠模型建立 除對照組外其余大鼠均建立七氟醚麻醉神經(jīng)損傷大鼠模型：麻醉誘導(dǎo)箱為透明鋼化玻璃材質(zhì)，箱底鋪少量鈉石灰，上蓋以無菌單，用于吸收大鼠呼出的CO2及水蒸氣；箱體兩側(cè)分別接麻醉機(jī)進(jìn)氣、出氣端及氣體監(jiān)測儀，箱內(nèi)氧流量3L/min，調(diào)節(jié)七氟醚揮發(fā)罐，使麻醉誘導(dǎo)箱七氟醚濃度達(dá)3.0%后，將大鼠置入，3h之后改為純氧吸入15min。待大鼠清醒后送回籠中。對照組大鼠置于麻醉箱內(nèi)吸入氧流量3L/min的純氧3h15min后，送回籠中。

1.4 大鼠認(rèn)知功能評定 造模完成后24h，采用Morris水迷宮測定動物認(rèn)知記憶功能。所有大鼠置于水迷宮內(nèi)行適應(yīng)性訓(xùn)練3d，4次/d；于第4天進(jìn)行定位巡航實驗：將大鼠分別從4個象限的池壁中點入水，記錄其自下水至爬上平臺所需時間，取4個象限的均值為大鼠的逃避潛伏期；若90s內(nèi)大鼠未登上平臺，則將其引導(dǎo)至平臺休息10s，記其逃避潛伏期為90s；空間探索實驗：于定位巡航結(jié)束后撤出平臺，將大鼠分別由4個象限的原入水點面向池壁入水，分別記錄4個象限90s內(nèi)大鼠穿越平臺所在位置的次數(shù)，計算其均值即穿越平臺次數(shù)。

1.5 qRT-PCR法檢測海馬組織miR-34a、SIRT1表達(dá)水平 各組大鼠水迷宮實驗結(jié)束后麻醉處死，斷頭冰上取大腦海馬組織。按照Trizol 試劑盒操作說明提取各組大鼠腦組織總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用RT-qPCR熒光定量試劑盒行檢測miR-34a、SIRT1基因的mRNA表達(dá)水平，PCR反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性10min，95℃ 30s、60℃ 45s、72℃ 30s，40個循環(huán)。以 U6為miR-34a內(nèi)參基因，以GAPDH為SIRT1的內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT法計算miR-34a、SIRT1 mRNA的相對表達(dá)量。引物列表見表1。

表1 引物列表

1.6 Western blot檢測海馬組織中相關(guān)蛋白表達(dá) 取各組大鼠適量海馬組織，研磨，RIPA裂解液充分裂解， 4℃ 12 000r/min 離心15min，收集上清，BCA法測定蛋白濃度，取定量后的蛋白液進(jìn)行SDS-PAGE轉(zhuǎn)膜，封閉，加入SIRT1(1∶1 000)、P53(1∶1 000)、caspase-3、Bax、Bcl-2(均1∶2 000)一抗4℃孵育過夜，而后加入二抗(1∶5 000)室溫避光孵育2h，ECL顯色液進(jìn)行顯影。采用Image J軟件分析條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參計算各組蛋白相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 大鼠學(xué)習(xí)記憶功能 與對照組相比，模型組大鼠的逃避潛伏期明顯增加(P<0.05)，穿越平臺次數(shù)顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，antagomiR-NC組的逃避潛伏期及穿越平臺次數(shù)均無明顯改變(P>0.05)，而antagomiR組的逃避潛伏期明顯降低(P<0.05)，穿越平臺次數(shù)明顯增加(P<0.05)，見表2。

表2 大鼠學(xué)習(xí)記憶功能比較

2.2 大鼠海馬組織中miR-34a、SIRT1 mRNA的表達(dá)水平 與對照組相比，模型組大鼠海馬組織中miR-34a mRNA水平明顯升高(P<0.05)，SIRT1 mRNA水平明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，antagomiR-NC組的miR-34a、SIRT1 mRNA均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，而antagomiR組的miR-34a mRNA水平顯著降低(P<0.05)，SIRT1 mRNA水平顯著升高(P<0.05)，見圖1。

圖1 各組大鼠海馬組織中miR-34a、SIRT1 mRNA水平比較

2.3 大鼠海馬組織中SIRT1、p53蛋白表達(dá)水平 與對照組相比，模型組大鼠海馬組織中SIRT1蛋白水平明顯降低(P<0.05)，p53蛋白水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，antagomiR-NC組的SIRT1、p53蛋白水平均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，而antagomiR組的SIRT1蛋白水平顯著升高(P<0.05)，p53蛋白水平顯著降低(P<0.05)，見圖2。

圖2 各組大鼠海馬組織中SIRT1及p53蛋白水平比較

2.4 大鼠海馬組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 與對照組相比，模型組大鼠海馬組織中凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、Bax表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，antagomiR-NC組的caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)水平均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，而antagomiR組的caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平顯著增加(P<0.05)，見圖3。

圖3 各組大鼠海馬組織中凋亡相關(guān)蛋白水平比較

3 討論

七氟醚作為近年來廣泛使用的吸入性麻醉劑，與其他吸入麻醉劑相比，具有血流動力學(xué)穩(wěn)定、術(shù)后蘇醒快等優(yōu)勢[7]。但諸多研究表明七氟醚麻醉可致大腦形態(tài)學(xué)及功能的改變，進(jìn)而引起認(rèn)知障礙。既往研究證實使用3%濃度的七氟醚麻醉大鼠，可使其海馬神經(jīng)元凋亡，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙[8]，但七氟醚作用的相關(guān)機(jī)理目前尚不明確。研究表明，在胚胎發(fā)育期，腦組織伴有miR-34a、miR-126等多種miRNA的表達(dá)，說明miRNAs在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中具有重要作用。miR-34a作為高度保守的miRNA，有文獻(xiàn)指出[9]miR-34a可通過調(diào)節(jié)基因與蛋白水平，進(jìn)而參與神經(jīng)細(xì)胞的增殖及分化，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理進(jìn)程中起到重要的調(diào)控作用。研究已顯示[10-11]miR-34a與腦卒中、麻醉術(shù)后等神經(jīng)損傷的表達(dá)增加相關(guān)。SIRT1屬于一種依賴NAD+組蛋白去乙酰化酶，具有延緩細(xì)胞衰老等作用。諸多研究已表明SIRT1是miR-34a的主要靶基因之一，其表達(dá)水平與多種疾病密切有關(guān)。王艷雪[12]發(fā)現(xiàn)SIRT1是重要的神經(jīng)保護(hù)因子，在腦海馬組織內(nèi)豐富表達(dá)，主要通過抗氧化應(yīng)激損傷、減少細(xì)胞凋亡而發(fā)揮作用。既往研究顯示miR-34a可通過靶向下調(diào)SIRT1表達(dá)，促進(jìn)下游基因，如p53、NRF2等乙?；せ?，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，參與疾病的發(fā)生[13-14]。

此外，通過組蛋白的乙酰化調(diào)節(jié)基因的表達(dá)是大腦認(rèn)知的重要部分。p53是SIRT1發(fā)揮作用的關(guān)鍵下游分子，正常情況下，p53屬于無活性狀態(tài)，而當(dāng)細(xì)胞遭受應(yīng)激損傷時，使其發(fā)生乙?；せ?，進(jìn)一步調(diào)控下游多種基因的轉(zhuǎn)錄，如Bax、caspase-3等，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致神經(jīng)損傷等[15]；另研究顯示p53也可正反饋上調(diào)miR-34a，而miR-34a過表達(dá)將抑制其下游靶基因SIRT1表達(dá)，使P53表達(dá)更高，加促細(xì)胞的凋亡[16]。Bax、caspase-3均屬于凋亡相關(guān)基因，海馬組織中caspase-3、Bax 等基因的激活與表達(dá)，可導(dǎo)致腦神經(jīng)損傷，引起學(xué)習(xí)及記憶障礙[17]。Morris水迷宮測試是一種用于評估嚙齒類動物海馬依賴性空間學(xué)習(xí)及記憶能力的行為學(xué)手段，可良好的量化記憶指標(biāo)，是目前公認(rèn)準(zhǔn)確可靠的測量方法，能有效反映動物認(rèn)知能力[18]。為了探究miR-34a/SIRT1通路與七氟醚麻醉致老年大鼠神經(jīng)損傷的關(guān)系，現(xiàn)通過構(gòu)建七氟醚麻醉大鼠模型進(jìn)行研究，其結(jié)果顯示，模型組大鼠的逃避潛伏期、miR-34a、p53、caspase-3、Bax水平均顯著高于對照組，而穿越平臺次數(shù)、Bcl-2及SIRT1水平均顯著降低。以上結(jié)果說明miR-34a/SIRT1通路與七氟醚麻醉致老年大鼠神經(jīng)損傷的發(fā)生有關(guān)。

另外，研究顯示，上調(diào)腫瘤細(xì)胞中miR-34a的表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的生長[19]；而下調(diào)miR-34a可對神經(jīng)元細(xì)胞等具有保護(hù)作用，減少其氧化應(yīng)激損傷[20]。既往研究表明SIRT1蛋白可發(fā)揮去乙酰化作用，抑制下游分子如p53等乙?；档?，起到抗應(yīng)激及細(xì)胞凋亡，進(jìn)而起到神經(jīng)保護(hù)等作用[21]。吳舒懋等[22]顯示上調(diào)miR-34a表達(dá)可顯著降低SIRT蛋白表達(dá)，進(jìn)一步加重大鼠的肺組織損傷及肺功能，而通過下調(diào)miR-34a表達(dá)，可顯著上調(diào)SIRT蛋白表達(dá)，降低肺部炎癥反應(yīng)，改善肺功能。趙晨璐等[23]顯示通過上調(diào)miR-34a的表達(dá)可抑制經(jīng)氯胺酮干預(yù)的海馬神經(jīng)元中 Wnt/β-catenin 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)，促進(jìn)海馬神經(jīng)元的凋亡基因表達(dá)，導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)及記憶障礙；而抑制miR-34a表達(dá)則可上調(diào)該通路蛋白表達(dá)，抑制神經(jīng)元凋亡，進(jìn)而改善大鼠學(xué)習(xí)及記憶功能。為了進(jìn)一步探究miR-34a/SIRT1通路在七氟醚麻醉致老年大鼠神經(jīng)損傷的分子機(jī)制，現(xiàn)使用miR-34a antagomiR干預(yù)模型組大鼠，其結(jié)果顯示，與模型組相比，antagomiR組大鼠的逃避潛伏期、miR-34a、p53、caspase-3、Bax水平均明顯降低，穿越平臺次數(shù)與穿越平臺次數(shù)、Bcl-2與SIRT1水平則明顯增加。以上結(jié)果說明抑制miR-34a表達(dá)可上調(diào)SIRT1水平，抑制七氟醚麻醉致大鼠海馬組織中細(xì)胞凋亡，改善其認(rèn)知功能，提示miR-34a/SIRT1通路參與七氟醚麻醉致老年大鼠神經(jīng)損傷的相關(guān)機(jī)制可能與通過調(diào)控SIRT1表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，miR-34a/SIRT1通路與七氟醚麻醉致老年大鼠神經(jīng)損傷的發(fā)生有關(guān)，上調(diào)SIRT1表達(dá)，可改善大鼠神經(jīng)組織損傷，改善其認(rèn)知功能，其機(jī)制可能與靶向調(diào)控SIRT1表達(dá)有關(guān)。