應(yīng)變控制對(duì)形狀記憶聚氨酯表面微納結(jié)構(gòu)的影響

張雪蓮，潘顯超，喬雅茹，韓榕林，王錦峰，邢 娟

1.西南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室（瀘州646000）；2.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)教研室（瀘州646000）；3.重慶大學(xué)生物工程學(xué)院（重慶 400045）

形狀記憶聚氨酯（shape memory polyurethane，SMPU）是研究最為廣泛的形狀記憶材料[1]，外界環(huán)境（如光、熱、水等）改變可引起材料形狀變化[2]。形狀記憶能力賦予SMPU 在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域特別是在模型制備方面重要的應(yīng)用價(jià)值[3-4]。此外，SMPU 形態(tài)變化可對(duì)周?chē)M織施加應(yīng)力刺激，對(duì)再生醫(yī)學(xué)至關(guān)重要[5]。

SMPU 的形狀記憶過(guò)程包括賦形、臨時(shí)形狀固定、形狀回復(fù)等步驟。以熱響應(yīng)SMPU 為例，當(dāng)環(huán)境溫度高于玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（glass temperature，Tg）時(shí)，材料易變形。此時(shí)施加外力可使材料從原始形狀變?yōu)榕R時(shí)形狀，即為賦形。隨后，降低溫度至Tg以下，臨時(shí)形狀被固定。當(dāng)溫度再次升至Tg以上，材料即可發(fā)生形狀回復(fù)[1，6]。實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，應(yīng)力松弛或蠕變可能導(dǎo)致臨時(shí)形狀的改變。若采取“應(yīng)變控制”（即控制其臨時(shí)性質(zhì)不變）策略，將材料置于高于Tg-10K的溫度下，一段時(shí)間后即使溫度升至Tg以上，材料也無(wú)法完全回復(fù)，即獲得不同于原始形狀與臨時(shí)形狀的“第三形狀”。該形狀有助于避開(kāi)金屬模型而獲得復(fù)雜形狀，可用于制備特殊形狀材料[7]。此外，應(yīng)變控制引起的不完全回復(fù)在4D-打印領(lǐng)域也有重要應(yīng)用潛力[8]。

SMPU 的形狀記憶能力源于特殊的“嵌段共聚物”性質(zhì)。SMPU 由化學(xué)特性不同的軟段和硬段嵌段連接而成。由于熱力學(xué)不相容性，軟、硬段彼此分離，硬段聚集形成納米尺度的微區(qū)結(jié)構(gòu)[9]，即SMPU的相分離現(xiàn)象[10]。由于納米結(jié)構(gòu)可調(diào)控人體內(nèi)的蛋白黏附狀態(tài)與細(xì)胞行為，因此SMPU 表面微納結(jié)構(gòu)的變化對(duì)材料的生物相容性十分關(guān)鍵[11-13]。

研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)改變軟硬段組成及材料制備方法可調(diào)節(jié)SMPU的相分離結(jié)構(gòu)[14]。此外，課題組前期研究表明，SMPU薄膜的賦形與形狀回復(fù)階段均伴隨著硬段微區(qū)的重組與表面微納結(jié)構(gòu)的改變[15-16]。然而，目前還未有研究關(guān)注賦形與形狀回復(fù)之間的應(yīng)變控制對(duì)相分離結(jié)構(gòu)的影響。探索應(yīng)變控制在相分離微納結(jié)構(gòu)變化中的作用對(duì)豐富SMPU 的生物相容性評(píng)價(jià)體系至關(guān)重要，同時(shí)也可指導(dǎo)針對(duì)特殊應(yīng)用的SMPU 的設(shè)計(jì)、優(yōu)化及加工。

本研究中，借助于原子力顯微鏡（atom force microscope，AFM）與掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM），我們考察應(yīng)變控制對(duì)SMPU 相分離微納結(jié)構(gòu)的影響。研究結(jié)果將有助于指導(dǎo)SMPU 的加工以適應(yīng)具體的醫(yī)學(xué)應(yīng)用需求。

1 材料和方法

1.1 SMPU薄膜的制備與拉伸賦形

本研究所用SMPU 軟段為聚乳酸-聚乙二醇三嵌段共聚物（PDLLA-PEG-PDLLA），硬段為六亞甲基二異氰酸酯（hexamethylene diisocyanate，HDI）與哌嗪（piperazine，PPZ）（圖1）[15]。以往研究顯示，聚乳酸與聚乙二醇具有良好的生物相容性與生物可降解、可吸收性[17]。HDI 為脂肪類(lèi)異氰酸酯，鏈段運(yùn)動(dòng)性較強(qiáng)；而PPZ 為小分子環(huán)狀二元仲胺，其剛性環(huán)狀結(jié)構(gòu)和擴(kuò)鏈形成的脲基可有效提高硬段剛性，增強(qiáng)材料力學(xué)性能[18]。DSC檢測(cè)SMPU的Tg為38.6 ℃。根據(jù)前期研究，采用溶液澆鑄法制備SMPU薄膜，并以200%的拉伸率對(duì)薄膜進(jìn)行拉伸賦形[15]。方法如下：將薄膜54 ℃（Tg+15 ℃[13]）下靜置5 min 后，以20 mm/min 的速度將薄膜拉伸到200%長(zhǎng)度。隨后，將拉伸薄膜置于25 ℃環(huán)境下（低于Tg-10 ℃[5]）2 min，使薄膜形狀得到有效固定。最后，去除薄膜兩端固定裝置，將拉伸薄膜置于室溫下，待用。

圖1 SMPU化學(xué)結(jié)構(gòu)式Figure 1 Chemical structure of SMPU

1.2 應(yīng)變控制處理

拉伸后，SMPU薄膜Tg為40.6 ℃[16]。為保證不完全回復(fù)，將拉伸材料置于高于Tg-10 ℃的環(huán)境中。同時(shí)，為保證材料在應(yīng)變控制后依然具有形狀回復(fù)能力，應(yīng)變控制溫度不宜過(guò)高[7]。綜上，本實(shí)驗(yàn)選擇32 ℃作為應(yīng)變控制處理溫度。操作如下：用夾具將拉伸薄膜兩端固定在載玻片上，置于32 ℃環(huán)境中24 h，薄膜記為“應(yīng)變控制”。應(yīng)變控制處理結(jié)束后，將環(huán)境溫度升至41 ℃（Tg以上），去除夾具，待薄膜完成形狀回復(fù)至長(zhǎng)度不再縮短，薄膜記為“應(yīng)變控制-回復(fù)”。觀(guān)察薄膜形狀回復(fù)性能并進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。

此外，以未應(yīng)變控制處理薄膜為對(duì)照組。處理如下：對(duì)SMPU 薄膜進(jìn)行200%的拉伸賦形，待臨時(shí)形狀固定后，直接將薄膜置于41 ℃的環(huán)境中自由回復(fù)，將薄膜記為“對(duì)照-回復(fù)”。觀(guān)察薄膜形狀回復(fù)并進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。

1.3 形狀回復(fù)性能檢測(cè)

觀(guān)察薄膜形狀回復(fù)過(guò)程，并計(jì)算薄膜的形狀回復(fù)率（recovery ratio，Rr）。

（L0：原始長(zhǎng)度，L1：去除固定裝置后長(zhǎng)度，L2：回復(fù)后長(zhǎng)度）

1.4 微納結(jié)構(gòu)觀(guān)察與分析

室溫下，利用AFM 考察薄膜表面相分離與納米粗糙度[19]，SEM 觀(guān)察薄膜表面形貌。注意：AFM 實(shí)驗(yàn)時(shí)，用otespa探針在輕敲模式下以1 Hz的頻率對(duì)材料表面進(jìn)行掃描并采集數(shù)據(jù)；SEM實(shí)驗(yàn)時(shí)，需對(duì)材料進(jìn)行噴鉑處理以增加薄膜導(dǎo)電性，并在低電壓下（2.0 kV）模式下采集圖片。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用excel 與origin 8.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)表示為：均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）；滿(mǎn)足參數(shù)檢驗(yàn)條件的利用單因素方差分析法進(jìn)行組間差異考察，P ＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 應(yīng)變控制對(duì)SMPU薄膜形狀回復(fù)率的影響

觀(guān)察薄膜形狀回復(fù)并計(jì)算形狀回復(fù)率，結(jié)果如圖2所示。經(jīng)應(yīng)變控制處理的薄膜的形狀回復(fù)率（%）為82.34±5.35，明顯低于對(duì)照回復(fù)組（95.94±2.58）。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)所采用的應(yīng)變控制處理引起薄膜不完全回復(fù)，達(dá)到預(yù)期實(shí)驗(yàn)效果。

圖2 應(yīng)變控制對(duì)SMPU薄膜形狀回復(fù)率的影響Figure 2 Effect of strain-control on shape recovery rate of SMPU films

2.2 應(yīng)變控制對(duì)SMPU相分離的影響

AFM 相位圖顯示SMPU 中可見(jiàn)明顯的亮區(qū)與暗區(qū)，亮區(qū)對(duì)應(yīng)硬段聚集而成的微區(qū)[19]。前期研究結(jié)果顯示：在SMPU 薄膜的原始形狀中，硬段緊密聚集，形成無(wú)序排列的微區(qū)結(jié)構(gòu)（圖3A中箭頭所示），拉伸導(dǎo)致微區(qū)結(jié)構(gòu)沿拉伸方向排列（圖3A，200%拉伸）[15]。本研究中，我們借助AFM 進(jìn)一步考察應(yīng)變控制對(duì)薄膜表面相分離微納結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果如圖3所示，SMPU的相分離結(jié)構(gòu)在應(yīng)變控制處理期間無(wú)顯著變化，即硬段微區(qū)依然沿拉伸方向有序排列（圖3B中放大區(qū)域所示）。然而，形狀回復(fù)后薄膜表面相分離結(jié)構(gòu)顯示，經(jīng)過(guò)應(yīng)變控制處理的薄膜，在完成形狀回復(fù)過(guò)程后（應(yīng)變控制-回復(fù)），硬段微區(qū)的排列依然具有取向性（如掃描范圍為2 μm × 2 μm 的視野所示）。而在“對(duì)照回復(fù)”薄膜中，微區(qū)結(jié)構(gòu)排列無(wú)序。AFM結(jié)果表明，應(yīng)變控制處理可顯著影響形狀回復(fù)SMPU中硬段微區(qū)的排列方式。

圖3 應(yīng)變控制對(duì)SMPU薄膜相分離的影響Figure 3 Effect of strain-control on phase separation of SMPU films

由于硬段間較強(qiáng)的內(nèi)聚能（氫鍵）作用[20]，原始形狀SMPU 薄膜中硬段聚集引起薄膜表面局部突起（圖4A，原始形狀）[15]。為探究應(yīng)變控制對(duì)形狀回復(fù)薄膜表面粗糙度的影響，本研究分析了形狀回復(fù)SMPU 薄膜表面相位圖與對(duì)應(yīng)的高度圖。結(jié)果顯示：高度圖與相位圖中的高亮區(qū)域基本吻合（圖4A），說(shuō)明形狀回復(fù)后薄膜表面突起部位依然由硬段微區(qū)組成。通過(guò)對(duì)掃描范圍為10 μm×10 μm的AFM高度圖的線(xiàn)平面粗糙度分析可知（圖4B），所有SMPU 薄膜的表面粗糙度均在2 nm～4 nm之間，且差異較小。該結(jié)果說(shuō)明：應(yīng)變控制對(duì)形狀回復(fù)SMPU薄膜表面粗糙度影響較小。

圖4 原始形狀與形狀回復(fù)SMPU薄膜表面粗糙度分析Figure 4 Roughness analysis of original and shape recovered SMPU films

2.3 應(yīng)變控制對(duì)SMPU微納結(jié)構(gòu)的影響

AFM 結(jié)果顯示，應(yīng)變控制可影響形狀回復(fù)SMPU薄膜表面硬段聚集排列方式，從而改變薄膜表面相分離結(jié)構(gòu)。為從微米尺度上進(jìn)一步觀(guān)察SMPU 表面形貌，我們對(duì)形狀回復(fù)薄膜進(jìn)行了SEM檢測(cè)。結(jié)果顯示：在SMPU 薄膜表面可見(jiàn)纖維狀突起，利用Image J 軟件測(cè)算纖維長(zhǎng)度多為1～3 μm、直徑約200～300 nm。由于硬段聚集導(dǎo)致材料局部突出（圖4a），因此，納米纖維主要由硬段組成。前期研究結(jié)果顯示，拉伸后薄膜表面由于硬段微區(qū)的有序排列，納米纖維延伸方向與拉伸方向一致，其夾角在40°以下的纖維占比50 %以上[15]。為進(jìn)一步考察形狀回復(fù)薄膜表面納米纖維取向能否恢復(fù)到原始形狀，從SEM 圖片中隨機(jī)選取6 個(gè)視野，借助于Image J 軟件的角度測(cè)算功能測(cè)量納米纖維延伸方向（圖5A 中紅色虛線(xiàn)所示）與拉伸方向間的夾角并作統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如圖5B 所示。“對(duì)照回復(fù)組”薄膜表面取向與原始形狀表面無(wú)顯著差異，纖維呈隨機(jī)取向分布。而“應(yīng)變控制-回復(fù)”薄膜表面，纖維延伸方向與拉伸方向間的夾角大于40°的纖維比例高達(dá)71.97%，其中，夾角在40°～60°之間的纖維占比41.32%。該結(jié)果表明：應(yīng)變控制處理在降低薄膜形狀回復(fù)率的同時(shí)，導(dǎo)致形狀回復(fù)薄膜表面硬段微區(qū)排列的有序性提高。由于硬段的化學(xué)性質(zhì)不同于軟段，應(yīng)變控制回復(fù)薄膜表面納米纖維有序性的提高實(shí)際是納米尺度化學(xué)“圖案”的有序性提高，即應(yīng)變控制對(duì)薄膜表面納米結(jié)構(gòu)的影響主要表現(xiàn)為對(duì)薄膜表面化學(xué)特性的影響。

圖5 應(yīng)變控制對(duì)形狀回復(fù)薄膜表面形貌的影響Figure 5 Effect of strain-control on surface morphology of recovered SMPU films

3 討論

SMPU具有良好的形狀記憶性能，但其優(yōu)勢(shì)不僅僅局限于傳統(tǒng)的完全形狀回復(fù)，由不完全回復(fù)造成的“第三形狀”在醫(yī)學(xué)模型制備與4D材料制備中具有重要應(yīng)用潛力[8]。應(yīng)變控制是造成不完全回復(fù)的有效途徑，因此，探究應(yīng)變控制是否影響材料表面微納結(jié)構(gòu)是進(jìn)一步拓展SMPU在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的基礎(chǔ)。

SMPU 形狀記憶過(guò)程中伴隨著材料體系內(nèi)能量的變化，這種變化也是形狀回復(fù)的基礎(chǔ)。如溫度敏感型SMPU，當(dāng)材料其所處溫度在Tg以上時(shí)，其狀態(tài)為粘彈態(tài)。此時(shí)軟段具有較強(qiáng)的可塑性，若施加外力即可使軟段分子鏈有序排列，降低材料內(nèi)的體系熵。臨時(shí)形狀在較低溫度下被固定的過(guò)程中，伴隨著有序排列的軟段分子鏈被“凍結(jié)”，以及外力做功而賦予材料的能量被“凍結(jié)”。最后，當(dāng)材料形狀回復(fù)時(shí)，體系內(nèi)被“凍結(jié)”的能量得到釋放，軟段分子鏈運(yùn)動(dòng)性再次增強(qiáng)并傾向于回到初始狀態(tài)。該過(guò)程促進(jìn)了材料由臨時(shí)形狀向原始形狀的轉(zhuǎn)變，同時(shí)也是硬段組裝向其初始狀態(tài)回復(fù)的動(dòng)力[21-23]。綜上所述，賦形實(shí)際上是賦予材料能量的過(guò)程，而形狀回復(fù)則是釋放能量的過(guò)程。本研究中，SMPU 薄膜經(jīng)過(guò)應(yīng)變控制處理后進(jìn)行形狀回復(fù)，其形狀回復(fù)率下降，且硬段微區(qū)組裝狀態(tài)無(wú)法回復(fù)到原始形狀中的無(wú)序狀態(tài)（圖3），表明材料在應(yīng)變控制過(guò)程中有能量的損失。

本研究中，我們將材料以200%的拉伸率賦形，并在此應(yīng)變下進(jìn)行應(yīng)變控制。據(jù)以往研究顯示，這種處理方式可能會(huì)引起材料內(nèi)應(yīng)力松弛現(xiàn)象的出現(xiàn)[24]。而該現(xiàn)象是否發(fā)生，很大程度上取決于環(huán)境溫度[25-26]。若應(yīng)變控制的SMPU 所處環(huán)境溫度較高會(huì)發(fā)生應(yīng)力松弛，繼而引發(fā)能量損失[27-29]。其原因在于分子鏈段，尤其是軟段的微觀(guān)布朗運(yùn)動(dòng)。該運(yùn)動(dòng)使得軟段逐漸改變?nèi)∠蛞赃m應(yīng)臨時(shí)形狀，最終導(dǎo)致不可回復(fù)應(yīng)變的發(fā)生。為避免這種現(xiàn)象發(fā)生，需將材料置于Tg-10K 的環(huán)境中[7]。本研究中，拉伸后SMPU 薄膜的Tg為40.6 ℃，應(yīng)變控制溫度為32 ℃，且應(yīng)變控制處理時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)（24 h）。因此，應(yīng)變控制期間薄膜會(huì)消耗能量用于軟段緩慢的分子運(yùn)動(dòng)，而硬段微區(qū)的聚集在該期間內(nèi)并無(wú)顯著變化。除應(yīng)力松弛外，賦形過(guò)程中較長(zhǎng)硬段微區(qū)（數(shù)百納米）的斷裂也可能造成能量損失[30]。本研究中，雖然拉伸引起SMPU薄膜中硬段微區(qū)重排，但AFM結(jié)果顯示硬段微區(qū)尺寸較小，且拉伸過(guò)程未見(jiàn)硬段微區(qū)的斷裂。據(jù)此可推斷，本研究中由硬段微區(qū)斷裂造成能量損失的可能性較小。因此，本研究中薄膜的能量損失與不完全回復(fù)主要?dú)w因于應(yīng)變控制處理期間的應(yīng)力松弛。能量損失同時(shí)使形狀回復(fù)過(guò)程中硬段組裝回復(fù)到初始狀態(tài)的動(dòng)力減小，最終表現(xiàn)為形狀回復(fù)薄膜中硬段微區(qū)的有序排列。

綜上，應(yīng)變控制可引起形狀記憶高分子材料的能量損失與不完全回復(fù)，最終引起形狀回復(fù)材料相分離微納結(jié)構(gòu)的改變。相較于傳統(tǒng)的靜態(tài)組織工程材料，SMPU 在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的首要優(yōu)勢(shì)是其動(dòng)態(tài)的形狀回復(fù)過(guò)程。該過(guò)程可在一定程度上對(duì)材料周?chē)慕M織細(xì)胞提供應(yīng)力刺激，該刺激可促進(jìn)組織再生修復(fù)[31]。然而，需要注意的是，除應(yīng)力刺激這一物理信號(hào)外，材料表面特性本身即可決定材料最終應(yīng)用情況[32]。對(duì)于SMPU來(lái)說(shuō)，由軟硬段相分離導(dǎo)致的SMPU材料局部微納結(jié)構(gòu)可提供化學(xué)信號(hào)，該信號(hào)可對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白在材料表面的黏附狀態(tài)及后續(xù)細(xì)胞行為調(diào)控具有極其重要的影響[33]。因此，在設(shè)計(jì)形狀記憶過(guò)程以適應(yīng)特定生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用時(shí)，必須考慮應(yīng)變控制的潛在影響，尤其是對(duì)材料表面微納結(jié)構(gòu)的影響。

4 結(jié)論

本研究從形狀記憶聚氨酯的加工及應(yīng)用角度出發(fā)，考察了應(yīng)變控制對(duì)材料相分離微納結(jié)構(gòu)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在相對(duì)較高的溫度下進(jìn)行應(yīng)變控制處理導(dǎo)致材料形狀回復(fù)率降低約13%。更重要的是，應(yīng)變控制使形狀回復(fù)薄膜表面納米尺度的硬段微區(qū)呈有序排列狀態(tài)，從而引起形狀回復(fù)聚氨酯表面有序排列的納米纖維的生成。本研究對(duì)充分認(rèn)識(shí)材料加工及應(yīng)用過(guò)程中的各個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)材料最終應(yīng)用的影響提供了重要參考。同時(shí)，研究結(jié)果也為后續(xù)深入理解材料-細(xì)胞相互作用奠定了理論基礎(chǔ)。

（利益沖突：無(wú)）