非生物脅迫對(duì)煙草懸浮細(xì)胞胞內(nèi)和胞外ATP水平的影響

李 麗王 馨張悅婧賈凌云，2龐海龍，2馮漢青，2*

（1.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070；2.西北師范大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院，蘭州 730070）

三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）是生物體中常見(jiàn)的能量物質(zhì)，在細(xì)胞中普遍存在，作為能量貨幣參與生物體的代謝活動(dòng)。植物細(xì)胞可以通過(guò)氧化磷酸化和光合磷酸化合成ATP［1］。傳統(tǒng)觀念中，ATP 在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，但有研究表明，動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞可以將胞內(nèi)ATP（intracellular ATP，iATP）通過(guò)囊泡運(yùn)輸、ABC（ATPbinding cassette）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等方式從細(xì)胞質(zhì)分泌到細(xì)胞外基質(zhì)中，從而形成細(xì)胞外ATP（extracellular ATP，eATP）［2-7］，并利用胞外ATP 作為信號(hào)分子來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的各種生理反應(yīng)［8］。目前研究揭示，植物細(xì)胞外ATP 可通過(guò)其受體的介導(dǎo)作用來(lái)調(diào)節(jié)植物細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、抗病性、氣孔開(kāi)閉和重力反應(yīng)［9］。目前已經(jīng)在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中鑒定出了特異性結(jié)合胞外ATP 的受體蛋白［10］，這使得植物胞外ATP 的信號(hào)傳遞機(jī)制和功能得到了進(jìn)一步的明確。

在自然環(huán)境中，植物常常遭受不同類型的非生物脅迫；其中，鹽、干旱、低溫是植物最常受到的非生物脅迫因素。大量的研究表明，鹽、干旱、低溫能夠?qū)е轮参锛?xì)胞的含水量降低，導(dǎo)致植物細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量增加［11］；同時(shí)，鹽、干旱、低溫也引起了細(xì)胞中活性氧的過(guò)度積累［12］，使得核酸、脂質(zhì)、蛋白等生物大分子遭受氧化損傷，膜的通透性增加［13］；從而使得植物細(xì)胞的代謝紊亂，氧化應(yīng)激壓力上升，植物細(xì)胞活力下降，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡［14-16］。

由于在植物質(zhì)膜上未鑒定到ATP 合成酶的存在，因此對(duì)于植物細(xì)胞而言，細(xì)胞iATP是植物eATP的唯一來(lái)源。從理論上講，iATP 水平?jīng)Q定著eATP的水平。因此，在非生物脅迫下，iATP 和eATP 水平的變化可能存在著重要的相關(guān)性。但到目前為止，對(duì)植物細(xì)胞內(nèi)ATP 和細(xì)胞外ATP 水平聯(lián)動(dòng)變化的研究較少?；诖?，本研究以煙草懸浮細(xì)胞（Nicotiana tabacum‘Bright Yellow-2’）（不含葉綠體，不會(huì)由光合作用影響ATP 的水平）為材料，探究鹽、干旱、低溫3 種非生物脅迫對(duì)細(xì)胞iATP 和eATP 水平的影響，以期能進(jìn)一步為環(huán)境脅迫下ATP水平變化解析提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 煙草懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)

煙草懸浮細(xì)胞由香港中文大學(xué)姜里文教授饋贈(zèng)。煙草懸浮細(xì)胞利用MS 液體培養(yǎng)基進(jìn)行培 養(yǎng)，MS 液 體 培 養(yǎng) 基 中 添 加30 g·L-1的 蔗 糖、0.4 mg·L-12，4-二氯苯氧乙酸、1 mg·L-1維生素B1，并用1 mol·L-1KOH調(diào)節(jié)pH至5.8。將細(xì)胞于上述MS 液體培養(yǎng)基接種后在25 ℃、130 r·min-1黑暗條件下振蕩培養(yǎng)。每7 d 吸取10 mL 的細(xì)胞懸浮液置于新配制的100 mL MS 液體培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)。選取處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期（第5 天）的煙草懸浮細(xì)胞作為試驗(yàn)材料，全部試驗(yàn)操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料處理

NaCl 處理：取繼代培養(yǎng)5 d 的煙草懸浮細(xì)胞，用分別含有0、50、100、200 mmol·L-1NaCl 的MS 液體培養(yǎng)基以1∶4的比例稀釋搖勻，在黑暗條件下以25 ℃、130 r·min-1震蕩孵育1 h。

PEG（6000）處理：取繼代培養(yǎng)5 d 的煙草懸浮細(xì)胞，用分別含有0、50、100、200 g·L-1PEG 的MS液體培養(yǎng)基以1∶4的比例稀釋搖勻，在黑暗條件下以25 ℃、130 r·min-1震蕩孵育5 h。

低溫處理：取繼代培養(yǎng)5 d的煙草懸浮細(xì)胞，分別置于25 ℃（對(duì)照，CK）、10 ℃、4 ℃、0 ℃中處理4 h。

1.3 生理指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 細(xì)胞膜通透性變化檢測(cè)

細(xì)胞膜通透性依據(jù)伊文思藍(lán)染色法進(jìn)行測(cè)量［17］。吸取1 mL 處理后的煙草懸浮細(xì)胞，加入100 μL 0.025%的伊文思藍(lán)染料進(jìn)行染色。染色8 min 后，3 000 r·min-1離心3 min，棄上清液，向細(xì)胞中加入1 mL 磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌，再次于3 000 r·min-1離心3 min，棄上清，重復(fù)此操作直至未與細(xì)胞結(jié)合的染料被清除。洗滌結(jié)束后，向沉淀物中加入1 mL 含有10 g·L-1的十二烷基磺酸鈉（SDS）和體積分?jǐn)?shù)50%甲醇的裂解液，50 ℃水浴加熱30 min 使細(xì)胞充分裂解。裂解后于12 000 r·min-1條件下離心8 min，取500 μL 上清液加蒸餾水稀釋至3 mL，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定600 nm處的吸光值來(lái)表征細(xì)胞膜通透性。

1.3.2 煙草懸浮細(xì)胞外ATP 和細(xì)胞內(nèi)ATP 水平的測(cè)定

由于ATP 能和熒光素在熒光素酶催化作用下釋放出光子，因可根據(jù)該反應(yīng)釋放出的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)弱來(lái)表示ATP 水平［9］。吸取1 mL 處理后的煙草懸浮細(xì)胞，于4 ℃下4 000 r·min-1離心4 min 后，取上清液。將上清液置于4 ℃下，檢測(cè)其中ATP 的含量，從而表征細(xì)胞eATP 的水平。在離心后的細(xì)胞沉淀中加入200 μL ATP 檢測(cè)裂解液，靜置3 min使得細(xì)胞充分裂解，于4 ℃下12 000 r·min-1離心8 min，吸取上清液來(lái)檢測(cè)其中ATP 的含量，從而表征細(xì)胞iATP的水平。ATP含量檢測(cè)使用增強(qiáng)型ATP檢測(cè)試劑盒（碧云天，上海）測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所得數(shù)據(jù)為3次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值，試驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（SE）來(lái)表示。采用SPSS 25.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，以P＜0.05 表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異，用Origin 9.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度NaCl 處理下煙草懸浮細(xì)胞膜通透性的變化

在煙草懸浮細(xì)胞中分別加入50、100、200 mmol·L-1NaCl 處 理1 h，如 圖1 所 示，較 之 對(duì) 照（CK），隨著NaCl 濃度的增加，細(xì)胞膜通透性顯著升高（P＜0.05）；其中50 mmol·L-1NaCl 處理后細(xì)胞膜通透性升高至CK 的1.6 倍，100 和200 mmol·L-1NaCl 處理后細(xì)胞膜通透性進(jìn)一步升高，分別升高至CK的1.7倍和1.9倍。

圖1 不同濃度NaCl處理下煙草懸浮細(xì)胞膜通透性圖中不同的字母表示在P＜0.05 水平有顯著差異（為便于比較，將對(duì)照組設(shè)為100）；細(xì)胞膜通透性利用伊文思藍(lán)法測(cè)定，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD600的值，以此來(lái)反映細(xì)胞膜通透性變化；下同F(xiàn)ig.1 Changes of membrane permeability of tobacco suspen-sion cells under different concentrations of NaCl Different letters in the figure indicated significant differences at the P＜0.05 leve（lfor comparison，the control group was set to 100）；the permeability of cell membrane was measured by Evans blue method and the value of OD600was measured by ultraviolet spectrophotometer to reflect the change of cell membrane permeability；the same as below

2.2 不同濃度NaCl 處理下煙草懸浮細(xì)胞胞外ATP水平和胞內(nèi)ATP水平的變化

較之對(duì)照（CK），不同濃度NaCl 處理均使得eATP 水 平 有 所 下 降。在50 mmol·L-1NaCl 處 理下，eATP 水平有輕微下降，但較CK 無(wú)顯著性差異。在100 和200 mmol·L-1NaCl 處理下，eATP 水平較之CK 分別下降了8.9%和10.4%（見(jiàn)圖2A）。與eATP 水 平 變 化 相 似，iATP 水 平 在50、100、200 mmol·L-1NaCl 處理下較CK 分別顯著降低了27%、53%和55%（P＜0.05）；但在100和200 mmol·L-1NaCl 處理下，iATP 水平?jīng)]有顯著性差異（見(jiàn)圖2B）。由圖3 可知，在NaCl 處理下，eATP 水平和iATP水平呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。

圖2 不同濃度NaCl處理下煙草懸浮細(xì)胞eATP相對(duì)水平變化（A）和iATP相對(duì)水平變化（B）Fig.2 Changes in relative levels of eATP（A）and iATP（B）in tobacco suspension cells under different concentrations of NaCl

圖3 不同濃度NaCl 處理下煙草懸浮細(xì)胞eATP 和iATP相對(duì)水平變化關(guān)系*表示在P＜0.05水平相關(guān)性顯著；R2越接近1，相關(guān)性越強(qiáng)；下同F(xiàn)ig.3 Relationship between relative levels of iATP and eATP in tobacco suspension cells under different concentrations of NaCl* indicated significant correlation atP＜0.05 level；The closer the R2was to 1，the stronger the correlation；The same as below

2.3 PEG脅迫下煙草懸浮細(xì)胞膜通透性的變化

利用PEG 處理煙草懸浮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，與CK 相比，50 g·L-1PEG 處理對(duì)細(xì)胞膜通透性無(wú)顯著性影響；而100 和200 g·L-1PEG 處理后，細(xì)胞膜通透性分別顯著升高至CK 的1.1 倍和1.6 倍（P＜0.05）（見(jiàn)圖4）。

圖4 不同質(zhì)量濃度的PEG 處理下煙草懸浮細(xì)胞膜通透性變化Fig.4 Changes of membrane permeability of tobacco suspension cells under different mass concentration of PEG

2.4 PEG 脅迫下煙草懸浮細(xì)胞胞外ATP 水平和胞內(nèi)ATP水平的變化

如圖5A所示，與CK相比，eATP水平在50 g·L-1PEG 處理下無(wú)顯著變化；但在100、200 g·L-1PEG處理下，eATP水平顯著增加（P＜0.05），分別增加至CK 的1.4、3.4 倍。與eATP 水平變化相反，iATP 水平隨著PEG 質(zhì)量濃度的增加而下降：與CK 相比，50 g·L-1PEG 處理后，iATP 水平未發(fā)生明顯改變，在100、200 g·L-1PEG 處理下，iATP 水平分別降低至CK 的0.7、0.5 倍（見(jiàn)圖5B）。說(shuō)明隨PEG 質(zhì)量濃度的增加，eATP 水平上升而iATP 水平逐漸降低，由圖6 發(fā)現(xiàn)，eATP 和iATP 水平呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。

圖5 不同質(zhì)量濃度的PEG 處理下煙草懸浮細(xì)胞eATP 相對(duì)水平變化（A）和iATP相對(duì)水平變化（B）Fig.5 Changes in relative levels of eATP（A）and iATP（B）in tobacco suspension cells under different mass concentration of PEG

圖6 不同質(zhì)量濃度的PEG 處理下煙草懸浮細(xì)胞eATP 和iATP相對(duì)水平變化關(guān)系Fig.6 Relationship between relative levels of iATP and eATP in tobacco suspension cells under different mass concentration of PEG

2.5 低溫脅迫下煙草懸浮細(xì)胞膜通透性的變化

低溫處理結(jié)果表明，在10、4 ℃處理下，細(xì)胞膜通透性較CK 無(wú)明顯變化，但在0 ℃時(shí)顯著增加至CK的1.2倍（P＜0.05）（見(jiàn)圖7）。

圖7 不同溫度處理下煙草懸浮細(xì)胞膜通透性的變化Fig.7 Changes of membrane permeability of tobacco suspension cells under different temperature treatments

2.6 低溫脅迫下煙草懸浮細(xì)胞胞外ATP 水平和胞內(nèi)ATP水平的變化

如圖8A所示，eATP水平隨溫度降低而顯著下降（P＜0.05），且均低于CK。在10、4、0 ℃處理下，eATP 水平分別降低至CK 的0.8、0.8、0.9 倍。隨著溫度的降低，iATP 水平有所增加，與CK 相比，在10、4、0 ℃處理下，iATP水平分別增加至CK的1.3、1.8、1.9 倍（見(jiàn)圖8B）。由圖9 可見(jiàn)，兩者之間線性相關(guān)性不顯著。

圖8 不同溫度處理下煙草懸浮細(xì)胞eATP 相對(duì)水平變化（A）和iATP相對(duì)水平變化（B）Fig.8 Changes in relative levels of eATP（A）and iATP（B）in tobacco suspension cells under different temperature treatments

圖9 不同溫度處理下煙草懸浮細(xì)胞eATP 和iATP 相對(duì)水平變化關(guān)系Fig.9 Relationship between relative levels of iATP and eATP in tobacco suspension cells under different temperature treatments

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下，細(xì)胞膜的通透性隨著NaCl 處理濃度的增加顯著升高（見(jiàn)圖1），但iATP 和eATP 水平則逐漸下降，并且iATP 和eATP水平變化呈顯著正相關(guān)（見(jiàn)圖2～3）。大量研究表明NaCl脅迫會(huì)造成細(xì)胞呼吸紊亂，對(duì)氧化磷酸化、線粒體電子傳遞等能量代謝相關(guān)途徑產(chǎn)生抑制［18-21］。由于煙草懸浮細(xì)胞缺乏葉綠體，因此煙草懸浮細(xì)胞的iATP 主要由呼吸作用通過(guò)氧化磷酸化產(chǎn)生。又因?yàn)槟壳吧袩o(wú)關(guān)于ATP 合酶在植物細(xì)胞膜上存在的報(bào)道，因此，煙草懸浮細(xì)胞中氧化磷酸化產(chǎn)生的iATP 是eATP 的主要來(lái)源［2，6］。據(jù)此，我們猜測(cè)，鹽脅迫可通過(guò)抑制呼吸作用降低iATP的水平［22］，并可能由此也降低了eATP 的水平。此外，如上文所述，ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是植物eATP 釋放的重要通道。Shen 等［23］研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下，高粱（Sorghum bicolor）根中ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族大部分成員的轉(zhuǎn)錄受到抑制。因此，NaCl 也有可能通過(guò)抑制ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)而降低了eATP 的水平。

本研究利用PEG 對(duì)煙草懸浮細(xì)胞進(jìn)行水分脅迫處理，發(fā)現(xiàn)隨PEG 質(zhì)量濃度的升高，煙草懸浮細(xì)胞膜的通透性呈不同程度的增加，且iATP 水平下降（見(jiàn)圖4，圖5B），這與NaCl脅迫下細(xì)胞膜的通透性和iATP 水平的變化相似。前人的研究發(fā)現(xiàn)，水分脅迫也能夠抑制植物的呼吸作用［24］；因此，在PEG 脅迫下也可能是通過(guò)抑制呼吸作用而降低了iATP 的水平。但和NaCl 脅迫不同的是，eATP 水平在PEG 脅迫下逐漸上升，和iATP 水平呈顯著負(fù)相關(guān)（見(jiàn)圖5A，圖6）。這表明在PEG 脅迫下iATP的水平并不是eATP 水平的決定性因素。研究發(fā)現(xiàn)，在水分脅迫下，部分ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)量會(huì)上升［25］。因此，盡管水分脅迫降低了eATP 的來(lái)源量（即iATP 的水平），但可能通過(guò)激活部分ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白而增加了eATP的釋放水平。

在低溫處理后，細(xì)胞膜通透性隨溫度降低而逐漸升高（見(jiàn)圖7），iATP 水平隨溫度的降低有不同程度的增加（見(jiàn)圖8B）。Turk 等［26］研究發(fā)現(xiàn)，低溫刺激了玉米（Zea mays）葉片的呼吸作用以及呼吸相關(guān)編碼基因的表達(dá)。因此，低溫下iATP 水平上升同樣可能和呼吸作用上升有關(guān)。和低溫下iATP 水平的變化不同，低溫降低了煙草懸浮細(xì)胞eATP 水平（見(jiàn)圖8A）。有研究表明，在低溫條件下，水稻（Oryza sativa）中ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因中的部分基因表達(dá)下調(diào)［25］。此外，作為eATP 的另一重要運(yùn)輸方式，囊泡運(yùn)輸?shù)乃俣缺话l(fā)現(xiàn)受到低溫抑制［27］。因此，盡管eATP的來(lái)源（即iATP）在低溫下均上升，但低溫有可能通過(guò)抑制部分ABC 通道蛋白的表達(dá)或是細(xì)胞的囊泡運(yùn)輸而使eATP 水平下降。

綜上，細(xì)胞內(nèi)ATP 和細(xì)胞外ATP 水平在鹽脅迫、水分脅迫以及低溫脅迫等不同類型的非生物性脅迫下呈現(xiàn)出不同的變化規(guī)律。植物呼吸作用可決定植物iATP 的水平，因而呼吸作用在鹽和水分脅迫下的下降及其在低溫下的上升應(yīng)是iATP水平產(chǎn)生不同變化規(guī)律的重要原因。盡管植物iATP 是eATP 來(lái)源，但在不同類型的非生物脅迫下，植物細(xì)胞iATP 看上去并不是影響eATP 水平變化的決定性因素；鹽脅迫和低溫脅迫可能通過(guò)抑制eATP 的運(yùn)輸方式（如降低ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)或囊泡運(yùn)輸速度）而降低了eATP 的水平；水分脅迫則可能通過(guò)提升eATP 的運(yùn)輸方式（如提高ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)）而增加了eATP 的水平。但其具體的分子機(jī)制有待進(jìn)一步深入探究。