突變EGFR PROTAC降解劑的設計與合成及活性研究

劉婷梅，楊 瑜，王 欣，李文鎮(zhèn)，張義文

四川大學華西醫(yī)院 腫瘤中心（成都 610041）

近年來，癌癥的死亡率逐年上升，肺癌所占的比例更是居高不下[1-4]。其中，非小細胞肺癌是一種與表皮生長因子受體基因（EGFR）密切相關(guān)的典型惡性腫瘤，嚴重危害著人類的健康[5-6]。EGFR是一種受體酪氨酸激酶（RTK）[7]，由氨基末端胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成[8-9]，在多種腫瘤組織中表達，并通過與表皮生長因子等配體的結(jié)合來抑制腫瘤細胞凋亡。EGFR 酪氨酸激酶抑制劑的出現(xiàn)為肺癌病人帶來了曙光，可是一代又一代的上市藥物在治療一段時間后都出現(xiàn)了耐藥性[10-12]。

癌細胞可以輔助其它現(xiàn)有的RTK 信號通路，使受抑制的RTK繼續(xù)作為一個節(jié)點存在從而恢復下游的致癌信號，因此直接把RTK 降解而不是對激酶活性的抑制，可能是一種會產(chǎn)生更持久、完整的下游信號失活的策略[13]，同時也直接避免了基因突變導致的耐藥。近幾年，PROTAC 憑借其可降解“不可成藥”的靶點而備受關(guān)注。其利用雙功能化合物與靶蛋白和E3 泛素連接酶形成三元復合物[14-15]，能將靶蛋白泛素化標記并降解，理論上能完美的避開基因突變而導致的耐藥性問題，并且還具備適用范圍廣、選擇性高、劑量小和毒副作用小等優(yōu)點，是靶向治療領域中一個很有前景的方向[16-18]。本研究選擇了目前處于臨床I 期的對EGFR19del以及EGFRL858R均有效的藥物AZD-3759 作為靶蛋白配體[18]，E3泛素連接酶則選擇了VHL這個已被報道適用于PROTAC 的配體，設計合成了7 個化合物，并評價了其活性。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

CCK8（Sigma），E746-A750del抗體（CST），周期檢測試劑盒（BD Phamingen RPMI），PIPA 裂解液（上海雅酶生物科技有限公司），BSA（Solarbio），超敏化學發(fā)光液（CST）；其他試劑均為市場售分析純。

1.2 主要儀器

Bruker-AMX 400 核磁共振儀（德國布洛克公司），Agilent ESI-TOF 高分辨質(zhì)譜儀（美國麥克柔曼斯公司），瓊脂糖凝膠電泳儀（君意），酶標儀（Bio-Rad），流式細胞儀（艾森），高速離心機（Eppendorf），化學發(fā)光儀（上海勤翔）。

1.3 化合物合成

以對EGFR19del和EGFRL858R均有效的藥物AZD-3759 作為靶蛋白配體進行修飾，選擇靠近溶劑側(cè)的哌嗪環(huán)的氮連接linker，E3 泛素連接酶配體選擇VHL；linker主要是不同長度的PEG鏈或不同長度的直碳鏈，設計合成7個化合物，具體合成路線見圖1、圖2。

圖1 VHL的合成試劑和條件Figure 1 Synthetic reagents and conditions for VHL

圖2 EGFR19del突變型PROTAC化合物的合成試劑及條件Figure 2 Reagents and conditions for the synthesis of EGFR19del mutant PROTAC compounds

1.4 藥理實驗方法

1.4.1 CCK8 抗腫瘤細胞增殖實驗 將對數(shù)生長的細胞接種到96孔板，每孔約3 000個，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。將待測化合物按一定濃度梯度分別加入96孔板，每個濃度3 個復孔，設置3 個DMSO 對照組以及3 個只接種細胞的完全空白對照。在化合物對細胞作用96 h后每孔加入15 μL CCK-8 試劑，孵箱內(nèi)避光1.25 h 后測定450 nm 下的OD值。最后用GraphPad Prism8 擬合IC50值[19]。

1.4.2 Western blot蛋白降解實驗

1.4.2.1 蛋白樣品的制備 細胞接種于6 孔板，每孔約50萬細胞，培養(yǎng)24 h待細胞貼壁。棄去原培養(yǎng)基，將其換為無血清培養(yǎng)基8 h 后加入相應化合物。作用24 h后拿出培養(yǎng)板，先將帶細胞的培養(yǎng)基吸到BD 管，各加入500 μL胰酶，放入孵箱10 min，離心（3 000 r，3 min），離心后倒掉液體，加入1 mL PBS，并將離心成團的細胞輕輕吹起，轉(zhuǎn)移到EP 管再離心，進行兩次。洗滌后的細胞加入裂解液和1%蛋白酶抑制劑（300+3 μL），裂解5 min吹打細胞，到10 min結(jié)束，然后4 ℃離心（15 000 r，10 min）。蛋白定量。取40 μL 蛋白上清，加入10 μL SDS-PAGE 上樣緩沖液，煮沸10 min，放-20 ℃?zhèn)溆谩８鶕?jù)得到的蛋白濃度及10 μg 上樣量計算所需上樣體積。

1.4.2.2 SDS-PAGE 凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜 將電泳后的膠取出，根據(jù)目標條帶和內(nèi)參位置切下所需要的部分，小心轉(zhuǎn)移到鋪好4 層濾紙的負極三明治模具上，趕走氣泡。剪下PVDF 膜做好標記，用甲醇浸泡15 s，然后放至轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡然后放到膠上，趕走氣泡，再鋪上4 層濾紙。裝配好轉(zhuǎn)膜三明治放進電泳槽，轉(zhuǎn)膜電壓設置為100 V，內(nèi)參和目的蛋白分別轉(zhuǎn)1 h 和2 h。然后在5 %脫脂牛奶的TBST 緩沖液中室溫封閉1 h。

1.4.2.3 免疫雜交染色 用TBST 洗滌封閉好的PVDF膜3次，每次約5 min。加入一抗并用雜交膜封閉，4 ℃震蕩孵育過夜后用TBST 洗滌封閉好的PVDF 膜3 次，每次10 min。按說明書配置二抗，雜交袋中室溫孵育30 min再轉(zhuǎn)到37 ℃震蕩30 min，繼續(xù)用TBST洗滌3次，TBS洗滌1次。最后配置顯影液，顯影曝光拍照[20-21]。

1.4.3 流式實驗探究PROTAC分子抗增殖機理 細胞處理：培養(yǎng)PC-9細胞，細胞用胰酶消化10 min，終止消化，離心重懸計數(shù)，鋪到6 孔板。用不同濃度化合物（0、0.01、0.1、0.5、1 μM）處理細胞。檢測：將化合物作用32 h后的細胞離心，PBS洗滌，加入預冷的70%乙醇4°C過夜。將周期檢測試劑盒中的RnaseA 和PI按1:9配置，現(xiàn)配現(xiàn)用細胞離心并用PBS洗滌，加入500 μL配置好的染液，上機檢測[22]。

2 結(jié)果

2.1 目標化合物的制備

通過上述反應路線，制備了7個目標化合物，分別是AZDV-P1、AZDV-P2、AZDV-P3、AZDV-5、AZDV-7、AZDV-9 和AZDV-10，目標化合物均用核磁和質(zhì)譜等波譜手段進行表征。

2.2 化合物對腫瘤細胞的抗增殖活性

用CCK-8檢測目標化合物對PC-9、H1975和A549等3 種腫瘤細胞的半數(shù)抑制濃度（IC50），AZD-3759 作為陽性對照，實驗結(jié)果如表1所示。

表1 AZDV系列化合物對不同腫瘤細胞的抗增殖活性（n=3，IC50±SD）Table 1 Antiproliferative activity of AZDV series compounds on different tumor cells（n=3，IC50±SD）

2.3 化合物引起蛋白降解

為了探究上述抗增殖活性較好的3 個PROTAC 化合物（AZDV-P1、AZDV-9 和AZDV-10）以及陽性對照化合物是否有引起EGFR蛋白降解的效果，從8～5 000 nM 設置了6 個濃度，用Western Blot 對其進行驗證，實驗結(jié)果如圖3A 所示。為了確認PROTAC 化合物是否表現(xiàn)出“勾效應”，對效果較好的兩個化合物（AZDV-P1和AZDV-10）從0.01～5 000 nM 設計了9 個濃度，實驗結(jié)果如圖3B所示。

圖3 不同濃度化合物處理后EGFR19del蛋白的表達情況Figure 3 Expression of EGFR19del protein after treatment with different concentrations of compounds

2.4 化合物作用機理探究

為了探究化合物發(fā)揮作用機理并結(jié)合前人所做研究中PROTAC 化合物的作用機理，用細胞流式儀進行了化合物AZDV-9和AZDV-P1阻滯細胞周期的探究，實驗結(jié)果如圖4、圖5所示。

圖4 AZDV-9對細胞周期的影響Figure 4 Effects of AZDV-9 on the cell cycle

圖5 AZDV-P1對細胞周期的影響Figure 5 Effects of AZDV-P1 on the cell cycle

3 討論

從表1 可以看出，AZDV 系列化合物對PC-9 細胞（EGFR19del）的IC50值均小于1 μM，其中AZDV-9 和AZDV-P1的IC50值在10 nM左右，AZDV-10為81.1 nM，均高于AZD-3759 的IC50值（5.6 nM）。為進一步了解AZDV系列化合物的選擇性，檢測了其對雙突變細胞系H1975（EGFRT790M/L858R）以及野生型A549（EGFRwt）的抑制效果，發(fā)現(xiàn)效果遠不如PC-9 細胞，10 μM 以內(nèi)僅個別化合物抑制率達到50%，也說明該系列化合物選擇性較好。

從圖3A可以看出化合物AZD-3759和AZDV-9幾乎沒有降解效果，而化合物AZDV-P1 和AZDV-10 均能導致靶蛋白降解，但是在低濃度下降解效果較好，增加濃度效果反而減弱。對于兩個沒有蛋白降解的化合物，AZD-3759 不是PROTAC 化合物，本身是通過與ATP競爭結(jié)合EGFR阻斷下游通路發(fā)揮作用，所以不會引起蛋白降解；對于AZDV-9推測它的IC50較低主要是抑制劑本身發(fā)揮作用（而不是PROTAC 效應的結(jié)果）。AZDV-P1和AZDV-10均能引起蛋白降解，且能觀測到勾效應。總之，通過蛋白降解實驗對PROTAC 化合物進行驗證，表明AZDV-P1 和AZDV-10 均能引起蛋白降解，并且觀測到了勾效應。

從圖4、圖5 可以看出，AZDV-P1 有效且也能觀測到勾效應，能將周期阻滯在G1 期。AZDV-9 效果不太明顯，這方面跟WB 結(jié)果比較吻合，說明AZDV-9 發(fā)揮作用的方式可能不是PROTAC效應。

4 結(jié)論與啟示

19 號外顯子突變中最常見的就是746～750 位密碼子缺失，約占EGFR總的突變類型的40%～50%[23]，并且作為一線治療首選的上市一代和二代藥對19 號外顯子突變病人效果顯著，美中不足的是很快就發(fā)生耐藥性[24-25]。本研究設計并合成一系列靶向EGFR的PROTAC 化合物，對化合物的抗腫瘤活性和機制進行了探究，結(jié)果顯示AZDV-P1 和AZDV-10 均能引起蛋白降解，并觀測到了勾效應。這一研究結(jié)果或能為克服EGFR耐藥提供一個新的方向。

（利益沖突無）