啟動(dòng)模式對(duì)水稻秸稈厭氧發(fā)酵穩(wěn)定性及產(chǎn)氣效率的影響

凡 慧，馬詩(shī)淳,4*，李 強(qiáng),4，黃 艷，王春芳，鄧 宇,4

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部沼氣科學(xué)研究所，四川 成都 610041；2.農(nóng)村可再生能源開發(fā)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610000；3.國(guó)家農(nóng)業(yè)微生物雙流觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，四川 成都 610000；4.三亞中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院國(guó)家南繁研究院，海南 三亞 572024)

秸稈富含纖維素、半纖維素等有機(jī)成分，是生產(chǎn)清潔生物能源的重要基質(zhì)[1-3]。我國(guó)秸稈年產(chǎn)量8億噸左右，全部利用可減排9億余噸CO2。加快推進(jìn)秸稈的能源化利用，將有效支撐農(nóng)業(yè)減排固碳，助力我國(guó)2030年實(shí)現(xiàn)“雙碳”目標(biāo)。厭氧消化是秸稈能源化利用的重要途徑之一。但是，由于秸稈結(jié)構(gòu)復(fù)雜、生物轉(zhuǎn)化率低、碳氮比高等[4-5]，導(dǎo)致厭氧發(fā)酵過(guò)程不穩(wěn)定、易酸化，從而限制了其在沼氣發(fā)酵中的大規(guī)模應(yīng)用[6-8]。

目前，秸稈厭氧發(fā)酵主要采用濕式厭氧發(fā)酵工藝和干發(fā)酵工藝[9]。濕式發(fā)酵通常以較低的負(fù)荷運(yùn)行(<8% TS)，以避免纖維和脂肪等分層、形成浮渣，但嚴(yán)重影響沼氣產(chǎn)量[10-11]。秸稈厭氧干發(fā)酵可通過(guò)提高發(fā)酵負(fù)荷(>15% TS)提升沼氣產(chǎn)量，但是啟動(dòng)周期長(zhǎng)，并且由于傳質(zhì)差、營(yíng)養(yǎng)不平衡、氨氮和揮發(fā)酸易積累，容易導(dǎo)致纖維素降解率低等問(wèn)題[12]。多項(xiàng)研究證實(shí)[13]，秸稈厭氧發(fā)酵過(guò)程中，TS含量的提高易造成揮發(fā)酸累積和pH值，破壞產(chǎn)酸和產(chǎn)甲烷代謝平衡，當(dāng)有機(jī)酸高達(dá)7000 mg·L-1時(shí)，產(chǎn)甲烷代謝將被抑制，從而導(dǎo)致系統(tǒng)崩潰。研究發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)階段，接種是影響秸稈厭氧消化過(guò)程的重要步驟[14]。增加接種率可提升甲烷產(chǎn)量，但當(dāng)?shù)孜?接種物比率(S/I)>4時(shí)，由于接種物中的微生物缺乏足夠的底物維持生長(zhǎng)代謝，從而導(dǎo)致厭氧消化效率將下降，甚至啟動(dòng)失敗。但是，接種率過(guò)高，不僅增加運(yùn)行成本，還將減少反應(yīng)器的有效容積和發(fā)酵原料，增強(qiáng)微生物之間的營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)，從而降低產(chǎn)氣量[15]。目前，高濃度物料發(fā)酵常采用沼液回流等模式進(jìn)行連續(xù)接種，提高活性微生物的數(shù)量，緩解揮發(fā)性脂肪酸積累，從而縮短啟動(dòng)周期、維持運(yùn)行的穩(wěn)定性、提高沼氣產(chǎn)量。但是，沼液回流模式容易造成氨氮積累，進(jìn)而抑制厭氧降解過(guò)程[16]。在適宜的接種率下，利用逐級(jí)提高進(jìn)料濃度的方式啟動(dòng)厭氧發(fā)酵，可增強(qiáng)厭氧消化菌群的代謝活性，從而提升其降解有機(jī)廢棄物的能力。目前已利用該模式成功地進(jìn)行了厭氧消化處理雞糞的啟動(dòng)，總固體含量(total solid, TS)去除率60%，甲烷體積分?jǐn)?shù)穩(wěn)定在(65±3)%左右，并避免了氨抑制的現(xiàn)象[17]。

本研究圍繞提升秸稈的轉(zhuǎn)化效率，維持秸稈厭氧發(fā)酵過(guò)程的穩(wěn)定性，在恒溫35℃條件下，以馴化的厭氧污泥為接種物，在不同原料濃度(5%，7%和9% TS)下，通過(guò)分析厭氧發(fā)酵過(guò)程中的揮發(fā)酸代謝、沼氣產(chǎn)率、木質(zhì)纖維素降解率以及微生物群落結(jié)構(gòu)等差異，評(píng)估了一步啟動(dòng)(OSS, one-step startup)和逐級(jí)提升啟動(dòng)(SIS, stepwise-increasing startup)模式對(duì)水稻秸稈厭氧中溫發(fā)酵性能的影響，以期為秸稈沼氣工程運(yùn)行提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原料及接種物

1.1.1 實(shí)驗(yàn)原料

實(shí)驗(yàn)中所采用的水稻秸稈取自成都雙流農(nóng)田，其成分主要包括纖維素(33.55%)、半纖維素(21.46%)、木質(zhì)素(17.38%)、灰分、蛋白質(zhì)和糖等，組成特征見表1。水稻秸稈使用前先烘干后粉碎，40目過(guò)篩。稱取1.00 g，55℃烘干至恒重，通過(guò)失重法計(jì)算秸稈含水率。

1.1.2 接種物

接種物為實(shí)驗(yàn)室利用豬糞秸稈混合原料長(zhǎng)期馴化的厭氧干發(fā)酵菌劑，接種物的理化特征見表1。

表1 底物和接種物理化性質(zhì)

1.1.3 培養(yǎng)基成分及配制方法

FSC培養(yǎng)基(g·L-1)：NaCl 5.0，CaCO32.0，尿素2.0，胰蛋白胨(BBL)2.0，酵母粉(YE)1.0，將上述試劑溶解于1 L自來(lái)水。配置時(shí)，先將秸稈粉加入1.0 L發(fā)酵瓶中，真空泵抽換氮?dú)?次，每次5 min，然后分裝0.5 L FSC培養(yǎng)基于厭氧瓶中。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)置

本實(shí)驗(yàn)設(shè)置為批次實(shí)驗(yàn)，分別采用一步啟動(dòng)(OSS, one-step startup)和逐級(jí)提升啟動(dòng)(SIS, stepwise-increasing startup)兩種模式啟動(dòng)秸稈厭氧發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，原料濃度分別選擇5%、7%和9% TS，累積設(shè)置6個(gè)實(shí)驗(yàn)組。以兩種不同模式啟動(dòng)厭氧發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。OSS組(OSS 5, OSS 7和OSS 9)以5%、7%和9% TS直接啟動(dòng)厭氧消化系統(tǒng)，SIS組(SIS 5，SIS 7和SIS 9)均先以2% TS啟動(dòng)厭氧消化系統(tǒng)，至系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行后將TS分別提高至5%、7%和9%。

采用1.0 L帶有取樣口和排氣口的發(fā)酵瓶，實(shí)際發(fā)酵體積為0.5 L，接種量為10%(w/v)。接種后放置于(35±1)℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d搖晃混勻1次并取樣監(jiān)測(cè)，直至沒(méi)有明顯產(chǎn)氣時(shí)停止實(shí)驗(yàn)。

1.3 理化指標(biāo)分析

采用標(biāo)準(zhǔn)方法分析總固體含量(total solids, TS)和總揮發(fā)性固體含量(volatile solids,VS)[18]。采用Vario Macro Cube元素分析儀分析C、H、N和S元素。采用排飽和鹽水集氣的方法測(cè)定沼氣產(chǎn)量。采用安捷倫7820A型氣相色譜儀測(cè)定甲烷含量[19]。將液體樣品于室溫下12000 rpm 離心10 min，經(jīng)0.22 um水相濾膜過(guò)濾，用Agilent 1200 Series液相色譜儀分析揮發(fā)性脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸)[20]。采用納氏試劑分光光度法測(cè)定氨氮[21]。采用范氏 洗滌纖維分析法測(cè)定中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)[22]。纖維素降解率用以下公式計(jì)算：

(半)纖維素降解率(%)=(降解前纖維素量-降解后纖維素量)/降解前纖維素量×100%

1.4 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

實(shí)驗(yàn)運(yùn)行至穩(wěn)定期，用無(wú)菌離心管從每個(gè)反應(yīng)體系中收集5 mL樣品，于4℃，12000 rpm離心10 min，用PBS緩沖液清洗2～3次，菌體儲(chǔ)存于-80℃冰箱保存用于DNA提取。采用TIANGEN細(xì)菌基因組提取試劑盒提取、純化基因組 DNA。

采用Illumina Miseq系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。采用FLASH、Trimmomatic軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接和優(yōu)化；使用Usearch 軟件進(jìn)行OTU聚類分析；基于得到的OTU-table，進(jìn)行后續(xù)的分類學(xué)分析、Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析以及組間差異分析。數(shù)據(jù)分析采用Qiime(Version 1.8 http://qiime.org/)平臺(tái)在線分析，根據(jù)不同的相似度水平，對(duì)所有序列進(jìn)行OTU劃分，對(duì)97%的相似水平下的OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析。采用RDP Classifier算法(http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/)對(duì)OTU代表序列進(jìn)行比對(duì)分析，在各個(gè)水平(kingdom，phylum，class，order，family，genus，species)注釋其群落的物種信息。并對(duì)樣品進(jìn)行了多樣性分析以及分類分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 啟動(dòng)模式對(duì)揮發(fā)性脂肪酸代謝的影響

在秸稈厭氧消化過(guò)程中，所有實(shí)驗(yàn)組的乙酸、丙酸、丁酸和總揮發(fā)性脂肪酸(VFAs)濃度變化趨勢(shì)幾乎一致(見圖1)。發(fā)酵前4 d為快速水解階段，有機(jī)物水解導(dǎo)致VFAs迅速累積。OSS實(shí)驗(yàn)組的VFAs濃度且伴隨TS提高而增加，發(fā)酵第4天達(dá)到最高值3072.0～6556.7 mg·L-1；SIS實(shí)驗(yàn)組以2% TS啟動(dòng)時(shí)和提高至目標(biāo)負(fù)荷階段均出現(xiàn)VFAs快速累積，最高累積濃度分別為1209.1～1412.1 mg-1(第4天)和(第22～24 天)110.4～730.2 mg-1，均不足OSS實(shí)驗(yàn)組的40.3%。同時(shí)，提升負(fù)荷階段VFAs濃度顯著低于初始啟動(dòng)階段，這可能與SIS實(shí)驗(yàn)組處于穩(wěn)定的VFAs降解狀態(tài)有關(guān)(見圖4)。

圖1 秸稈厭氧發(fā)酵過(guò)程中乙酸產(chǎn)量變化

圖2 秸稈厭氧發(fā)酵過(guò)程中丙酸產(chǎn)量變化

圖3 秸稈厭氧發(fā)酵過(guò)程中丁酸產(chǎn)量變化

注：揮發(fā)性脂肪酸包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸

乙酸和丙酸為水解階段的主要代謝產(chǎn)物，占揮發(fā)酸總量的60.5%以上(見圖5)。其中，前2天為乙酸型發(fā)酵，乙酸占VFAs的48.1%以上，乙酸/丙酸比率為2.4～3.9。第4天起，OSS實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)換為丙酸型發(fā)酵(乙酸/丙酸比率為0.6～0.9)，乙酸緩慢增加或快速降解，丙酸則迅速積累，分別是第2天的0.78～1.3倍和4.4～5.7倍；而SIS實(shí)驗(yàn)組在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中均為乙酸型發(fā)酵(乙酸/丙酸比率為1.5～2.7)，發(fā)酵第4天乙酸和丙酸均緩慢提高，是第2天的1.0～1.2倍和1.2～2.2倍。發(fā)酵第6天，OSS實(shí)驗(yàn)組進(jìn)入乙酸降解階段，2天內(nèi)乙酸降解率超過(guò)56.7%，丙酸降解率不足15.7%；而SIS實(shí)驗(yàn)組則以丙酸降解為主，2天內(nèi)丙酸降解率超過(guò)75.0%，乙酸降解率為33.2%～61.0%。乙酸和丙酸是有機(jī)物厭氧轉(zhuǎn)化過(guò)程中的重要中間產(chǎn)物。由于乙酸可以直接被產(chǎn)甲烷菌利用，而丙酸的電離常數(shù)大，并且轉(zhuǎn)化為甲烷的速率慢，因此在厭氧消化過(guò)程中，丙酸最容易積累，從而導(dǎo)致系統(tǒng)失衡[23-25]。一般認(rèn)為，厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中適宜的丙酸濃度應(yīng)不高于1500 mg·L-1(2.3 g HPr·L-1COD)[25]。當(dāng)發(fā)酵體系中的丙酸濃度積累至>2000 mg·L-1以上，且影響正常產(chǎn)甲烷代謝時(shí)，將導(dǎo)致丙酸型酸化[26-27]。OSS實(shí)驗(yàn)組中，發(fā)酵4～8 d期間，除5%TS實(shí)驗(yàn)組，其余實(shí)驗(yàn)組的丙酸濃度均大于1500 mg·L-1，其中9%TS實(shí)驗(yàn)組丙酸濃度高于2254.1 mg·L-1；在持續(xù)56 d的發(fā)酵過(guò)程中，SIS實(shí)驗(yàn)組丙酸濃度始終維持較低的濃度，即使在負(fù)荷提升階段丙酸濃度均低于498.8 mg·L-1。因此，一步啟動(dòng)高濃度的秸稈厭氧發(fā)酵過(guò)程具有較高的丙酸型酸化風(fēng)險(xiǎn)，而逐級(jí)提升啟動(dòng)模式可以建立高效的丙酸水解體系，加速VFAs轉(zhuǎn)化，維持較穩(wěn)定的乙酸型發(fā)酵過(guò)程，預(yù)防厭氧消化系統(tǒng)酸化。

圖5 水解階段(第2～8天)乙酸、丙酸和丁酸產(chǎn)量的比例

2.2 啟動(dòng)方式對(duì)產(chǎn)甲烷代謝的影響

由圖6和圖7可知，所有實(shí)驗(yàn)組啟動(dòng)第2天即開始產(chǎn)甲烷，甲烷含量持續(xù)增加。發(fā)酵第4天，OSS實(shí)驗(yàn)組甲烷含量可達(dá)34.4%～44.0%，SIS實(shí)驗(yàn)組為31.7%～40.7%；OSS實(shí)驗(yàn)組和SIS實(shí)驗(yàn)組分別在發(fā)酵第18天和第16天進(jìn)入產(chǎn)甲烷代謝穩(wěn)定期，甲烷含量分別為62.8%～63.9%和58.6%～61.3%。SIS實(shí)驗(yàn)組于發(fā)酵第19天提升負(fù)荷后進(jìn)行了頂空氣體置換，但2天后(第22天)甲烷含量即達(dá)到19.9%～37.7%，5%、7%和9% TS組分別于16(第36天)、10(第30天)和12天后(第32天)進(jìn)入產(chǎn)甲烷代謝穩(wěn)定期。在持續(xù)56天的厭氧發(fā)酵過(guò)程中，即使在VFAs迅速積累的水解階段和丙酸濃度>2000 mg·L-1時(shí)，所有實(shí)驗(yàn)組均可正常進(jìn)行產(chǎn)甲烷代謝，未發(fā)生酸抑制現(xiàn)象，這可能與所使用的接種物中含有較高豐度的丙酸互營(yíng)氧化細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌有關(guān)[28]。

圖6 秸稈厭氧發(fā)酵過(guò)程中甲烷含量

圖7 秸稈厭氧發(fā)酵過(guò)程中累積產(chǎn)氣量

發(fā)酵結(jié)束時(shí)，SIS 5、SIS 7和SIS 9實(shí)驗(yàn)組的TS產(chǎn)氣率分別為197.7±2.7、213.0±26.0、253.6±8.3 mL·g-1TS(見圖8)，VS產(chǎn)氣率分別為231.2±3.2, 249.2±30.4, 296.6±9.7 mL·g-1VS(見圖9)，較OSS 實(shí)驗(yàn)組分別提高14.8%，10.1%和18.0%，但僅9%TS實(shí)驗(yàn)組的原料產(chǎn)氣率在兩種啟動(dòng)模式下具有極顯著差異(p<0.01)。

注：**，差異顯著p<0.05;***差異極顯著p<0.01

注：**，差異顯著p<0.05;***差異極顯著p<0.01

2.3 秸稈纖維素降解率

啟動(dòng)模式對(duì)秸稈中半纖維素、纖維素和木質(zhì)素的降解具有明顯的影響(見圖10～圖12)。當(dāng)TS為5%時(shí)，SIS實(shí)驗(yàn)組的半纖維素與纖維素降解率分別為(32.9±0.3)%和(41.5±2.7)%，顯著高于OSS實(shí)驗(yàn)組，較OSS實(shí)驗(yàn)組分別提高65.1%和49.3%；但木質(zhì)素降解率為(24.4±0.3)%，低于OSS實(shí)驗(yàn)組7.2%。TS為7%時(shí)，SIS實(shí)驗(yàn)組的半纖維素與纖維素降解率分別為(28.0±4.3)%和(29.8±1.0)%，較OSS實(shí)驗(yàn)組分別提高14.0%和8.0%；木質(zhì)素降解率為(18.7±3.3)%，低于OSS實(shí)驗(yàn)組27.5%。TS為9%時(shí)，SIS實(shí)驗(yàn)組的半纖維素與木質(zhì)素降解率分別為(27.2±1.2)%和(18.6±8.6)%，較OSS實(shí)驗(yàn)組分別提高4.8%和31.8%；纖維素降解率為(22.5±1.6)%，低于OSS實(shí)驗(yàn)組31.1%。因此，SIS對(duì)低濃度秸稈發(fā)酵過(guò)程中的半纖維素和纖維素轉(zhuǎn)化率具有顯著的促進(jìn)作用，但不利于木質(zhì)素降解；高濃度秸稈發(fā)酵過(guò)程中，SIS可在一定程度上提高半纖維素降解率，但OSS更有利于纖維素降解。

注：**，差異顯著 p<0.05；***，差異極顯著 p<0.01

注：**，差異顯著 p<0.05；***，差異極顯著 p<0.01

注：**，差異顯著 p<0.05；***，差異極顯著 p<0.01

2.4 啟動(dòng)模式對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)組成的影響

發(fā)酵穩(wěn)定期，5%和9%TS時(shí)，4種發(fā)酵條件下共注釋到1102個(gè)OTU，其中OSS和SIS實(shí)驗(yàn)組分別注釋到930和 766個(gè)OTU，各組的特有OTU數(shù)量分別為122個(gè)和45個(gè)(見圖13)，占每組OTU總量的13.1%和5.9%，暗示著微生物種群在逐級(jí)提升啟動(dòng)模式下趨向于富集，而在一步啟動(dòng)模式下趨向于分化。此外，OSS 5和OSS 9實(shí)驗(yàn)組、SIS 5和SIS 9實(shí)驗(yàn)組分別注釋到695、815、564和652個(gè)OTU(圖14和圖15)，這說(shuō)明OTU多樣性隨著秸稈發(fā)酵濃度的升高而增加。其中，各實(shí)驗(yàn)組共有OTU 339個(gè)，占OTU總量的30.8%；OSS 5、SIS 5、OSS 9和SIS 9實(shí)驗(yàn)組注釋到的特有OTU數(shù)量分別為59、32、155和95個(gè)，分別占各組OTU總數(shù)的8.5%、5.7 %、19.0%和14.6%，因此，發(fā)酵負(fù)荷可能是推動(dòng)微生物種群分化的重要影響因素，高物料濃度可驅(qū)動(dòng)形成更獨(dú)特的微生物種群結(jié)構(gòu)。

圖13 發(fā)酵穩(wěn)定期微生物OTU組成Venn圖

2.5 不同啟動(dòng)模式下微生物群落結(jié)構(gòu)的差異

當(dāng)發(fā)酵原料TS為5%和9%時(shí)，OSS和SIS兩種啟動(dòng)方式分別對(duì)秸稈纖維素水解和原料產(chǎn)氣率有顯著影響。為了揭示啟動(dòng)方式對(duì)高濃度秸稈厭氧消化過(guò)程中微生物的影響，探究維持發(fā)酵穩(wěn)定性、促進(jìn)產(chǎn)甲烷代謝的關(guān)鍵微生物，采用高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)不同啟動(dòng)模式下5%和9% TS實(shí)驗(yàn)組在穩(wěn)定產(chǎn)氣階段的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。

細(xì)菌屬水平分析結(jié)果顯示，一步啟動(dòng)法和逐步提升啟動(dòng)法對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成具有明顯的影響(見圖14)。OSS實(shí)驗(yàn)組的優(yōu)勢(shì)物種(相對(duì)豐度≥5%)為Sphaerochaeta(5%和9% TS實(shí)驗(yàn)組分別為16.8%和18.6%),Proteiniphilum(3.6%和7.8%)[29]和 OPB54(3.0%和5.6%)等。Sphaerochaeta廣泛分布在白蟻腸道、以纖維素為原料的厭氧發(fā)酵系統(tǒng)、油藏環(huán)境[30]，已分離的純培養(yǎng)物具有降解纖維二糖和核糖等纖維素、半纖維素水解產(chǎn)物，并產(chǎn)生乙酸、丙酸和丁酸的能力[31-34]。Proteiniphilum是中溫厭氧反應(yīng)器中常見的一類水解性細(xì)菌，具有多種多聚糖水解酶活性(如β-葡聚糖、淀粉、木聚糖、阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯木聚糖、CM-纖維素和PASC)，可降解纖維二糖、葡萄糖、等半纖維素和纖維素水解產(chǎn)物，以及蛋白胨、酵母粉和多種多肽，產(chǎn)生乙酸和丙酸[35-36]。在間歇性木質(zhì)纖維素微耗氧發(fā)酵過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，Proteiniphilum可以通過(guò)交替進(jìn)行好氧呼吸和厭氧發(fā)酵直接降解木質(zhì)纖維素產(chǎn)生二氧化碳、甲酸和乙酸[37]?；诙嘟M學(xué)分析推測(cè)，在厭氧發(fā)酵微生物組中，Proteiniphilum和Petrimonas可能是厭氧發(fā)酵過(guò)程不穩(wěn)定的代表性指標(biāo)[38-39]。OPB54是芽孢桿菌門(Bacillota，舊名厚壁菌門，F(xiàn)irmicutes)的一個(gè)未培養(yǎng)的類群，在纖維素富集物、秸稈、牛糞和蔬菜廢棄物的高溫干發(fā)酵過(guò)程中為優(yōu)勢(shì)物種，也是含有高濃度乙酸的厭氧反應(yīng)器中豐度最高的互營(yíng)乙酸氧化菌[40]。該類群中最近分離培養(yǎng)的Hydrogenispora可以降解幾丁質(zhì)，以及木糖、葡萄糖等多種單糖和多糖，產(chǎn)生乙酸、乙醇、氫氣等，尚未證實(shí)具有乙酸互營(yíng)氧化能力[41-42]。SIS實(shí)驗(yàn)組的優(yōu)勢(shì)物種為vadinBC27 wastewater-sludge group(5%和9% TS實(shí)驗(yàn)組分別為15.7%和25.2%), uncultured Synergistaceae(9.6%和12.3%)和OPB54(6.0%和1.6%)等。研究發(fā)現(xiàn)，vadinBC27 wastewater-sludge group和uncultured Synergistaceae是牛糞干發(fā)酵、人工廢水厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)物種[43-44]。其中，vadinBC27 wastewater-sludge group屬于擬桿菌門(Bacteroidetes)，但功能尚不清楚。目前已分離的擬桿菌門成員多數(shù)具有降解纖維素、木聚糖、幾丁質(zhì)等多聚糖的能力。Synergistaceae成員和部分uncultured Synergistaceae具有氨基酸、乙酸互營(yíng)氧化代謝能力，有利于促進(jìn)VFAs等厭氧發(fā)酵的中間代謝產(chǎn)物降解產(chǎn)甲烷[45-46]。在OSS實(shí)驗(yàn)組中，優(yōu)勢(shì)物種的相對(duì)豐度隨著TS的增加而提高，暗示其在纖維素厭氧降解過(guò)程中具有重要的作用，可能與VFAs積累有關(guān)。而SIS實(shí)驗(yàn)組中Sphaerochaeta(5%和9% TS實(shí)驗(yàn)組分別為3.7%和1.6%)和Proteiniphilum(0.5%和0.4%)的相對(duì)豐度顯著低于OSS實(shí)驗(yàn)組，且隨著TS濃度的增加而降低，這可能是其半纖維素、纖維素降解率低于OSS實(shí)驗(yàn)組的原因。同時(shí)，SIS實(shí)驗(yàn)組中高豐度的Synergistaceae可能與發(fā)酵過(guò)程中維持較低的VFAs有關(guān)，而OSS實(shí)驗(yàn)組中，該類群僅占1.6%～3.8%。但是，所有實(shí)驗(yàn)組中均具有多種互營(yíng)VFAs氧化菌，包括互營(yíng)短鏈脂肪酸/長(zhǎng)鏈脂肪酸(C4及以上)氧化菌Syntrophomonas[47-48]、互營(yíng)丙酸氧化菌Pelotomaculum[49-50]，以及乙酸氧化菌Mesotoga[51]，在OSS和SIS實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)豐度分別為1.8%～2.0%和4.6%～5.3%，這可能是發(fā)酵過(guò)程中參與乙酸、丙酸和丁酸降解的關(guān)鍵細(xì)菌類群。

圖14 不同啟動(dòng)模式下細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和相對(duì)豐度

不同啟動(dòng)模式下，氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌Methanoculleus是秸稈厭氧發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)古菌(見圖15)，同時(shí)還包括未培養(yǎng)古菌Miscellaneous Crenarchaeotic Group(MCG)。MCG主要發(fā)現(xiàn)于海洋沉積物、淡水環(huán)境，包括具有氨氧化和硫代謝等功能的多個(gè)亞群[52]，在不同啟動(dòng)模式下，MCG的相對(duì)豐度無(wú)顯著差異。此外，OSS實(shí)驗(yàn)組中氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌Methanoculleus(5%和9%TS實(shí)驗(yàn)組分別為70.1%和75.6%)的相對(duì)豐度高于SIS實(shí)驗(yàn)組(55.6%和60.1%)。然而，SIS實(shí)驗(yàn)組的氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌Methanobacterium(13.8%和10.4%)顯著高于OSS實(shí)驗(yàn)組(2.2%和3.0%)。在較低的氫分壓下，Methanobacterium對(duì)氫氣具有較高的親和力，在短鏈脂肪酸互營(yíng)氧化過(guò)程中參與種間電子傳遞[53]。由此推測(cè)，SIS實(shí)驗(yàn)組中較高豐度的Methanobacterium可能與互營(yíng)氧化細(xì)菌Synergistaceae、Syntrophomonas和Pelotomaculum之間存在互營(yíng)代謝關(guān)系，從而維持較低濃度的VFAs。同時(shí)，與5%TS實(shí)驗(yàn)組相比，9%實(shí)驗(yàn)組中具有較高豐度的Methanosarcina，且SIS實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)豐度(15.1%)顯著高于OSS實(shí)驗(yàn)組(5.9%)，有利于乙酸和氫氣/二氧化碳的消耗，維持發(fā)酵的穩(wěn)定性。

圖15 不同啟動(dòng)模式下古菌的群落結(jié)構(gòu)和相對(duì)豐度

3 結(jié)論

啟動(dòng)模式對(duì)水稻秸稈中溫厭氧發(fā)酵性能具有顯著的影響。一步啟動(dòng)模式有利于乙酸的快速降解，趨向于形成丙酸型發(fā)酵。逐級(jí)提升啟動(dòng)模式有利于促進(jìn)丙酸和乙酸等VFAs的轉(zhuǎn)化，避免VFAs積累，建立持續(xù)的乙酸型發(fā)酵，維持發(fā)酵系統(tǒng)的穩(wěn)定性；同時(shí)，在較高的物料濃度下，可顯著提升沼氣產(chǎn)率。此外，逐級(jí)提升啟動(dòng)模式可顯著提高較低濃度秸稈中的半纖維素、纖維素降解率，改善高濃度秸稈的半纖維素降解率，但不利于木質(zhì)素的降解。

啟動(dòng)模式差異推動(dòng)秸稈厭氧消化系統(tǒng)形成了不同的微生物群落結(jié)構(gòu)。一步啟動(dòng)發(fā)酵系統(tǒng)中富集了Sphaerochaeta,Proteiniphilum和 OPB54等多聚糖、糖類水解細(xì)菌，有利于秸稈纖維素快速水解產(chǎn)酸；逐級(jí)提升啟動(dòng)模式富集了uncultured Synergistaceae等多種互營(yíng)氧化細(xì)菌。氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌Methanoculleus是秸稈厭氧消化系統(tǒng)中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)古菌，逐級(jí)提升啟動(dòng)模式下富集的氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌Methanobacterium可能與uncultured Synergistaceae、Syntrophomonas和Pelotomaculum等多種互營(yíng)氧化細(xì)菌協(xié)同作用，促進(jìn)氨基酸和VFAs等水解產(chǎn)甲烷，從而維持發(fā)酵系統(tǒng)的穩(wěn)定性，提高沼氣產(chǎn)率。